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POLYSULFOETHYL ATM

初次使用：POLYSULFOETHYL ATM是一种与亲水性阴离子聚合物即磺酸基与硅胶结合装柱。它是强阳离子交换材料，柱子用甲醇封装，用至少15倍柱子体积的水冲洗（200*4.6mm柱子用30ml）。三个梯度循环的缓冲液用于SCX，0-100%的B超过20min,100%B保持5min，在开始第二个梯度开始前调回100%A，并平衡25min，第三个循环结束后，柱子可以用了。

新HPLC柱有时会非特异性的吸收少量蛋白或磷酸化的肽段。烧结金属熔化已经涉及这一点。用40Mm EDTA2Na 低流速洗脱柱子20-24h能解决这个问题。钝化HPLC系统所有金属表面，同时柱子也是。

常规使用：室温使用柱子，过滤流动相和样品使用。如果不这样做,就可能导致进口熔块塞住。这个熔块是可替换的。开始时，在低盐缓冲液平衡前，用15倍柱子体积的高盐缓冲液冲洗。结束时用15倍柱子体积的水冲洗，结束。

载荷能力： 4.6mm柱子荷载4mg的肽段或注射剂。然而在蛋白质组学的应用最好是最大荷载的40%。

存储：1.过夜：100%A 2.几天：水中。3.长期：水中冰箱中，加塞子。可以用ACN:H2O=80:20溶液中防止微生物生长。

柱子维护：每运行250次后，倒置运行，可使用250次，重复此处理。可以的话500次后打开进口填充空隙体积。

减少系统中的铁：这种涂层Fe+3螯合物,能毁坏性能。如果经常使用含氯的流动相，每四个星期用40Mm EDTA2Na钝化HPLC系统，以低流速运行过夜。注：如果HPLC系统超过一个星期不用，Fe+3离子会在积累在流体中。当重新开始系统时，换掉柱子前冲洗流体废弃离线的。

肽段的离子交换：这种材料是专为pH在2.7-3.0的阳离子交换肽的开发。用来pH4以上的离子交换，在范围内不优于如POLYCAT ATM的离子交换剂。在pH=3时（组氨酸精氨酸赖氨酸）基本残基带阳电荷，，N-末端也是。（天冬氨酸谷氨酸）酸性的残基不带电，同样C-末端也是。大多数无N-末端的肽段的净电荷至少带+1，将于POLYSULFOETHYL ATM结合。它们可以用一个盐梯度进行洗脱。一个好的通用缓冲系统是10mM KH2PO4 pH2.7-3.0,含20?N，但线性梯度的缓冲液中要加入0.5MKCl, 肽洗脱是根据净正电荷的增加。可以通过使用不同有机溶剂调节选择性,但峰值与峰宽可完全忽略。恢复通常是高或量化，保护暗盒，使用混合物CNBr乳沟消化或原油组织提取物是明智的。如果需要一个不稳定的流动相,那么甲酸盐可以用作缓冲和梯度，然而它的使用妨碍在220nm的吸光度。

特定隔离交联肽：一个典型的胰蛋白酶的多肽在pH3.0带+2，由于一端是N-末端，另一端。是赖氨酸或精氨酸。连接两个这样的多肽和肽的二硫桥或其他结果带+ 4,这些肽在典型的胰蛋白酶的肽之后洗脱出来,允许他们方便的分离和鉴定。

肽纯化和二维色谱法：POLYSULFOETHYL ATM的保留是对反相高效液相色谱的补充。SCX

一步是一个很好的方法来分解大量的肽,如胰蛋白酶的酶解,为较小的子集通过反相色谱法进一步解决。最后一个使用RPC柱,因为它们能力低于SCX柱和在挥发性流动相的产量。 胰蛋白酶酶解：60-70%带有+1或+2电荷的太可被梯度0.25M KCl洗脱，残留的含有带+3+4电荷的用0.6M 的盐洗脱。为了尽可能在收集部分得到均匀的胰酶酶解的肽段，使用两个溶剂的线性梯度最好。在约75%的洗脱阶段用0.25M盐，剩下25%用0.25-0.6M pH4.5-6的盐。

胰酶酶解的肽段的分离：片段中的许多磷酸肽洗脱带有净电荷+1，它们是酶解复合物﹤3%的部分，使得跟容易鉴定。使用POLYSULFOETHYL ATM 200A孔径：由于其较高的表面积，在分离带+1+2肽段比300A的好，流动相pH2.7不是3.0。

蛋白质的交换：不考虑等电点，所有的蛋白在PH3都有净电荷，被POLYSULFOETHYL A保留，除非它们疏水磷酸化，这使得所有的蛋白可在一个柱子离子交换分离。由于蛋白质是大分子，POLYSULFOETHYL ATM1000A或更广的可以使用。许多蛋白质在pH3.0时变性，暴露核心的疏水残基,导致聚合。这可以防止通过包含一个高水平的有机溶剂的流动相和使用NAClO4为盐梯度。对于普通蛋白，用10?N +10%丙醇，35%+35%结果更好，尤其是疏水蛋白质。在如此高的水平。选择性是由亲水相互作用的叠加影响的静电效应，加入50mM的六氟二丙醇溶解样品和流动相保持溶解性。如果NAClO4用于洗脱，甲基磷酸的钠盐是非常好的缓冲液。

浸出柱：所有的色谱填料流出使用很少量的固定相。在使用POLYSULFOETHYL ATM中，这可能会导致少量的天冬氨酸、牛磺酸、和其它涂层成分从柱中浸出。如果可以你，用50mM 甲酸洗脱新的柱子以低流速过夜。这加速了膜组件的浸出,不是共价连接到硅。此后,用水冲洗出甲酸,平衡和使用像往常一样。

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