第1课时 基因工程的操作工具

第一课时 1.1 DNA重组技术的基本工具

【课前导学】

1．1 DNA重组技术的基本工具

一、基因工程的原理：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外

和 ，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在 水平上进行设计和施工的，因此又叫做 。

二、限制性核酸内切酶

1、切割DNA的工具是 ，又称 。

2、这类酶在生物体内能将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保持细胞原有的遗传信息。

3、由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶（简称限制酶）。 4、DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段，末端通常有两种形式，即 和 。

三、DNA连接酶——“分子缝合针”

根据DNA连接酶的来源不同，可以将它分为两类：

一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为E?coliDNA连接酶。E?coliDNA连接酶只能将 连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。

另一类是从 分离出来的，称为T4DNA连接酶。T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的 ，又可以“缝合”双链DNA片段的 ，但连接 之间的效率比较低。

四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”

1、基因操作过程中使用载体两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制。

2、现在通常使用的载体是 ，它是一种相对分子质量较小、独立于拟核DNA之外的环状DNA，有的细菌中有一个，有的细菌中有多个。

3、质粒通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以 复制，也可整合细菌拟核DNA中，随着拟核DNA的复制而复制。

4、其他载体还有 和 等。 5、作为载体必须具备以下条件：

能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；

具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；

具有某些标记基因，便于进行筛选，如对抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。 【总结归纳】

归纳点1 基因工程的概念 基因工程的别名 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 结果 归纳点2 基因工程的工具及其比较

基因拼接技术或DNA重组技术 生物体外 基因 DNA分子水平 剪切→拼接→导入→表达 人类需要的基因产物 1、基因工程的操作工具

（1）分子手术刀——限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶简称限制酶，主要存在于原核生物中，一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。目前已经发现了200多种限制酶。例如，从大肠杆菌中发现的一种限制酶只能识别GAATTC序列，并在G和A之间将这段序列切开。苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因，就能被某种限制酶切割下来。DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端（如下图所示）。当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的则是平末端。

注意：①用限制酶切割DNA分子时，被破坏的是DNA链中的磷酸二酯键（即连接相邻两个脱氧核苷酸的键）。

②黏性末端是指双链DNA分子被限制酶切开后，切口处的两个末端伸出的由若干特定核苷酸组成的单链。

（2）分子缝合针——DNA连接酶

从上图中可以看出，把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，然后让二者的黏性末端按碱基互补配对原则形成双链，用DNA连接酶催化两条DNA链的相邻两个碱基之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核苷酸连接起来。DNA连接酶有两类：一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为E·coli DNA连接酶；另一类是从T4噬菌体中分离出来的．称为T4 DNA连接酶。E·coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。而T4-DNA连接酶既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率较低

（3）分子运输车一——基因进入受体细胞的载体 ① 使用运载体的目的

在基因工程中使用运载体有两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制（称为克隆）。 ② 运载体的种类

现在所利用的运载体主要有两类：一类是细菌的质粒，它是一种相对分子质量较小、独立于细菌核区DNA之外的双链环状DNA。另一类运载体是噬菌体或某些灭活的病毒等。现在人们还在寻找新的运载体，如叶绿体或线粒体等也有可能成为运载体。

③ 基因的运载体必须具备的条件

a．载体DNA必须有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而导致其自身失活。

b．载体DNA必须具备自我复制的能力，或可以整合到受体染色体DNA上随受体染色体DNA的复制而同步复制。

c．载体DNA必须带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。

d．载体DNA必须是安全的，不会对受体细胞有害，不能进入到除受体细胞以外的其他生物细胞中去。

e．载体DNA分子大小应适中，以便提取和在体外进行操作，太大则不便操作。

一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改造现在使用的质粒载体几乎都是经过改造的。

【典题反馈】

题型1 考查基因工程工具酶的特点

例题1（多选题）右图为DNA分子结构示意图，对该图的正确描述是 A．④的名称是胞嘧啶脱氧核苷酸 B．解旋酶作用的部位是⑨

C．某限制性核酸内切酶可选择⑨处作为切点 D．DNA连接酶可连接⑩处断裂的化学键

反馈1 如图所示，两个核酸片段在适宜条件下，经X酶的催化作用，发生下述变化。则X酶是

A．DNA连接酶 B．RNA聚合酶 C．DNA聚合酶 D．限制酶

↓

反馈2 限制性核酸内切酶I的识别序列和切点是一GGATCC一，限制性核酸内切酶Ⅱ的识别

↓

序列和切点是一GATC一。在质粒上有酶I的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶Ⅱ的切点。 （1）请画出质粒被限制性核酸内切酶I切割后所形成的黏性末端。

_____________________________________________________________________________。 （2）请画出目的基因两侧被限制性核酸内切酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。

_____________________________________________________________________________。 （3）在DNA连接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接?为什么?________________________________________________________________________________。

（4）基因工程中，如果要把相应的黏性末端连起来，要用__________酶。 【基础训练】

1．在基因工程中，科学家所用的“剪刀”、“针线”和“载体”分别是指( )

A.大肠杆菌病毒、质粒、DNA连接酶 B.噬菌体、质粒、DNA连接酶 C.DNA限制酶、RNA连接酶、质粒 D.DNA限制酶、DNA连接酶、质粒 2．不属于质粒被选为基因运载体的理由是 （ ）

A．能复制 B.有多个限制酶切点 C．具有标记基因 D．它是环状DNA 3．下列四条DNA分子，彼此间间具有粘性末端的一组是 （ ）

A．①② B．②③ C．③④ D．②④ ４．质粒是基因工程中最常用的运载体，它的主要特点是

①能自主复制 ②不能自主复制 ③结构很小 ④蛋白质 ⑤环状RNA ⑥环状DNA ⑦能“友好”地“借居” A．①③⑤⑦

B．①④⑥C．①③⑥⑦

D．②③⑥⑦

５．有关基因工程的叙述中，错误的是 （ ）

A．DNA连接酶将黏性未端的碱基对连接起来B．限制性内切酶用于目的基因的获得 C．目的基因须由载体导入受体细胞D．人工合成目的基因不用限制性内切酶 ６．实施基因工程第一步的一种方法是把所需的基因从供体细胞内分离出来，这要利用限性内切酶。一种限制性内切酶能识别DNA子中的GAATTC顺序，切点在G和A之间，这是应用了酶的（ ）

A．高效性 B.专一性C．多样性 D.催化活性受外界条件影响

７．人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因的主要作用是

A . 提高受体细胞在自然环境中的耐药性B. 有利于对目的基因是否导入进行检测 C. 增加质粒分子的分子量D．便于与外源基因连接

8．下列属于基因运载体所必须具有的条件是（多选） （ ）

A、具有某些标志基因B、具有环状的DNA分子

C、能够在宿主细胞内复制D、具有多种限制性内切酶

9．下列哪些可作为基因工程技术中常用的基因运载工具（多选） （ ）

A．大肠杆菌 B． 质粒C．动物病毒 D． 线粒体 10．在重组DNA技术中，不常用到的酶是

A、限制性内切酶 B、DNA聚合酶 C、DNA连接酶 D、反转录酶 11．多数限制性核酸内切酶切割后的DNA末端为

A、平头末端 B、3突出末端 C、5突出末端 D、粘性末端 12．在基因工程中通常所使用的质粒是

A、细菌的染色体DNA B、细菌染色体外的DNA C、病毒染色体DNA D、噬菌体DNA 13．（2006深圳一模考题）研究人员想将生长激素基因通过质粒介导入大肠杆菌细胞内，以表达产生生长激素。已知质粒中存在两个抗性基因：A是抗链霉素基因，B是抗氨苄青霉素基因，且目的基因不插入到基因A、B中，而大肠杆菌不带任何抗性基因，则筛选获得“工程菌”的培养基中的抗抗生素首先应该

A、仅有链霉素 B、仅有氨苄青霉素

C、同时有链霉素和氨苄青霉素 D、无链霉素和氨苄青霉素 14．（05全国Ⅰ）镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因的碱基序列发生了改变。检测这种碱基序列改变必须使用的酶是

A. 解旋酶 B. DNA连接酶 C. 限制性内切酶 D、RNA聚合酶

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