凝胶层析法分离纯化蛋白质

凝胶层析法分离纯化蛋白质实验

凝胶层析法分离纯化蛋白质

凝胶层析法分离纯化蛋白质实验

【目的】掌握凝胶层析的基本原理 学习利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验 技能

凝胶层析法分离纯化蛋白质实验

【原理】 凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。 是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用， 根据被分离物质的分子大小不同来进行分 离的技术。

凝胶层析法分离纯化蛋白质实验

凝胶过滤层析凝胶层析是按照蛋

白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶 过滤、分子筛层析或排 阻层析。

单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝 胶的筛孔的大小不同。

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带网孔的 葡聚糖珠小分子进入 葡聚糖珠内

大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出

凝胶过滤层析过程示意图

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凝胶 珠

凝胶基质

小分子 大分子

凝胶过滤层析过程示意图

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总结：相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排 阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程 较短，移动速度快；所以首先流出。 相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全 渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程 较长，移动速率慢；所以最后流出。 中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的

程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。 这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的

顺序依次流出，从而达到了分离的目的。

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【实验器材】 层析柱

恒流泵紫外检测仪 部分收集器 试管等普通玻璃器皿

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【实验试剂】

待分离样品

葡聚糖凝胶 Sephadex G-100洗脱液：0.1mol/L pH6.8磷酸缓冲液

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【操作方法】

一、凝胶的处理Sephadex G-100干粉经蒸馏水室温充 分溶胀48h,或沸水浴中煮沸2h,冷却至 室温后抽真空脱去颗粒空隙中的空气。

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二、装柱关闭出口，向柱内加入洗脱液约1cm高， 将浓浆状的凝胶缓慢地倾入柱中，使之自然 沉降，凝胶沉降约1㎝高度后打开出水口， 继续加入凝胶浆，直到凝胶沉积至一定高度 即可。装柱要求连续，均与，无气泡，无 “纹路”。

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三、平衡将洗脱液与恒流泵相连，恒流泵出口端 与层析柱入口相连，用2~3倍柱床体积的洗 脱液平衡，流速为0.5ml/min。

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四、加样与洗脱将柱中多余的液体放掉出，使液面刚好 盖过凝胶，关闭出口，将1ml样品沿层析柱 管壁小心加入，加完后打开底端出口，使液 面降至与凝胶面相平时关闭出口，加洗脱液 至液层4cm左右，接上恒流泵，开始洗脱 ( 0.5ml/min)。

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五、收集与测定用部分收集器收集洗脱液。紫外检测仪 280nm处检测，将检测信号输入色谱工作站 系统，绘制洗脱曲线。

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六、凝胶柱的处理凝胶用

过后，反复用蒸馏水通过柱 (2~3倍床体积)即可。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/rr2q.html