我国几种植物植原体的快速分子鉴别与鉴定的研究_李永

植物病理学报

A CTA PHY TO PA THO LOG ICA SI N ICA 35(4):293-299(2005)

我国几种植物植原体的快速分子鉴别与鉴定的研究

李永1,田国忠1*,朴春根1,朱水芳2

(1中国林业科学研究院森林生态环境与保护所,北京100091;2中国检验检疫科学研究院动植物检疫实验所,北京100029)

摘要:选用桑萎缩病(M u l berry dw a rf,M D)、枣疯病(Ju j ube w itche s -broom,J W B)、酸枣丛枝病(W il d j u j ube w itche s -broom,W J W B)、泡桐丛枝病(Paulow n i a w itches -bro om,P a W B)和苦楝丛枝病(C hi nabe rry tree w itche s -broom,C W B)5种不同植物植原体和来源于3个不同地区P a W B和J W B材料进行16S r DN A和23S r D NA PCR扩增、异源双链迁移率分析(HM A)、PCR产物的R FL P分析和16S r D NA的克隆和测序等比较研究,建立了一种快速确定未知植原体种类和分类地位的分子鉴别与鉴定优化程序;并可对田间采集的各种植物植原体样品进行快速鉴定和鉴别。16S r DN A PCR产物HM A分析结果显示,J W B与CW B、M D和P a W B皆可形成明显的异源杂交双链;而CW B、M D和Pa W B植原体之间未能形成异源双链。J W B和P a W B不同地区样品之间、J W B和W J W B之间也未发现异源杂交双链的形成。而23S r D NA PCR产物HM A分析则可以将M D与Pa W B区分开。进一步对未知分类地位的CW B序列测定及与其它植原体16S r D NA的R FLP 和同源性比较结果显示,CW B与P a W B同源性为99 5%,其中与M D的同源性高达99 7%,因而应将CW B归为翠菊黄花组16S r I-B,16Sr I-B(rp-B)。

关键词:植原体;分子鉴别与鉴定;异源双链迁移率分析;限制性片段长度多态性;序列测定

Rap id m o l e cu l a r d iffe re n tia t i o n and ide n tifica t i o n o f d iffe re n t p hy to p la s m as from sev e ra l p lan ts in Ch ina L I Yong1,T I A N G uo-zhong1,PI A O C hun-gen1,ZHU Shu-i fang2 (1R e-search In stitute o f Fo re st Eco log y,Env iron m ent and P ro tec tion,Ch i nese A cadem y o f Fo restry,B e iji ng100091,C hi na;2In stitute o f A ni m a l and P lant Q uaran tine,Ch i nese A cade m y o f Inspec ti on and Q uaranti ne,Be iji ng100029,Ch i na)

Ab stra ct:A n efficient procedure fo r rapid i d entification and differentiation of phy toplas m a s w as estab lished by com parative studies o f16S r D NA and23S r DNA PCR,heteroduplex m ob ility assay(HM A),RFLP and sequence analy sis of PCR-a m p lified pr oducts(16S r DNA)to m ul b erry dw arf(M D),jujube w itche s -br o o m (J W B),w ild jujube w itches -broom(W J W B),pau l o w n ia w itches -broom(Pa W B)and chinaberry tree w itches -br o o m(C W B)phytop las m as as w e ll as different sa m p l e s o f paulo w nia w itches -broom and jujube w itches -broom-phy top l a s m as fro m three different areas i n Ch i n a.Itw as de m onstrated t h at16S r DNA PCR-a m-p lified product o f J W B-phy toplas m a produced disti n ct heterodup l e x m ob ility bandsw it h C W B,M D and Pa W B w hile C W B,M D and Pa W B w ere no t d istinguished by HM A.No o bv ious heteroduplex m ob ility band w a s fo r m ed bet w een d ifferent paul o w nia w itches -broo m and jujube w itches -broo m-phy toplas m a sa m ples asw ell a s bet w een J W B and W J W B-phy top las m as.H ow ever,HM A o f23S r DNA PCR products see m ed to disti n guish M D w ith Pa W B.The resu lts of sequenc i n g and ho m o loguo us co m parison w it h o ther phy top las m as furt h er show ed that C W B shared99 5%w ith Pa W B,99 7%w ithM D.Thus C W B m i g ht be so rted i n to aster ye ll o w s group,16Sr I-B,16Sr I-B(rp-B).

Key w o rd s:phy top l a s m as;m o lecular d ifferen ti a ti o n and i d entification;he teroduplex m ob ility assay;

收稿日期:2004-10-14;修回日期:2004-12-31

基金项目:国家自然科学基金资助项目(30070622);国家 十五 攻关资助项目(2001BA509B1202);中央级科研院基础性工作专项资金项目(2001DEA10004)

通讯作者:田国忠,研究员,主要从事林木病毒与植原体病害研究;E-m ai:l tiangz@b6c97a5d168884868762d6f0

第一作者:李永(1978-),男,山东人,研实员,硕士,主要从事林业微生物菌种保藏与植原体分子生物学研究;

E-m ai:l li yon g5136@b6c97a5d168884868762d6f0。

restriction fragm ent leng th po lym o rphis m;sequenc i n g

中图分类号:S432 4+2 文献标识码:A 文章编号:0412-0914(2005)04-0293-07

植原体(phy t o plas m a),原称类菌原体(M LO),在植物和昆虫中广泛分布,能引起许多重要粮食作物、蔬菜和果树以及林木病害,造成巨大损失。迄今,世界各地已统计有700多种植物自然感染植原体病害,我国也报道了70多种植物植原体病害。由于植原体为无细胞壁原核微生物,尚不能在人工培养基上离体培养,给分类和鉴定带来许多困难。近10多年来,对植原体分子生物学研究所取得的重要进展,逐步确立了以核酸信息为主要依据的植原体分类鉴定新方法。各国学者对众多植原体的分子生物学研究结果,促进了植原体检测、鉴定和鉴别技术的较大发展[1~4]。到目前为止,根据16S r RNA基因限制性片段长度多态性分析(RFLP)和核糖体蛋白基因(r p)序列分析构成了植原体分类的基本框架,并将植原体分为14个组(候选种)和41个亚组。

在我国已报道的植原体病害中,已根据現有的归类标准将泡桐丛枝病、枣疯病、桑树萎缩病、樱桃致死性黄化病和仙人掌丛枝病等植原体归入国外权威的分组系统之中。但我国发生的多数其它植原体病害,像苦楝丛枝病、重阳木丛枝病等,由于病原分子生物学研究信息不全或缺乏而未能被鉴定和系统归类[5,6]。这已严重影响了我国对这类病害系统分类和鉴定水平的提高,也妨碍了植原体间亲缘关系、病害发生、流行规律及病害防治技术研究的发展。有鉴于此,本研究比较了几种分子生物学技术在鉴别我国重要植物植原体上的作用和实用性;探讨了如何快速鉴定和鉴别不同植物植原体的有效途径;并依据已知植原体信息资料,对尚未知分类地位的苦楝丛枝病植原体进行了归类尝试。

1 材料和方法

1 1 染病材料

泡桐丛枝病(Pa W B)分别采自山东兖州、北京、江西分宜三地;枣疯病(J W B)分别采自河北唐县、河南濮阳、辽宁凌源三地;酸枣丛枝病(W J W B)采自河北唐县;桑树萎缩病(M D)来自江苏镇江

(由中国农科院蚕业研究所夏志松先生提供);苦楝丛枝病(C W B)来自江西分宜;重阳木丛枝病来自安徽歙县。Pa W B和J W B部分株系保存在染病组培苗上,其余为从田间病树上采集的病枝鲜材料或风干脱水材料。

1 2 方法

1 2 1 DNA提取 组培苗取表现丛枝症状的染病茎叶组织,田间材料取叶片组织,用SD S-CTAB 改进法提取植物总DNA[7]。

1 2 2 PCR反应及所用的引物对 参照Lee等[1]的方法,根据植原体16S r D NA序列设计的引物对(P1),R16m F2/R16mR1:5 -CA TGCAAGTC-GAACGGA-3 /5 -CTTAACCCCAATCATCGA-3 。

PCR反应条件:50 L PCR反应体系中含有5 L10 buffer,引物500nm o l/L,dNTPs100 m o l/L,DNA模板20ng,Taq DNA聚合酶2U (北京鼎国生物技术发展中心)。反应程序:94 45s,52 45s,72 1m i n,35个循环;72 延伸10m i n。

23S r DNA引物应用Guo等[8]设计的P23S 5F3/A23S3R3,详见文献,序列如下:

P23S5F3/A23S3R3:5 -GTGGATGCCTTGGC-ACTAAGAGCC-3 /5 -ACTTACACACCTGGCCT-ATCAACC-3 。

PCR产物用1%琼脂糖电泳检测(EB染色),紫外透射仪下观察。

1 2 3 异源双链迁移率(he ter o duplex m obility as-say,HMA)分析 根据文献[9~11],对5种植物植原体(M D、Pa W B、J W B、W J W B、C W B)进行异源双链迁移率分析,随机取2种植物植原体,将其16S r DNA或23S r DNA的PCR产物进行混和, 100 变性5m i n,立即放入37 水浴,过夜,然后进行5%聚丙烯酰胺电泳(EB染色或银染)。反应体系为2种PCR产物各4 5 L,1 L1 变性buffer(100mm o l/L T ris-HC l p H8 0、10mm o l/L EDTA、1m o l/L N a C l)。

1 2 4 限制性片段长度多态性(RFLP)分析 植

294植物病理学报35卷

原体的16S r D NA PCR 产物的酶切分析,分别应用E co R I 、A l u I 、H in f I 、M sp I 、H a e Ⅲ和H pa Ⅱ六种限制性内切酶对PCR 产物进行酶解,37 水浴24h 使充分酶解。酶切产物经7 5%聚丙烯酰胺凝胶电泳(1 TAE buffer),银染法染色后在胶片观察灯下观察记录结果。

1 2 5 植原体16S r DNA 片段的序列分析及同源性比较 C W B 植原体16S r D NA PCR 产物经DNA 纯化试剂盒(北京鼎国生物技术发展中心)纯化后,送上海申友生物技术有限公司进行序列测定。

从G enB ank 中调出16种已知植原体的16S r DNA 序列,其中包括2种亲缘关系较近的MD 和Pa W B 植原体的16S r D NA 序列,应用DNAM AN 软件对所测C W B 植原体16S r DNA 序列与已知的植原体序列进行比较。

2 结果与分析

2 1 不同植物植原体株系间16S r DNA HM A

分析

应用适用于多种植物植原体的16S r D NA 通用引物P1对6种植物植原体DNA 进行PCR 扩增,电泳结果除重阳木丛枝未出现特异扩增带外,其余5种材料中均为阳性,PCR 产物片段大小为1 5kb 。至于重阳木丛枝未能用此通用引物扩增的原因尚不清楚。5种植物植原体16S r D NA 的HM A 分析结果显示:J W B 与Pa W B 、M D 、C W B 分别生成1至多条比同源双链电泳迁移率低的异源DNA 杂交双链;MD 、Pa W B 、C W B 三者间,J W B 和W J W B 之间,均未生成异源杂交双链;而来自三省的Pa W B 之间,J W B 之间均未发现异源杂交双链(图1、2)。并且不同植原体形成的异源杂交双链位置和条数有所不同。一般所形成的异源杂交双链电泳谱带强度明显低于原来的同源双链。这表明桑树萎缩病、泡桐丛枝病、苦楝丛枝病亲缘关系十分近,应属于同一个候选种;植原体16S r D NA HM A 分析不能区分不同来源的泡桐和枣树植原体间的差异,这与16S r D NA 的高度保守性相吻合;同时也表明所测定的样品中不存在Pa W B 与J W B

等的混合感染状况。

Fi g 1 16S rDNA HM A o f fi v e d iffe re n t p lan t

p hy to p l a sm a s

1:DNA m arker ;2-11:J W B and Pa W B ,J W B andW J W B ,J W B and M D,J W B and C W B,Pa W B and M D,Pa W B and W J W B,Pa W B and C W B,M D and CW B,W J W B and M D,W J W B and C W

B

Fi g 2 16S rDNA H M A o f JW B and Pa W B

from th re e d iffe re n t a re a s

1-3:Pa W B from t hree d i fferen t prov i nces (1:

Shandong

and Be iji ng ;2:Shando ng and Z he jiang ;3:Be iji ng and Z he -ji ang );4-6:J W B from t hree different pro v i nces (4:H ebe i and H enan ;

5:H ebe i and L iao ni ng;

6:H enan and L i ao-n i ng);7-9:W J W B from L iaon i ng and J W B from t hree d if -fe rent pro v i nces (7:H ebe;i 8:H enan ;9:L iaoni ng )

2 2 4种植物植原体间23S r DNA H M A 分析

应用P23S5F3/A23S3R3引物对5种植物植原体进行PCR 扩增,只有Pa W B 、J W B 、W J W B 、M D 为阳性,PCR 产物大小为2 8kb ,C W B 未有扩增带产生(图3)。对产生阳性扩增带的植原体23S r DNA 进行的HMA 分析,初步结果显示:Pa W B 与MD 、J W B 、W J W B ;M D 与J W B 、W J W B 间均能形成异源杂交双链,但W J W B 和J W B 间不能形成异源杂交双链(图4),说明植原体23S r DNA HM A 分析可以更精确地区分和鉴别植原体。一般认为,酸枣是枣疯病的野生寄主,根据本实验可进一步肯定二者应为同一种病原,故不形成异源双链,说明23S r DNA 在同种植物植原体群体内的保守性。

23S r D NA HM A 分析与16S r D NA HMA 分析相似,不同种植物植原体间形成的异源杂交双链也

295

4期李永,等:我国几种植物植原体的快速分子鉴别与鉴定的研究

有明显的不同,包括异源杂交双链形成的条数和异源杂交双链在丙稀酰胺凝胶上迁移率不同。植原体形成的异源杂交双链与同源双链间的距离可能与异源杂交双链间的同源性有关。2种植物植原体核苷酸序列同源性高时,与同源链的距离近,反之则变远。例如,M D 与Pa W B

。

Fi g 3 PCR am p lifi e d p ro du ct o f p hy to p lasm a

23S r DNA

1,7:

DNA m a rker ;

2-6:

P a W B,

J W B,M D,

CW B,

W J W

B

Fi g 4 H M A o f p hy to p l a sm a 23S r DNA

1-6:M D and W J W B,J W B and M D,

J W B and W J W B,

Pa W B and M D,Pa W B and W J W B,Pa W B and J W B;7:

DN A m a rker

2 3 植原体的16S rDNA 的PCR 产物RFLP

本研究使用6种限制性内切酶分别对5种植物植原体16S r D NA PCR 产物进行酶切,比较酶切图谱发现Pa W B 、C W B 和M D 植原体酶切图谱一致,而J W B 和W J W B 酶切图谱一致,说明这6种限制性内切酶也不能完全区分Pa W B 、M D 和C W B;J W B 与W J W B (图5、6),植原体16S r D NA PCR 产物酶切分析结果(表1)。

2 4 C W B 16S rDNA 序列测定结果及同源性

比较

对纯化的C W B 植原体16S r DNA PCR 产物进行DNA 序列分析,共测定了长1347个核苷酸(G enB ank 登录号为AY 859543),G +C 含量

47 2%,符合植原体16S r RNA 基因G +C 含量(47%~48%)。从G enB ank 中调出16种已知植原体的16S r DNA 序列进行同源性比较发现,C W B 与M D 同源性99 63%,两者间仅存在4个碱基差异和1个碱基缺失;C W B 与Pa W B 同源性为99 55%,两者间存在6个碱基差异;M D 与Pa W B 有99 30%的同源性,9个碱基差异;而Pa W B 与J W B 的同源性仅为88 73%(详细结果见表2),并构建了17种植物植原体进化树(图7)。由此推断,C W B 与M D 、Pa W B 应属于同一个组,而且C W B 与M D 植原体的亲缘关系十分近,应共属于

一个亚组。

Tab l e 1 Re strictio n s ite a na lys i s o f p hy to p lasm a s 16S r DNA

D isease

Enzym e (bp)

A l u I

H in f I

M s p I

Eco R I

H pa Ⅱ

H ae Ⅲ

Paulow n i a w itches -bro om (Pa W B )

190,240,400,500150,350,800210,280,900615,820210,280,900220,1000M ul berry dw arf (M D )

190,240,400,500150,350,800210,280,900615,820210,280,900220,1000Ch i naberry tree w itches -broom (C W B)

190,240,400,500150,350,800210,280,900615,820210,280,900220,1000Ju j ube w itche s -broom (J W B )80,150,250,710150,410,800200,500,750615,820200,500,750300,1000W ild j u j ube w itches -bro o m (W J W B)

80,150,250,710150,410,800200,500,750615,820200,500,750300,1000

N o te :A ll fi g ures in T ab l e 1are sizes o f 16S rDNA fragm ents (bp),t he f i gures are rounded to 10,and f i g ures l e ss than 50

bp are no t i nc l usi v e .

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植物病理学报35卷

Tab l e 2 Hom o l o g y m a trix o f 16S rDNA nu c leo tide sequ e nce s o f 17phy to p la sm a s

Phy t o-p l a s m a s

H om o l og y re lati on s h i p (%)

12

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

CW B 100.0M D 99 7100.0Pa W B 99 599 4100.0AY 99 499 299 1100.0AP 92 492 392 192 3100.0A s hY 80 780 880 480 780 7100.0B g W L 80 780 880 480 781 995 2100.0C P 81 181 180 881 180 997 095 3100.0C LY 81 581 581 381 381 794 695 495 4100.0EY 80 981 080 680 981 196 295 497 195 6100.0L f W B 81 681 781 381 782 195 995 396 394 996 2100.0M P V 96 496 396 196 092 380 781 681 382 180 681 3100.0P W B 89 589 489 489 689 579 880 980 081 479 680 690 1100.0Pp W B 80 280 279 880 681 393 194 293 193 693 493 181 080 9100.0RYD 80 880 980 581 082 095 098 295 595 395 295 381 481 393 8100.0SP 96 496 396 196 291 980 480 080 180 879 680 796 289 580 480 2100.0J

W B 80 7

80 8

80 4

80 7

81 1

96 0

95 0

96 6

95 1

98 9

95 9

80 5

79 4

93 4

95 0

79 3100.0

CW B :Ch i naberry tree w it ches -broom;M D:M ul berry d w arf ;P a W B:Paul ow n i a w itche s -broom;AY:A st e r y ell ow s ;

A P :A pp l e pro liferati on ;A s h Y:A s h ye ll ow s ;

B g W L:Berm uda grass w hit e leaf ;

C P :C lov er pro liferati o n ;CLY:C o-conut l e t ha l y ell ow;EY:E l m ye llow s ;L f W B :L oo fah w itches -broom;M PV:M ex i can per i w ink l e v ire scence ;P W B :Peanut w itches -bro om;Pp W B:P i g eo n pea w itches -broom;RYD:R i ce ye llow dw arf ;SP:S t o l bur phy top l a s m a ;J W B:Juj ube w itches -bro

om

Fi g 5 Re s tr i c ti o n d ig e s t o f 16S rDNA

1,12:DNA m arker ;2-6:Hpa Ⅱ,Pa W B,J W B,M D,CW B ,W J W B ;7-11:Ha e Ⅲ,P a W B,J W B ,M D,CW B,W J W

B

Fi g 6 Re s tr i c ti o n d ig e s t o f 16S rDNA

1,12:DN A m arke r ;2-6:A l u I ,Pa W B,J W B ,M D,CW B ,W J W B;7-11:H in f I ,Pa W B,J W B,M D,CW B,W J W

B

Fi g .7 De nd ro g ram o b ta i n e d by ana ly s i s o f

16S r DNA n uc leo tide seq ue nce from 17p hy to p lasm a s

G enB ank acce ssi o n nu m ber :A P (A J 430067);A sh Y (A F105315);AY (AY 389828);BgW L (AY 484406);C W B (AY 859543);C P (AF 363066);CLY (AY 572030);EY (AY 197658);L f W B (A F248956);M PV (A F248960);M D (AY 685056);Pa W B (AY 192577);PW B (L 33765);Pp W B (A F248957);RY D (D 12581);SP (A Y 725235);J W B (AY 197661)

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4期李永,等:我国几种植物植原体的快速分子鉴别与鉴定的研究

3 结论与讨论

目前国际上被普遍接受的植原体分类系统是根据16S r DNA限制性片段长度多态性分析(RFLP)和核糖体蛋白基因(r p)序列分析建立的。在目前国际植原体的分类系统中[12],Pa W B属于翠菊黄化组16Sr I-D,MD属于翠菊黄化组16Sr I-B,16Sr I-B(rp-B),J W B属于榆树黄化组16Sr V-B,16Sr V-B(rp-C),而未见有CW B分类地位的研究报道。国内曾有研究者根据16S r D NA的RFLP 将C W B归入翠菊黄化组中[13],本研究进一步通过HM A和序列分析对C W B进行比较鉴定,认为应归属于翠菊黄化组16Sr I-B的16Sr I-B(rp-B)亚组。值得思考的是C W B在16S r D NA序列上与同组的M D和Pa W B存在很高的同源性,是否暗示C W B为M D或Pa W B的株系之一,三者之间是否存在寄主范围的重叠或相似性,这都有待于生物学和进一步分子生物学实验证实。

植原体16S r D NA HM A分析,能很好地区分和鉴别组间植原体,但本实验未能区分同一亚组内的不同植原体和不同地区来源的同种植物植原体不同株系间的差异。RFLP分析和序列分析也证实HM A分析可以很好地用来区分和鉴别植原体。本实验选用材料数量较少,此方法能否用来区分不同来源的同种植物植原体,还需要进一步实验证实。植原体23S r D NA HM A分析初步结果暗示了能区分和鉴别植原体,例如能区分Pa W B与MD,因此推断23S r DNA H M A分析可以更精确地对植原体进行区分和鉴别,至少可以区分部分用16S r D NA HM A分析不能区分的植原体类型,例如MD与Pa W B。这在类似植原体的鉴别和鉴定上会有较大的意义和作用。与已报道的植原体HM A相关研究比较[9~11],过去报道采用的16S r DNA1 2kb的片段,选用9种植物植原体材料,均生成异源杂交双链,本研究应用了植原体16S r DNA的PCR产物大小1 5kb左右,发现Pa W B、M D和C W B,不能形成异源杂交双链。此外我们首次应用植原体23S r D NA PCR产物进行HMA分析。

植原体23S r DNA和16S r DNA序列在不同植原体间的保守性都较高,多用于种间分类鉴定,而进一步对植原体不同株系的区别需应用其它保守性较差的基因序列,例如rp基因[2]。所以,引物P23S5F3/A23S3R3也可以作为植原体的通用引物用于植原体的检测,G uo等应用此引物扩增20余种植物植原体病害均为阳性,而健康对照呈阴性,故可以同16S r DNA设计的通用引物一样用来检测植原体[8]。但从本实验结果看,5种植物植原体中仅使4种植物植原体扩增出特异片段,出现这种情况的原因尚不清楚。可能是由于23S r D NA的PCR片段较大(2 8kb),而增加了PCR扩增影响因素。因而,此引物对在植原体检测上应用价值及在扩增条件上的优化都有进一步探讨的空间。

植原体候选种内的16S r DNA序列差异较小,不同候选种间差异较大,因此不同候选种间植原体能形成异源双链,同候选种内同源性很高的植原体不能形成异源双链。由此可以根据植原体间能否形成异源双链,初步快速地确定植原体间的 亲缘 关系远近和大体归属于哪个候选种。从而为进一步选择比较鉴别植原体奠定了良好的基础。如果未知植原体与已知植原体间不形成异源杂交双链,说明此植原体可能与已知植原体属于同一个候选种。根据23S r D NA HMA分析,有可能对此植原体作到进一步鉴别。RFLP和16S r DNA序列分析可为最终确定其分类地位提供更充分的证据。这种从PCR、HM A到RFLP或序列测定的程序可以达到对未知植原体的准确和快速鉴别和鉴定。此外,单独应用HM A还可方便地对不同种类植原体感染同一寄主植物的情况加以检测。本研究对不同来源的Pa W B和J W B分别进行的HM A分析皆未发现异源杂交双链,说明至少在所采集的泡桐和枣树病样品中都未发现过去报道的植原体混和侵染现象。

由于植原体的16S r D NA序列很保守,用HM A、RFLP及测序手段可能都不能区分不同地区来源的泡桐和枣树植原体。对Pa W B不同株系间、W J W B植原体或品种枣J W B植原体间是否存在致病性、寄主范围及其它代谢调节基因变异,则需要开展植原体其它染色体或染色体外基因结构和功能的分析,从而为寻找其它针对性核酸分子标记奠定基础。

致谢:本研究在国家林业局森林保护学重点实验室完成。实验过程中得到了梁文星、郑翠和

王胜坤等同志的帮助,特致谢意。

298植物病理学报35卷

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责任编辑:杨晓昱

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