蛋白质泛素化研究进展—探索蛋白修饰的秘密

蛋白质泛素化研究进展——探索蛋白修饰的秘密

泛素是一种含76个氨基酸的多肽，存在于除细菌外的许多不同组织和器官中，具有标记待降解蛋白质的功能。被泛素标记的蛋白质在蛋白酶体中被降解。由泛素控制的蛋白质降解具有重要的生理意义，它不仅能够清除错误的蛋白质，还对细胞周期调控、DNA修复、细胞生长、免疫功能等都有重要的调控作用。

2004年，以色列科学家Aaron Ciechanover、Avram Hershko和美国科学家Irwin Rose就因发现泛素调节的蛋白质降解而被授予2004年诺贝尔化学奖。正是因为泛素调节的蛋白质降解在生物体中如此重要，因而对它的开创性研究也就具有了特殊意义。目前，在世界各地的很多实验室中，科学家不断发现和研究与这一降解过程相关的细胞新功能。现在，研究人员已发现泛素具有多种非蛋白水解功能，包括参与囊泡转运通路、调控组蛋白修饰以及参与病毒的出芽过程等。

鉴于蛋白质降解异常与许多疾病，例如癌症、神经退行性病变以及免疫功能紊乱的发生密切相关，而基因的功能是通过蛋白质的表达实现的，因此，泛素在蛋白质降解中的作用机制如能被阐明将对解释多种疾病的发生机制和遗传信息的调控表达有重要意义。 《生命奥秘》本月专题将介绍泛素系统的来源、研究进展，并重点介绍以“泛素-蛋白酶”为靶位的抗癌疗法，希望能给相关领域的研究人员带来崭新的思路。

一、泛素样蛋白的来源及功能

1. 泛素样蛋白及其相关蛋白结构域 2. 泛素样蛋白连接后的结果 3. 泛素样蛋白修饰途径的起源 4. 前景展望

二、泛素化途径与人体免疫系统调节

1. 泛素修饰途径与NF-κB信号通路的关系 2. 泛素蛋白在天然免疫中的作用

3. 泛素化修饰途径在获得性免疫机制中的作用

4. 泛素修饰系统在自身免疫机制中的作用 5. 研究展望

三、针对泛素修饰系统的肿瘤治疗方案

1. 泛素连接系统是致癌信号通路的重要治疗靶标 2. 针对泛素连接酶的治疗方法

3. E3连接酶与肿瘤血管形成之间的关系 4. 针对抗凋亡蛋白

5. 去泛素化酶在肿瘤进展中的作用 6. 针对肿瘤细胞的蛋白酶体

7. 非降解途径的泛素化修饰作用与肿瘤发生之间的关系 8. 干扰泛素蛋白识别过程

9. SUMO修饰过程与癌症的关系 10. 未来还将面临的挑战 四、扩展阅读

一种新型抗癌药物——NEDD8活化酶抑制剂 五、其它

1. 内体ESCRT装置能分选泛素化修饰的膜蛋白 2. 内质网的泛素化机制

3. DNA修复过程中的泛素以及SUMO修饰机制

下一期预告：生物信息学在癌症研究中的应用

癌症是一种由遗传和表观遗传改变而引起的疾病。随着各种“组学”技术的进展，癌症的研究正在经历一场革命。后基因组学时代的生物技术进展使分子生物学家得以较为精细地研究DNA（基因组学）、mRNA（转录组学）和蛋白质（蛋白质组学），试图在完整背景下描述癌症的技术革新为研究者获得更多有用的资料，并在新途径下去研究及整合提供了机遇。虽然存在一定的实际困难，但很多的

方案正在开发中，目的是整合关于实例的信息、方案和其它不同来源的资料，以鉴定出重要的趋势和方法，最终找到治疗或诊断癌症的新途径。下一期《生命奥秘》将讨论癌症治疗方法的革命，重点放在生物信息学方面，并进一步讨论如何分析各种组学信息，和它们的应用如何改变了癌症的治疗方法。

一、泛素样蛋白的来源及功能 2010-09-21

真核生物蛋白可以通过与各种小分子物质或蛋白质相结合的方式被修饰。在众多的修饰方式当中有一种就是与泛素蛋白或泛素样蛋白（UBL）相结合，采用这种修饰方法可以对多种生理过程进行调控。UBL蛋白可以控制被修饰蛋白与其它生物大分子（比如蛋白酶体或染色质）间的相互作用。各种UBL系统都会使用相应的酶来催化修饰反应，不过这些修饰反应中大部分都是暂时的。有越来越多的证据表明这种UBL修饰途径来自原核生物的硫转移酶系统（sulphurtransferase system）及相关酶类。而且，在真核生物的共同祖先中，类似于UBL连接酶和UBL去连接酶的蛋白也是广泛存在的，这些证据都说明UBL修饰系统不是起源于真核生物。

真核细胞内的蛋白都会经历各种翻译后修饰，这些修饰过程极大地扩展了蛋白的功能多样性和动力学多样性。蛋白可以通过与磷酸基团、甲基化基团、乙酰基团或某些蛋白质基团（通常这种连接方式都是短暂的）相连接的方式被修饰。而泛素蛋白修饰方式就是上述与蛋白质相连的修饰方式中第一个被发现的。现在，我们已经对这种修饰途径研究得非常透彻了。泛素蛋白是一小分子蛋白，它在真核生物界非常保守，但是在真细菌界（Eubacteria）和古细菌界（Archaea）都不存在。泛素蛋白还可以与上千种不同的蛋白结合。 泛素化过程是一个复杂的过程（背景知识框1）。UBL修饰途径也与泛素化修饰途径类似。参与UBL修饰途径的酶虽然各不相同，但在进化上都与参与泛素化途径的酶具有相关性。由于泛素蛋白与UBL蛋白具有相同的三维核心结构——β-抓握折叠（β-grasp fold）结构——这说明各种不同的UBL修饰系统都源自一个共同的祖先。

背景知识框1：泛素蛋白连接机制

泛素蛋白（图中绿色圆圈所示）是由76个氨基酸残基组成的多肽，它可以被一系列的酶促反应活化，进而与底物靶蛋白相连接（如图中箭头所示）。UBL修饰系统采用的也是类似途径。

有三种酶——E1、E2和E3——参与了泛素修饰反应，这包括多泛素蛋白合成反应，即在一个泛素蛋白的基础之上再添加好几个泛素

蛋白（如图中括号所示）。

E1酶负责活化泛素蛋白、E2酶通过转硫醇作用从E1酶处获得泛素蛋白，并将其与底物蛋白相结合，然后E3酶将泛素蛋白与底物连接（在某些情况下会先形成一种硫酯中间产物，然后再与底物结合）。所有真核生物编码的E2和E3同工酶种类非常多，其中E2同工酶有几十种，而E3同工酶则多达数百种。这样，细胞就能对多种蛋白进行各种方式、特异性的修饰和调节，而且这些修饰调控作用也都会受到严密的时空调控。

泛素蛋白的C末端通常都经由酰胺键（amide linkage）与靶蛋白的氨基团连接在一起。最常见的连接是与靶蛋白赖氨酸的ε氨基团相连，不过也可以与靶蛋白的N末端相连。此外，最近还发现泛素蛋白可以与靶蛋白上的半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸相连。在多泛素链中，一个泛素蛋白分子的赖氨酸侧链与另一个泛素蛋白的C末端相连，如此反复形成多泛素链。泛素蛋白含有7个赖氨酸残基，所有这些赖氨酸残基都可以参与上述多泛素链的合成过程。

泛素蛋白的C末端含有甘氨酸残基，在泛素蛋白与其它蛋白相连之前，该残基必须被活化。最初，C末端被E1酶腺苷酰化，随后E1酶的半胱氨酸侧链攻击泛素蛋白的C末端，形成E1-泛素蛋白硫酯中间产物。然后被活化的泛素蛋白被“移交”给E2酶活性位点中的半胱氨酸残基，再在E3酶的共同作用下，催化靶蛋白泛素化反应。E3酶在识别靶蛋白底物的过程中起到了关键性作用（不过有些UBL途径不需要E3酶的参与）。在泛素化修饰途径中，还有一些不同的E3酶可以催化泛素蛋白与被单泛素化修饰或多泛素化修饰的靶蛋白相连接。这些E3酶有时也被称为E4酶（尤其是在延伸多泛素侧链时）。去泛素化酶（DUB）可以将靶蛋白上的泛素蛋白水解下来，由于DUB酶的存在，泛素化作用只能是暂时的。

这种由泛素蛋白和其它UBL蛋白负责的动态修饰过程构成了一个可逆的“开关”，来控制底物蛋白的不同功能状态，调控细胞内的多种生理活动过程。

泛素蛋白于1975年被首次发现。之后的10年间，我们对泛素修饰系统的进化前体分子（evolutionary precursors）进行了深入的研究。泛素蛋白被认为是真核生物蛋白中最保守的蛋白之一，但直到最近都还没有很好的、足够灵敏的序列比对方法在细菌蛋白质中发现序列相似的蛋白质。不过，近两年技术方法的快速发展彻底改变了这种情况。首先，序列比对方法变得更为先进了，因而发现了许多泛素蛋白以及泛素修饰系统参与蛋白之间的相似之处，也发现了很多细菌蛋白之间的相似之处；其次，结构测定研究发现，在很多原核蛋白、真核蛋白中都有泛素样折叠结构，不过这些蛋白之间在序列上的相似性很低；第三，在对次级代谢产物和酶辅因子，比如原核生物里的硫胺素（thiamine），即维生素B1等的机理分析中发现了UBL蛋白的激活与连接机制。

这些研究进展说明，泛素系统是由各种早就在原核生物里存在的、经历了多样化改变的组成元件和反应体系进化而来的。

在泛素修饰过程中存在的多样性非常奇特，修饰的结果取决于泛素蛋白是以单体形式还是多聚体形式与靶蛋白相连接（图1）。各种不同的泛素蛋白间的连接形式决定了被修饰蛋白的命运。当靶蛋白被多泛素化途径修饰之后会与26S蛋白酶体这种多亚基蛋白酶复合物结合，然后被降解，靶蛋白降解后泛素蛋白会被循环利用。细胞利用这种途径降解那些“多余的”蛋白质，以保证细胞周期的正常进行，保证转录调节、蛋白质含量、信号转导甚至昼夜节律等的正确性。泛素化修饰也有非降解作用，比如介导膜蛋白内吞作用和蛋白质胞内运输作用、参与染色质介导的转录调节作用、DNA修复作用以及信号复合体合成等等。泛素化途径与细胞内这么多的功能都有关系，这就不难解释为什么我们会发现越来越多的疾病都与泛素化途径失调有关了。这些疾病包括癌症、Angelman综合征等严重智力障碍疾病，帕金森氏病、阿尔茨海默病和亨廷顿氏病等神经变性性疾病以及II型糖尿病等等。

1. 泛素样蛋白及其相关蛋白结构域

对UBL蛋白及其相关蛋白结构域的研究缘起于上世纪80年代末。当时发现了一种干扰素诱导的、分子量为15KDa的蛋白产物——ISG15。该蛋白在序列上与泛素蛋白有高度的相似性——可以通过共价结合的方式修饰其它蛋白。后来发现ISG15蛋白是表1中所列举的一系列UBL蛋白中第一个被发现的UBL蛋白。尽管如此，直到目前为止我们对它的功能还是知之甚少，至今才发现了ISG15蛋白的E1酶（即ISG15活化酶）和E2酶（即ISG15连接酶）（背景知识框1）。这些酶与ISG15蛋白一样，也都是被I型干扰素诱导表达的。我们用小鼠模型研究发现，蛋白经ISG15蛋白修饰之后，可以表现出抗病毒作用，这也符合ISG15蛋白通过I型干扰素诱导表达的特性。I型干扰素是机体先天免疫系统对病毒作出反应而产生的活性蛋白。

与泛素蛋白一样，9种UBL蛋白都是通过共价连接的方式连接到靶生物大分子（大部分是蛋白）上从而对其进行修饰的。表1列出了UBL修饰系统常见的靶蛋白（不过该表并不完整）。泛素系统可以对酵母细胞中超过1000多种的不同蛋白质进行修饰，有一些UBL修饰途径，比如SUMO（小类泛素修饰因子）修饰途径的靶蛋白非常多，而且靶蛋白之间差异非常大。而另一些UBL修饰途径的靶蛋白范围则非常有限，比如UBL蛋白酵母蛋白Atg12似乎只有一个靶蛋白Atg5，Atg8蛋白只与一种特殊的磷脂——磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine）相结合。

本表中列举的UBL蛋白都来自酿酒酵母（如果酿酒酵母中有这些蛋白）和脊椎动物（如果酿酒酵母中没有这些蛋白）。如果在酿酒酵母中和脊椎动物中皆存在，则在酿酒酵母UBL蛋白后的括号中显示脊椎动物UBL蛋白。对于E1酶和E2酶，如果酿酒酵母中有这些蛋

白则显示酿酒酵母中酶。UBA6蛋白要比Uba1蛋白的种系分布范围窄的多。

ND：经由标准的BLAST程序没能发现相似性；NI：没有发现；?表示两个结构域各自的相似度。

正如前面提及的那样，大部分的UBL修饰途径使用的酶都是类似的。UBL蛋白连接的主要途径似乎源自一个古老的生物合成途径（我们将会在下文中对该途径进行介绍）。该途径中的酶和蛋白质修饰因子经过了好几轮扩增和多样化改变才变成了今天丰富多彩的UBL修饰途径。不过在几条特殊的UBL修饰途径中还是存在几种例外的UBL连接机制。比如有一种泛素蛋白水解酶，它不仅能够将泛素蛋白从底物蛋白上裂解下来，也能起到完全相反的作用，将泛素蛋白连接到靶蛋白上。还有一些UBL连接酶来自纤毛虫（ciliates）。我们通过序列分析在纤毛虫中发现了一类具有自我剪接功能的多聚蛋白，它们形成了一系列种类各不相同的UBL结构域以及具有自我剪接功能的细菌内蛋白样（BIL）结构域。这些多聚蛋白的编码基因可能起源于一个编码多聚蛋白的基因，然后在进化过程中又获得了编码BIL结构域的基因。

BIL结构域的N末端具有一个丝氨酸或半胱氨酸残基，这些氨基酸残基可以激活肽键重排机制（peptide-bond rearrangement），通过该机制将BIL结构域上游末端氨基酸肽酰基链（peptide acyl chain）的N转变成O（在N末端是丝氨酸时）或转变成S（在N末端是半胱氨酸时）。这种重排机制起始于裂解和自我间接反应。在BIL-泛素蛋白样蛋白（BUBL）中的BIL结构域内开始N→S酰基转换，该转换过程可能促进了自身催化进程中对底物硫酯（thioester）的亲核攻击（nucleophilic attack）作用，从而将上游UBL蛋白连接到被修饰靶分子上。如果攻击基团是靶蛋白质的赖氨酸侧链，就会得到按照背景知识框1中介绍的那种标准方式进行连接的修饰产物，不过反应过程中没有E1、E2或ATP的参与。值得注意的是，在BUBL前体蛋白BIL结构域上游的序列不是UBL蛋白必需的。因此，可能会有很多蛋白修饰因子，它们并不与泛素蛋白相关，但是可能在结构域的上游起到与BIL结构域相类似的作用。

还有很多其它相关的泛素蛋白，这些蛋白中的泛素样结构域（ubiquitin-like domain, ULD）属于多肽的一部分，但通常它们既不参与任何反应，也不会与靶蛋白发生共价结合。这种ULD结构域赋予所属蛋白（与可转移UBL类似的蛋白）与某些特殊靶蛋白相结合的能力。有一些ULD结构域可以在特定条件下从所属蛋白中被裂解下来，裂解之后甚至还可以与其它蛋白相连接。比如在细胞经历紫外线伤害后发生的去泛素化酶（deubiquitylating enzyme）USP1内部ULD结构域的自我裂解作用（autocleavage）。这种裂解作用发生后酶就会被灭活，导致细胞内单泛素化修饰的PCNA蛋白大量积聚，而这些PCNA蛋白正是细胞进行DNA修复所需要的。

3. 泛素样蛋白修饰途径的起源

我们最早获悉的有关UBL连接酶起源的信息来自酵母泛素蛋白活化酶E1的氨基酸序列。研究发现E1蛋白与MoeB这种负责合成钼辅因子（Moco）的大肠杆菌蛋白具有少许序列相似性。但是在1991年，E1蛋白的序列刚刚被弄清楚时，我们还不知道MoeB蛋白的生化功能。直到上世纪90年代末，我们才逐渐了解这种钼辅因子合成酶以及硫胺素合成酶的氨基酸序列和生化功能信息。令人吃惊的是，该途径与泛素蛋白活化途径具有相似之处。这是由于硫胺素合成途径几乎存在于所有的细菌当中，而钼辅因子合成途径也存在于大部分的细菌当中，我们认为这些酶系统在进化等级上要比泛素蛋白连接酶高出很多。

3.1 UBL相关硫载体蛋白

要合成钼辅因子和硫胺素分子，就必须在它们的前体物质中加入硫元素，这就需要一种小分子硫载体蛋白的帮助。在钼辅因子合成途径中发挥作用的是MoaD蛋白，而在硫胺素合成途径中发挥作用的却是ThiS蛋白。如图4所示，硫元素是从这些硫载体蛋白C末端的硫代羧酸基团（thiocarboxylate group）上释放出来的。MoaD蛋白和ThiS蛋白都与泛素蛋白一样，在序列的C末端携带一对甘氨酸残基。这些蛋白的C末端在E1样酶（在MoaD蛋白途径中发挥作用的是MoeB蛋白；在ThiS蛋白途径中发挥作用的是ThiF蛋白）的腺苷酰化作用之后，就可以将这些蛋白C末端的甘氨酸羧酸基团转变成硫代羧酸基团。与泛素蛋白一样，MoaD蛋白和ThiS蛋白也都有一个β-grasp fold结构，不过这两种蛋白在氨基酸序列上与泛素蛋白的相似性都不高。因此，泛素蛋白、MoaD蛋白和ThiS蛋白都只是结构相似，它们的C末端都可以经E1样酶的腺苷酰化作用而被激活。早在2000年左右，我们就根据新发现的泛素蛋白相关修饰因子1（ubiquitin-related modifier 1, Urm1）的相关信息，对硫输送系统（sulphur-transfer system）与UBL活化系统之间的进化学亲缘关系进行了深入研究。Urm1蛋白最初是在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中被发现的，它与MoaD蛋白和ThiS蛋白有关（图4右侧部分）。虽然酿酒酵母缺乏与钼相关的酶系统，而且它还采用了一种与细菌完全不同的途径来合成硫胺素，但它还是表达了E1样酶——Uba4蛋白。该蛋白在序列上与ThiF蛋白和MoeB蛋白具有相似性。Uba4蛋白能与Urm1蛋白相结合，促使Urm1蛋白与其它细胞蛋白发生共价结合。这些研究成果表明Urm1蛋白与Uba4蛋白可能都是UBL蛋白连接系统的一部分（如果从序列相似程度考虑，它们与细菌的硫输送系统会更为相近）。不过正如我们下面将要讨论到的那样，Uba4蛋白也在硫输送系统中发挥了作用，因此，它可能是一种双功酶。鉴于此，Urm1-Uba4系统有可能是一种“分子化石”，它保留了远古硫输送系统的特征，同时又具有UBL连接酶的活性。

3.2 另一种可能的双功酶——Urm1蛋白

E1样酶在ATP的帮助下活化UBL蛋白C末端的过程与其它腺苷酰化作用过程，比如氨酰tRNA连接酶（aminoacyl-tRNA synthetases）

活化氨基酸的过程非常类似。对UBL蛋白来说，ATP水解提供的能量被转移到E1-UBL硫酯键（thioester linkage）中去了。不过在被化学活化之后，表1中所列举的所有已知的UBL蛋白（除了Urm1蛋白之外）同时也都会继续发生酯基转移作用

（transesterification），将能量再转移到E2酶的硫酯键上。唯一例外的是，Urm1蛋白途径没有使用E1-E2酶系统，而是使用了细菌硫输送系统。Uba4蛋白（即Urm1蛋白途径中的E1酶）含有一个硫氰酸生成酶同源结构域（rhodanese-homology domain，RHD）。这一点与其它UBL系统中的E1酶不同（图4）。硫氰酸生成酶和其它几个含有RHD结构域的蛋白都是硫转移酶，它们通过S-S-H中间体的形式将其活性半胱氨酸位点上的硫转移到靶蛋白上。很多MoeB家族蛋白都含有与Uba4蛋白类似的结构，即有一个E1样结构域及与之相应的C末端，还有一个RHD结构域。根据上述以及其它研究结果，我们认为在MoaD蛋白形成的硫代羧酸产物会在MoeB蛋白相关酶（MoeB-related enzyme）的RHD结构域作用下继续形成酰基二硫化物中间体（acyl disulphide intermediate）。由此类推，Urm1-Uba4系统也会用到Uba4蛋白的RHD结构域。Uba4蛋白的RHD结构域会与Urm1蛋白形成暂时的硫酯中间产物，然后再将硫酯键转移至底物，因此在反应过程中并不需要E2酶的参与（图4）。在酿酒酵母中，该Urm1蛋白与靶蛋白的连接过程需要RHD结构域中的半胱氨酸残基参与。

2008年，Jennifer Schmitz等人开展的一项工作发现，Uba4蛋白的RHD结构域也能形成过硫化物，并在体外反应中将其末端的硫转移至Urm1蛋白的C末端，形成Urm1蛋白硫代羧酸产物。E1结构域中的半胱氨酸残基并不是该反应所必需的，Jennifer Schmitz等人

也没有发现Urm1-Uba4硫酯产物。Jennifer Schmitz等人认为，经腺苷酰化作用的Urm1蛋白受到RHD结构域中过硫化物的攻击，会形成酰基二硫化物中间产物，然后再释放出硫代羧酸产物。他们认为这就是Urm1蛋白与靶蛋白连接的作用机制。

最近我们还发现了Urm1蛋白途径的一种新功能，即在某些反义tRNA分子的摆动尿嘧啶（wobble uridine）2号位的O被替换成了S。该途径能控制译码的特异性。Urm1蛋白参与了该反应，可能起到了硫转运的功能。tRNA分子被Urm1途径修饰的程度是否决定了Urm1途径的功能还需要我们进一步研究。Urm1蛋白对靶蛋白的修饰作用也能够让tRNA分子被硫醇化，可能的途径是通过形成能够释放出Urm1硫代羧酸产物的Urm1-Uba4酰基二硫化物，然后将硫转移到tRNA。

虽然Uba4蛋白保守的E1结构域中的半胱氨酸残基在体外Urm1硫代羧酸产物形成的过程中不是必需的，但在体内Urm1蛋白连接的过程中却是必不可少的。该半胱氨酸残基在Urm1-RHD连接产物（该产物是Urm1蛋白C末端硫代羧酸产物而不是Urm1蛋白与靶蛋白之间的连接产物）的还原裂解反应中发挥作用。可能是E1样酶的半胱氨酸残基与RHD结构域间进行过硫化物交换，释放出RHD巯基，攻击Urm1蛋白-腺嘌呤核苷酸（Urm1-adenylate）；又或者是Urm1蛋白-腺嘌呤核苷酸直接被底物的赖氨酸残基攻击，不过该机制无法解释为什么需要两个Uba4蛋白活性位点中的半胱氨酸残基。Urm1-RHD二硫化物的还原裂解反应是被E1结构域活性位点的巯基基团催化完成的，该反应能使RHD巯基再生，能够再次参与形成Urm1硫酯化合物。我们还不清楚这种Urm1蛋白与靶蛋白间的连接机制是否能真实地反映早期前体物质及其它UBL蛋白的连接机制。不过我们相信，在UBL蛋白连接酶系统的进化历程中，出现了一种独特的E2样因子，逐渐使得E1酶丢失了RHD结构域，因此，也去除了过硫化物-硫代羧酸产物（persulphide–thiocarboxylate）形成的这一副反应。或者，真核生物UBL修饰系统可能来自另一种独特的原核β-grasp蛋白修饰系统。

3.3 E2酶的缘起与UBL特异性蛋白酶体

E2样酶源自何时，它又是在何时第一次与E1酶形成E1–E2系统用于UBL修饰途径的？早期的序列比对工作没有在细菌中发现任何与E2酶相关的蛋白，但是最近的研究工作却在同一DNA“邻居”（即在假定的操纵子中，结构域融合区域或共调控基因中）中发现了大量的E2相关序列，这些序列包括UBL相关序列、E1样序列或JAMM（JAB1/MPN/Mov34）金属蛋白酶编码序列等。在真核生物中，有特殊的JAMM蛋白酶来作为去泛素化酶或UBL特异性蛋白酶。

因此，E2蛋白似乎来自细菌，伴随着UBL蛋白和E1样酶一起发展而来。与经典的UBL系统E2酶最接近的亚群蛋白可能就是真核生物UBL系统中E2酶的祖先。虽然到目前为止还没有报道有一个这种原核生物的E2样酶能够与E1酶一起催化UBL与底物间的反应，不过根据其它研究成果，我们相信肯定会有一些原核生物的E2样酶能够催化这种反应。

DUB蛋白或ULP蛋白通常都是UBL蛋白前体物质C末端反应所必需的蛋白，它们可以将UBL蛋白从靶蛋白上裂解下来。虽然经序列分析发现有多种JAMM酶与原核细胞里的UBL修饰系统有关，不过还是有一些JAMM酶只是参与硫转运途径，而不参与UBL修饰途径。比如结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis）具有一种特殊的半胱氨酸合成途径。该途径由E1相关的MoeZ蛋白催化。途径中含有包含β-grasp结构的CysO硫代羧酸衍生物。JAMM酶编码基因与CysO编码基因成簇存在，它也许能在半胱氨酸生物合成的最后一步中将CysO中的半胱氨酸水解出来。萤光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）中合成含硫的thioquinolobactin菌属转铁蛋白（siderophore）需要一名为QbsE的硫转运蛋白参与，该蛋白与MoaD蛋白和ThiS蛋白相关。不过QbsE蛋白以在双甘氨酸基序（diglycine motif）后添加了两个氨基酸残基的前体物质形式存在。JAMM蛋白酶可以将QbsE前体蛋白中的这两个氨基酸残基水解掉。因此，真核生物用来去除UBL蛋白的蛋白酶可能就来自细菌中以β-grasp结构蛋白为基础的生物合成途径，比如UBL蛋白和E1样酶，可能E2样酶也是如此。

3.4 E1样酶对非UBL底物的活化作用

腺苷化酶（adenylating enzyme）里的E1样酶超家族蛋白除了能活化β-grasp蛋白的C末端之外，还能催化一系列的生化反应。最好的例子来自能合成并分泌小分子抗菌素C7（small antibiotic microcin C7, MccC7）的肠道细菌。MccC7是一种由大肠杆菌质粒编码的小分子7肽。MccC7多肽C末端的天冬酰胺酰类似物（isoasparaginyl）与经修饰的腺嘌呤核苷酸之间形成了氨基磷酸酯键

（phosphoramidate）。该连接反应需要同一质粒编码的mccB蛋白的参与，而mccB蛋白属于E1样酶超家族。因此，这种E1样酶蛋白的底物不是β-grasp蛋白，该酶所修饰的C末端也与前面介绍的硫转运系统不同，只不过最开始与由E1样酶催化的C末端α羧化物（α-carboxylate）的腺苷酰化作用比较类似。

4. 前景展望

将来还会发现多少种UBL蛋白修饰途径或者相似的途径？很多UBL修饰途径无法通过序列比对的方法被发现，因此可能还有很多

β-grasp蛋白或者UBL修饰因子没有被我们发现。令人兴奋的是，我们在原核生物中发现了大量UBL相关蛋白修饰系统，虽然这些系统中还没有一个系统经过试验验证。对这些系统进行序列分析发现，有大量的细菌调节子都将所有编码β-grasp蛋白、E1样蛋白、E2样蛋白以及相关水解蛋白的基因全部集中到一起。此外还发现，不是所有的E1样蛋白都能与β-grasp蛋白或UBL蛋白发生反应，因此还需要对这些酶的作用进行更深入的研究。

反过来，可能还存在一种胞内的蛋白间结合机制，该机制并不需要E1样酶和β-grasp蛋白的参与，比如内蛋白（intein）介导的蛋白反式剪接机制等。在结核分支杆菌中有一种名为Pup的原核生物泛素样蛋白，该蛋白由64个氨基酸残基组成，它可以在体内对一些特定蛋白进行修饰，使它们被结合杆菌的蛋白酶体所降解。Pup蛋白既不是β-grasp蛋白也不是UBL蛋白，它通过C末端的谷氨酰胺位点与靶蛋白的赖氨酸位点相连。Pup蛋白末端的谷氨酰胺在与底物连接时或连接之前会转变为谷氨酸。类似的酰胺连接反应也见于谷氨酰胺转移酶反应和谷光苷肽合成途径中的γ谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetases）反应。实际上，结合杆菌里的PafA蛋白与γ谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷氨酰胺合成酶在序列上相似性很低。质谱研究和蛋白质组学研究可能会给我们带来更多的信息。从蛋白质组学这个更宽广的角度来看，蛋白间的相互连接反应可以看做是细胞调控手段中运用最为普遍，功能最多样的一种方式，我们现在只是看到了冰山一角而已。

原文检索：

Mark Hochstrasser. (2009) Origin and function of ubiquitin-like proteins. Nature, 458:422-429. YORK/编译

二、泛素化途径与人体免疫系统调节

蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中也起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。因此，泛素化修饰作用也在人体免疫系统的发育以及免疫反应的各个阶段，比如免疫反应的起始、发展和结束等过程中发挥了重要作用。最近的研究结果显示，有好几种泛素连接酶都参与了防止免疫系统攻击自体组织的过程。这些泛素连接酶的功能失调都与自身免疫性疾病有关。

一个安全、有效的机体免疫系统应该是能够在有效的清除或限制各种入侵机体的病原微生物的同时又不会对自身组织发动攻击。要达到这一目标就必须对免疫系统进行非常精细的调控。作为生物体内非常重要的一种调控手段——泛素化修饰途径，毫无疑问地也在免疫系统调控过程中起到了重要作用。早期对这一课题的研究主要都集中在NF-κB途径上。最近几年的研究发现，泛素化修饰途径能够通过好几条信号通路激活NF-κB途径，它在NF-κB激活过程中起到了调控中枢的作用。NF-κB途径在先天免疫和获得性免疫中都起到了关键性作用，因此我们也开始逐渐认识到泛素化修饰途径对于免疫系统的调控作用。

泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7个赖氨酸残基，因此它们之间也可以通过这些位点互相连接，形成多泛素蛋白链（polyubiquitin chain）。目前研究显示，如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解；如果与被修饰蛋白上其它位点，比如第63位赖氨酸残基相连，则靶蛋白可以发挥信号通路功能而不会被降解。此外，还有一些蛋白质，比如组蛋白H2A和H2B等经单泛素蛋白修饰后也可以发挥调控作用而不会被降解。

与磷酸化修饰途径一样，泛素化修饰途径也是可逆的，即可以通过去泛素化酶（DUB）将泛素蛋白修饰物去除掉，这种可逆的修饰途径就非常适合作为免疫系统的调控机制。靶蛋白经泛素化途径修饰之后，连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体可以被各种泛素蛋白结合结构域（UBD）所识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90种DUB酶和20种UBD，这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它可以分为两大类，即含有HECT结构域的E3酶和其它含有RING结构域或RING样结构域（比如U-box或PHD结构域）的E3酶。这两种E3酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。

本文将主要介绍泛素修饰系统在NF-κB途径中的调控作用，还将向读者介绍最近泛素修饰系统在先天免疫及获得性免疫中的相关研究进展。在文章最后，还将介绍几种能阻止自身免疫性疾病发生的泛素连接酶。由于文章篇幅所限，我们没有在本文中详细介绍泛素修

饰途径在抗原呈递（antigen presentation）过程中的作用、病原体“绑架”（hijacking）泛素修饰途径以及逃避机体免疫系统的机制。读者可以参阅相关综述，了解更多上述两个方面的信息。

1. 泛素修饰途径与NF-κB信号通路的关系

NF-κB信号通路发现至今已经20年了。该通路参与了许多生理过程，比如炎症反应、免疫反应以及细胞存活等等。NF-κB信号通路也是我们研究细胞信号通路非常好的一个模型，因为它的活性是受到非常精细的调控的。虽然NF-κB信号通路广泛存在，但是在大部分细胞中它都处于失活状态，这是因为NF-κB信号通路被IκB家族蛋白“禁锢”在胞质中，抑制了其活性。在包括来自微生物等的各种刺激因子的作用之下，IκB家族蛋白会迅速经由泛素蛋白酶体途径被降解，令NF-κB得以进入核内，激活一系列基因的转录。 NF-κB家族由5种蛋白组成，它们分别是p65（REL-A）、c-REL、REL-B、p50和p52。这5种蛋白都含有REL同源结构域（REL-homology domain, RHD）。有了它，这些蛋白就可以发挥与DNA分子相结合、形成二聚体、入核、与IκB蛋白结合等各种功能了。此外，p65（REL-A）、c-REL和REL-B蛋白都含有一反式激活结构域（transactivation domain, TAD）。该结构域在基因激活过程中可以起到关键作用。p50和p52蛋白分别由其前体蛋白p105和p100降解而来，它们必须与含有TAD结构域的其它蛋白形成二聚体才能行使转录激活的作用。p105和p100蛋白都含有C末端锚蛋白重复序列（ankyrin repeats），IκB-α、IκB-β、IκB-ε等IκB家族蛋白也含有该重复序列。锚蛋白重复序列可以与NF-κB蛋白的RHD结构域相结合，遮盖其核定位信号，使其滞留在胞质中。

1.1 IκB蛋白降解与NF-κB前体蛋白处理过程

NF-κB蛋白活化过程可以大致分为两种情况，即经典活化途径与非经典活化途径。在被大多数细胞所采用的经典活化途径里，细胞在刺激信号的作用之下，IκB蛋白会在IκB激酶复合体（IκB kinase, IKK）的作用之下快速发生磷酸化修饰。IKK含有两个催化亚单位——IKK-α和IKK-β，以及一个调节亚单位IKK-γ，也被称为NEMO亚单位（图1）。IκB蛋白磷酸化修饰之后会经由含有F-box结构域的蛋白βTrCP被招募至泛素连接酶复合体当中。βTrCP蛋白含有WD40重复结构域（WD40-repeat domain），它可以特异性地与IκB蛋白N末端两个被磷酸化修饰的丝氨酸位点相结合。βTrCP蛋白通过F-box结构域与SKP1蛋白相结合，而SKP1蛋白参与了E3泛素连接酶复合体SCF的集合组装过程。该SCF复合体还含有CUL1蛋白和ROC1蛋白（也被称为Rbx1蛋白）。ROC1蛋白含有的RING结构域可以招募E2泛素结合酶，使已被磷酸化修饰的IκB蛋白发生多泛素化修饰。这种被泛素化修饰后的IκB蛋白虽然仍然与NF-κB蛋白结合在一起，但是很快就会被26S蛋白酶体降解掉，从而“释放” NF-κB蛋白。

NF-κB蛋白的非经典活化途径主要发生在B细胞当中。整个过程主要包括将NF-κB蛋白的前体蛋白p100处理成成熟的p52亚单位。刺激肿瘤坏死因子受体（tumour necrosis factor receptor, TNFR）超家族的部分蛋白，比如CD40蛋白和BAFF受体，会激活蛋白激酶NIK，然后NIK蛋白使IKK-α蛋白磷酸化并激活。继而活化的IKK-α蛋白催化p100前体蛋白C末端的两个丝氨酸位点磷酸化，经磷酸化修饰的p100蛋白就可以被SCF-βTrCP E3复合体识别了。不过p100蛋白经多泛素化途径修饰后并不会被蛋白酶体完全降解，蛋白酶体只会降解其含有锚蛋白重复序列的C末端，而不会影响含有RHD结构域的N末端（即p52亚单位）。这样，p52蛋白就可以与REL-B结合形成二聚体，促使能够使B细胞成熟及活化的目的基因表达。这种泛素—蛋白酶体途径同样也在将p105前体蛋白处理成为p50蛋白的过程中发挥了作用。虽然有报道称佛波酯（phorbol ester）等物质能够增强p105前体蛋白的成熟过程，但这种泛素—蛋白酶体处理方式仍然是一种起决定性作用的、稳定的组成型处理方式。

1.2 泛素介导的蛋白激酶活化过程

IκB蛋白的磷酸化过程以及IKK蛋白介导的p100蛋白的磷酸化过程都只是后续泛素化修饰过程以及蛋白酶体降解或处理过程所需要的一个先决条件。因此我们有必要了解一下IKK蛋白是如何受到其上游信号因子调控的。令人惊奇的是，泛素化修饰过程居然也在IKK蛋白的活化过程中起到了主要作用，不过此时泛素化修饰过程并没有与蛋白酶体降解过程相偶联。我们之所以发现这一点（泛素化修饰途径对IKK蛋白的活化作用）是因为在逐步寻找IκB激酶的生化试验中发现了一些蛛丝马迹。在体外试验中我们发现，IκB激酶经多泛素蛋白修饰后，其激酶活性会大为升高，而且这是在没有蛋白酶体存在的情况下或是在存在蛋白酶体抑制剂的情况下得到的实验结果。

后来，我们又通过对TRAF6蛋白的生化研究对泛素介导的IKK蛋白激活途径有了更进一步的了解。TRAF6蛋白也含有RING结构域，可以借此通过白介素1（interleukin-1, IL-1）和TOLL样受体（Toll-like receptors, TLRs）激活IKK蛋白（图1）。TRAF6蛋白就是一种E3连接酶，它与由UBC13蛋白和UEV1A蛋白组成的E2结合酶复合体一起催化泛素蛋白之间通过第63位赖氨酸位点形成多泛素蛋白聚合体。这种多泛素蛋白可以激活由TAK1、TAB1、TAB2（或TAB3）蛋白组成的蛋白激酶复合体，其中TAB2蛋白和TAB3蛋白尤其容易与多泛素蛋白相结合。这种多泛素修饰作用可能是通过自身磷酸化作用（autophosphorylation）激活TAK1蛋白的。TAK1蛋白被激活后可以使IKK-β蛋白活性loop中的两个丝氨酸位点发生硫酸化修饰，从而激活IKK-β蛋白。TAK1蛋白也能够磷酸化MAPK激酶，比如MKK6蛋白和MKK7蛋白，继而激活JNK和p38激酶信号通路。

泛素蛋白是一种小分子修饰蛋白，能以特异性的方式标记靶蛋白。与磷酸化修饰一样，泛素化修饰（即用泛素蛋白来修饰靶蛋白）也是细胞内非常常见的一种修饰途径，它广泛参与了细胞内正常的生理过程以及病理过程。最初，我们认为泛素化修饰途径只能诱导靶蛋白被细胞蛋白酶体降解。但是随着研究的深入，我们发现了与各种泛素修饰途径（比如单泛素化修饰和多泛素化修饰等）相关的越来越多的功能，这些新功能包括调节蛋白转运功能、信号通路蛋白复合体的组装功能以及酶的激活与失活功能等等。

细胞内很多受泛素途径修饰的蛋白质都参与控制细胞内肿瘤发生相关生理（病理）进程，比如细胞周期调控、凋亡、受体下调以及基因转录等多种重要的细胞进程。最近几年，人们对泛素修饰途径在肿瘤相关进程中的分子机制这一课题进行了深入的研究，取得了一定的成果。本文就将向读者介绍，有哪些泛素系统组分参与了肿瘤发生发展过程，并将探讨这些“参与者”在肿瘤治疗方面具有哪些潜在价值（图1）。

1. 泛素连接系统是致癌信号通路的重要治疗靶标

E3连接酶被认为是整个泛素修饰系统中最重要的一个组分，因为它负责直接将泛素蛋白与靶蛋白相连接，因此，E3连接酶起到了控制泛素修饰途径特异性的作用。E3连接酶可以根据它们的结构和作用机制分为几大类，比如是否具有HECT、U-box或RING结构域。在有些情况下，E3连接酶的核心是由好几种蛋白质构成的，比如SCF蛋白复合体就是由SKP1、CUL1、RBX1和一个可变的底物特异性的F-box蛋白等好几种不同蛋白组合而成。有部分E3连接酶与肿瘤有关，这很大程度上是因为它们能导致癌基因或肿瘤抑制物降解。我们研究得比较清楚的与癌症相关的E3连接酶是环状E3连接酶Hdm2。Hdm2蛋白是一种非常关键的肿瘤抑制蛋白p53蛋白的负调节蛋白，它同时也是能调控细胞周期的多亚基SCF连接酶的负调节蛋白。根据E3连接酶的底物特异性不同，它既可以起到促进肿瘤发生的作用，也可以起到抑制肿瘤发生的作用。比如在某些组织中该E3连接酶可能起到的是促进肿瘤发生的作用，而在另一些组织中却能起到抑制肿瘤发生的作用。

2. 针对泛素连接酶的治疗方法

泛素连接酶能使特异性底物蛋白降解，因此我们最开始认为如果针对E3连接酶的活性位点，或针对它们与底物间的特异性相互作用，我们就能够开发出副作用小的高选择性药物。当然，Hdm2蛋白是首选药物靶标。在肿瘤患者体内，如果使Hdm2蛋白失活，就能够激活p53通路，导致细胞周期停滞，细胞凋亡。另一个药物靶标是SKP2蛋白，该蛋白是SCF连接酶复合体中的底物特异性亚基，如果在细胞周期抑制蛋白p27表达水平较低的肿瘤细胞中的SKP2蛋白失活，则可能也会起到一定的抑癌效果。不过从另一方面来看，似乎又有一些理由表明，我们应该提高E3连接酶的活性，即使这要比抑制它们的活性困难得多。比如在高表达c-Myc或cyclin E蛋白的肿瘤患者体内使用Fbxw7激动剂，就会促进上述这些癌基因产物降解；而促进VHL连接酶的活性也能够使HIF1α失稳，抑制肿瘤血管的形成。在近10年间，生物技术公司以及制药公司都在寻求E3连接酶的抑制剂或激动剂，不过到目前为止，还没有一种药物在临床上表现出抗癌效果。

为什么这些有大量理论基础证据支持的治疗方法一直都没能取得成功呢？我们从这些失败的经验中又能学到什么呢？以Hdm2连接酶为例，我们尝试了各种办法，比如抑制Hdm2蛋白表达，抑制其活性，抑制它与p53蛋白结合等等（图1b），最后都以失败告终。不过，我们也开发出了能特异性抑制Hdm2蛋白E3连接酶活性的小分子抑制剂。实际上，用HLI98抑制剂来治疗肿瘤的作用机理就是激

活了p53信号通路，诱导细胞发生凋亡。但是，这些药物的生物效价很差，同时还有与p53无关的脱靶效应（off-target effects）。比如，现在有几种化学药物，其中最成功的要数Nutlins，该药物能针对Hdm2蛋白的沟槽（groove）结构，而该沟槽结构正是Hdm2蛋白与p53蛋白相结合的部位。

虽然Nutlins药物刚问世时效果很好，给了我们极大的信心，但是后来的深入研究发现了不少的问题，这些问题可能会影响这一类抑制剂药物的前景。比如，Nutlins药物只能针对表达野生型p53蛋白的肿瘤细胞起作用，而对表达突变型p53蛋白或不表达p53蛋白的肿瘤细胞则束手无策。Nutlins药物能诱导p53蛋白缺陷型细胞系细胞细胞周期停滞，说明这类抑制剂并不是特异性针对p53信号通路发挥作用的，它们可能还能与其它蛋白一起竞争与Mdm2蛋白相结合的结合位点。也有证据表明，还有一些不会被Nutlins药物抑制的泛素连接酶也能针对p53蛋白，使其被降解。

还有一条开发泛素连接酶抑制剂的策略，那就是找到一种能与连接酶底物蛋白相结合的物质，从而阻止其被泛素蛋白修饰。我们可以针对野生型或突变型的底物蛋白来开发这些抑制剂。还是以p53蛋白为例，我们发现一种名为RITA的小分子化合物能够与p53蛋白的N末端相结合，使得细胞生长停滞（图1b）。不过RITA并不是通过特异性抑制p53蛋白与Hmd2蛋白间的相互作用来起作用的，它还能影响好几个能与p53蛋白相结合的其它蛋白，而这些蛋白都能通过不同于泛素修饰途径的方法来抑制p53蛋白。

在设计能干扰众多细胞周期连接酶蛋白与各自配体间相互作用的多肽类药物时也遇到了同样的问题。比如SCF-β–TrCP能识别

β-catenin或IκBα等蛋白内相距的两个磷酸化丝氨酸位点DS52GXXS56，SCF–Skp2能识别p27Kip1蛋白中硫酸化的苏氨酸位点等。我们还不清楚对上述这种位点进行干扰是否足以特异性地抑制蛋白间的相互作用，而且任何经磷酸化修饰或类似磷酸化修饰的小分子物质都会因其亲水的特性而出现生物利用度（文后小词典1）的问题以及细胞膜通透性的问题。即使这些多肽类药物能够进入细胞，抑制连接酶与其底物蛋白间的结合，我们还需要考虑到特异性的问题，因为大部分连接酶的底物蛋白都不止一种。比如β-TrCP药物能阻止肿瘤细胞内IκB蛋白的降解，从而抑制原癌蛋白NF-κB信号通路，但它同样也能抑制β-catenin蛋白的降解，这反而会促进肿瘤进展，同时也会因为细胞内β-catenin蛋白水平升高而导致其它问题。

3. E3连接酶与肿瘤血管形成之间的关系

肿瘤血管形成是肿瘤的一个标志性事件。肿瘤形成新生血管是肿瘤快速生长的必需条件，这些血管能够为肿瘤组织提供生长所必需的养分与氧气，因此肿瘤血管形成也是肿瘤发展过程中的重要限速环节。我们通过Elongin B/C–CUL2–VHL复合体就可以清楚认识到

E3连接酶与肿瘤血管形成之间的关系。von Hippel-Lindau（VHL）蛋白是Elongin B/C–CUL2–VHL复合体中决定底物特异性的组分，如果在VHL蛋白中引入突变位点会导致肾透明细胞癌（renal clear-cell carcinomas, RCC）或者希佩尔—林道病（文后小词典2）的发生。VHL蛋白的底物之一就是缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor, HIF），它在维持哺乳动物细胞内环境中氧稳定状态的过程中起到了关键性的作用。在高氧状态下，HIF因子的保守脯氨酸位点会被羟基化修饰，然后被VHL蛋白识别，继而通过泛素修饰途径而降解。在缺氧状态下，HIF因子不会被上述泛素化途径降解，所以能够激活一系列缺氧诱导基因，比如血管内皮生长因子（VEGF）、促红细胞生成素（EPO）和葡萄糖载体1（GLUT1）等等。这些蛋白因子都能促进血管生成，增加携氧红细胞的数量，促进无氧代谢水平。如果肿瘤细胞内缺乏VHL蛋白，那么即使在氧含量正常的情况下，细胞内的上述缺氧相关蛋白因子的水平也会升高，因此促进了肿瘤血管的形成，促进了肿瘤的发展和生长。目前，罗氏公司生产的针对VEGF信号通路的单克隆抗体类抗癌药物贝伐单抗

（bevacizumab）已经在临床上用于治疗结肠直肠癌患者、HER2基因阴性的乳腺癌患者和非鳞癌、非小细胞癌的肺癌患者了。贝伐单抗可以与VEGF相结合从而抑制VEGF与内皮细胞表面的受体相结合，来达到VEGF拮抗剂的作用。

4. 针对抗凋亡蛋白

抗凋亡蛋白（IAP）是一组含有1~3个杆状病毒IAP重复序列（baculoviral IAP repeats, BIR）的蛋白家族。BIR结构域具有抗凋亡活性，因为它们能与凋亡蛋白酶相结合，抑制其活性。此外，c-IAP1蛋白和c-IAP2蛋白通过它们的BIR结构域与肿瘤坏死因子相关蛋白2（TRAF2）相结合，抑制该因子介导的凋亡作用（图2）。不过IAP蛋白家族中的大部分成员也都具有RING结构域，因此也具有E3连接酶的活性，能针对各种底物发挥作用。这些底物包括凋亡因子和信号通路因子等，比如NIK、Mad1和TRAF2等等因子。而且，c-IAP1蛋白和c-IAP2蛋白，以及X相关抗凋亡蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis, XIAP）能够触发自身泛素化反应，在促凋亡信号的刺激下将自身降解掉。据报道，有些肿瘤细胞里的IAP蛋白水平会极度升高，这可能是由于NF-κB蛋白的活性增高所致。另外，有人将c-IAP2蛋白的BIR结构域与MALT1这种E3泛素连接酶相融合，结果也诱导形成了MALT淋巴瘤。BIR-1结构域介导的自身寡聚化作用（self-oligomerization）也能增强MALT1 E3连接酶的活性，导致NF-κB信号通路被持续激活，这说明MALT1起到了调节T细胞受体介导的NF-κB激活途径作用。

c-IAP1蛋白和c-IAP2蛋白的自身泛素化过程需要线粒体蛋白SMAC（second mitochondrial activator of caspases），又名为DIABLO（direct IAP-binding protein with low pI）的参与。该蛋白在细胞凋亡后会从线粒体释放出来，激活凋亡蛋白酶，并以极低的pI与IAP蛋白相结合（图2）。该SMAC蛋白含有一IAP蛋白结合基序（IAP-binding motif, IBM）。该基序与IAP蛋白的BIR结构域相

结合。首先，能与BIR结构域相结合的蛋白，比如凋亡蛋白酶能通过IAP介导的方式被释放出来；其次，IAP蛋白的E3连接酶活性能使自身被降解。目前，我们已经研究出了不同的策略来针对癌症模型里的IAP蛋白（图2），比如使用RNAi技术或反义技术下调IAP蛋白的表达，或者用IAP拮抗剂来抑制IAP蛋白的功能等。此外，我们还开发出了能模拟SMAC作用的小分子IAP拮抗剂。上述这些策略都已经被试验证明，能够诱导肿瘤细胞凋亡，其中的作用机制可能是通过非经典途径激活了NF-κB信号通路，从而表达出了大量的TNF-α蛋白，导致细胞死亡。从人体肿瘤组织样品和动物模型获得的临床前数据表明，用反义寡核苷酸抑制IAP蛋白的表达有望成为一种新型的癌症治疗方法。目前，用于治疗肿瘤的能抑制XIAP蛋白和存活素蛋白表达的反义复合物已经进入了I期和II期临床试验阶段。

5. 去泛素化酶在肿瘤进展中的作用

泛素修饰系统有一个很重要的特点，那就是由于去泛素化酶（DUB）的存在所导致的修饰反应的可逆性，因为去泛素化酶能将经泛素化途径修饰的靶蛋白上的泛素蛋白标签去除掉。大部分人类去泛素化酶都属于半胱氨酸蛋白酶（cysteine proteases），它们可以分为5类，即泛素蛋白特异性蛋白酶（ubiquitin-specific proteases, Usp）、泛素蛋白羧基端水解酶（ubiquitin carboxy-terminal hydrolases, UCH）、卵巢肿瘤样蛋白酶（ovarian tumour-like proteases, OTU）、JAMM/MPN金属蛋白酶（metalloproteases）以及马-约病蛋白酶（Machado–Jakob-disease proteases,MJD）。这些去泛素化酶都是致癌或抑癌E3连接酶的直接抑制物，我们也意识到可以将它们作为抗癌治疗的作用靶点。而其中最有望取得成功的就是核去泛素化酶（nuclear DUB），包括USP1、USP28和USP44，它们都与癌症的发生和发展有关。USP1蛋白通过抑制范康尼贫血互补基团D2蛋白（FANCD2）和PCNA蛋白的单泛素化作用调控DNA修复检查点。USP28蛋白在结肠癌患者与乳腺癌患者体内都过量表达，它通过抑制SCF–Fbxw7连接酶的泛素化活性来稳定cyclin E1蛋白和c-Myc蛋白。而USP44蛋白则能够通过去除Cdc20蛋白的泛素化修饰作用来对抗细胞分裂后期促进蛋白APC/C的活性，防止纺锤体检查点（文后小词典3）过早失效。

其它与肿瘤相关的去泛素化酶还能调控NF-κB信号通路。泛素蛋白连接酶以及去泛素化酶都参与了NF-κB信号通路的调控过程。它们可能同处于一个复合体中，甚至共同位于一条多肽链上。正因为如此，它们才能更有效地对NF-κB信号通路进行动态调控。这种泛素蛋白连接酶与去泛素化酶之间 “亲密关系”最为经典的范例非A20蛋白莫属。 A20蛋白的OUT结构域具有去泛素化酶活性，而A20蛋白的锌指结构具有E3连接酶的活性。A20蛋白能催化RIP蛋白和NEMO蛋白等底物蛋白上第63位赖氨酸位点去泛素化，也能促进靶蛋白的第48位赖氨酸位点与泛素蛋白连接，继而靶蛋白被蛋白酶体降解。

另一种名为CYLD的去泛素化酶也能调控NF-κB信号通路。CYLD蛋白见于圆柱瘤病（cylindromatosis）这种皮肤肿瘤患者体内，由一种抑癌基因的突变体所编码。细胞内广泛存在的CYLD蛋白在其C末端含有一泛素蛋白水解酶结构域，该结构域能将连接在靶蛋白第63位赖氨酸残基上的多聚泛素蛋白修饰物水解去掉，这些靶蛋白中有许多都参与了细胞因子诱导的NF-κB信号通路调控作用。在人体皮肤癌以及好几种其它人体肿瘤，比如肾脏肿瘤、肝脏肿瘤以及宫颈肿瘤等患者体内都发现CYLD蛋白的表达量下降，甚至被抑制，这说明CYLD蛋白具有普遍的抑癌作用。对敲除了CYLD基因的小鼠进行研究发现，BCL3蛋白是CYLD蛋白的重要底物，BCL3蛋白对于

圆柱瘤病相关肿瘤的发生发展具有极其重要的作用。BCL3蛋白是一种转录辅助激活因子，它在胞质中处于失活状态，经多泛素蛋白修饰后活化进入核内，随后与NF-κB1蛋白或NF-κB2蛋白一起启动转录复合体，促进有助细胞增殖的靶基因表达。

对去泛素化酶进行更进一步的深入研究，了解其催化活性、底物特异性以及调控机制将有助于我们开发出去泛素化酶抑制剂并将其作为抗癌药物，造福人类。我们已经证实，针对泛素蛋白C末端水解酶（ubiquitin C-terminal hydrolase, UCH-L1）的小分子抑制剂具有治疗肺癌的作用。虽然这一成功案例证明，去泛素化酶抑制剂具有美好的前景，但是要将它真正应用到临床，还有很多问题需要克服。

6. 针对肿瘤细胞的蛋白酶体

经泛素蛋白修饰的靶蛋白大部分最终都会被蛋白酶体降解掉。而蛋白酶体的变化也会导致人体疾病，比如心脏功能障碍、白内障

（cataract formation）、神经变性疾病、恶病质（cachexia）和类风湿疾病（rheumatoid diseases）等等，但是还没有发现蛋白酶体与肿瘤之间存在什么关联。这说明肿瘤细胞可能也需要蛋白酶体功能正常。事实上，有好几条抗凋亡信号通路和细胞增殖信号通路的确利用了蛋白酶体的活性，尤其是在多种肿瘤细胞中被广泛激活的NF-κB信号通路更是如此。NF-κB蛋白在胞质中由于NF-κB抑制剂（IκB）的作用而处于失活状态，只有当NF-κB抑制剂被磷酸化、多泛素化修饰，继而被蛋白酶体降解之后，NF-κB蛋白才能被激活。Millennium Pharmaceuticals公司生产的硼酸衍生物类抗癌药物硼替佐米（bortezomib），商品名万科（Velcade）就能可逆性地抑制20S蛋白酶体活性位点，因此硼替佐米可能就是通过上述机制（即阻止NF-κB抑制剂被蛋白酶体降解，下调NF-κB信号通路的活性）来发挥抗癌作用的。抑制了NF-κB信号通路还能抑制炎症反应相关基因的表达，上调细胞周期蛋白依赖的激酶抑制物p21Cip1和p27Kip1的表达，从而促进肿瘤细胞凋亡。硼替佐米除了能作用于NF-κB信号通路之外，还有证据表明，在某些类型的细胞中它还能通过抑制蛋白酶体的降解作用形成内质网应急反应（endoplasmic-reticulum stress），从而促进细胞死亡。目前，临床上主要用硼替佐米来治疗多发性骨髓瘤（multiple myeloma）等血液系统肿瘤，最近也开始用于治疗套细胞淋巴瘤（mantle-cell lymphoma）复发的病人。

硼替佐米的成功带动了一大批蛋白酶体抑制剂的研发，比如PR-171（carfilzomib)、NPI-0052和CEP-18770等。目前市面上的各种蛋白酶体抑制剂作用机制以及作用靶点各不相同，比如有针对20S蛋白酶体糜蛋白酶活性位点的、针对20S蛋白酶体胰蛋白酶活性位点的以及针对20S蛋白酶体半胱天冬酶活性位点等。作用机制也分为可逆性的抑制与不可逆性的结合或共价修饰等。比如NPI-0052能不

可逆地抑制蛋白酶体糜蛋白酶活性以及胰蛋白酶活性，硼替佐米则是可逆性地影响蛋白酶体糜蛋白酶活性以及半胱天冬酶活性。

NPI-0052发挥抗癌功效是针对FADD-caspase-8介导的细胞死亡信号通路发挥作用，而不是像硼替佐米那样针对NF-κB信号通路。目前的临床研究以及临床前期研究都将目光投向了新型蛋白酶体抑制剂在治疗血液系统肿瘤以及其它各种实体瘤时的疗效。更重要的是，我们在体外试验中发现，将蛋白酶体抑制剂结合使用，比如将NPI-0052与硼替佐米结合，可以起到协同抗癌作用。同样，将硼替佐米与其它抗骨髓瘤药物比如左旋苯丙氨酸氮芥（melphalan，即美法兰）、泼尼松（prednisone）、地塞米松（dexamethasone）和酞咪哌啶酮（thalidomide，即反应停）等联用，对早期诊断的骨髓瘤患者也具有治疗作用，目前这种疗法已经进入了三期临床试验。现在对于临床医生来说，最大的任务就是确定合适的联用方案，比如使用哪些药物，每种药物的用药剂量等，以求达到优于单独使用硼替佐米的治疗效果。另一方面，我们也需要开发针对更多种底物、生物利用度更高、毒性更低的蛋白酶体抑制剂。argyrin A就是这样一种新型的蛋白酶体抑制剂，它是我们在筛选能稳定细胞周期抑制蛋白p27Kip1的复合物时发现的，因此其抗癌活性必须依赖p27Kip1蛋白的正常表达，如果缺乏p27Kip1蛋白，那么argyrin A也就不能起到抗癌作用。

7. 非降解途径的泛素化修饰作用与肿瘤发生之间的关系

在肿瘤细胞中，蛋白被泛素修饰之后也可能不被降解。比如NF-κB蛋白泛素化修饰后可以聚集形成信号通路复合体；p53蛋白和PTEN蛋白泛素化修饰后可以在胞质与胞核间穿梭，发挥致癌作用或抑癌作用；泛素化修饰作用还能将致癌复合体等招募到细胞核聚集点（Nuclear foci）这类亚细胞结构当中。不过，上述作用都是通过非典型泛素化修饰作用完成的，即泛素蛋白不是与靶蛋白第48位或63位赖氨酸相连，而是与其第6位、11位、27位、29位或33位赖氨酸位点相连。这些动态的修饰过程在细胞发生DNA损伤时起到了重要作用。为了避免发生有害的突变，细胞需要快速发现DNA损伤，确定损伤类型，启动相应的修复机制来完成修复。环状E3连接酶RNF8和BRCA1在细胞修复由电离辐射导致的DSB（DNA双链断裂）损伤时起到了关键作用（图3）。RNF8蛋白与E2结合酶UBC13一起对组蛋白H2A和H2AX进行了泛素化修饰，在组蛋白的第63位赖氨酸位点连接上了泛素蛋白。这种非降解修饰信号在修复复合体形成过程中起到了重要作用，因为在组成修复复合体的BRCA1蛋白、RAP80蛋白以及其它蛋白中，RAP80蛋白具有两个泛素蛋白结合基序（ubiquitin-interacting motives, UIM），该基序能与靶蛋白第63位赖氨酸上的泛素修饰蛋白结合，并且能招募BRCA1蛋白复合体形成细胞核聚集点，完成修复。如果BRCA1基因发生突变，则会诱发卵巢癌或乳腺癌，但是RAP80基因或RNF8基因突变却不会诱发上述癌症。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/rrn8.html