TCID50的测定方法 -

实验 病毒感染力的滴定（TCID50的测定）

滴度：在半定量或定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱。 滴度（抗体的多少）越高，受传染的机会就越小。

一、实验目的

了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。

二、测定病毒感染力的方法

半数致死量LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测 半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测

半数细胞培养物感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测 蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测

三、材料

1、长满单层的细胞1瓶 2、胰酶、吸球、吸管、生长液 3、96孔细胞培养板 4、加样器、枪头 5、病毒液（PRV） TCID50的操作步骤

1) 准备细胞

取出一块细胞培养板，每个孔大约传8000～10000个细胞（一个T25瓶的细

胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板，要传匀）。每个孔的细胞铺成单层大约60％丰度即可接种病毒（下午传好板第二天早上就能用）。

细胞对照选取16个孔即可。滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要窜孔。也可以分别在不同的细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致。 (2) 稀释待测病毒液。

A法为参考书上标准的操作方法 B法参照书将液体量减少后的结果

病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体，无论哪种都无血清。

A向每支试管中加入1.8ml病毒稀释液。向1号试管中加入0.2ml病毒，依次10倍系列稀释至适宜浓度，最后一支试管。

B在EP管中用无血清的孵育液10倍倍比稀释病毒原液(10-1，10-2…10-10等)，根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。首次滴定可以多稀释几个滴度。

根据接种的孔数稀释病毒，常规每个稀释度接种4孔，则每个稀释度配500μl，即10-1为50μl加入450μl的孵育液中；如每个稀释度接种8个孔，则各配制1ml，即10-1为100μl加入900μl孵育液中。若接种8个孔，则相应增加液体量。上述的配液并不是固定不变的，可以根据接种的量自行调整。 【！此步操作注意事项：

1）建议每个稀释度接种8个孔，若要统计分析则还要增加至16个孔。 2）病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。

2）此过程中需要使用加样器和tip头。使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌。使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）。】 (3) 接种

取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100μl，根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度（10-1，10-2 ）到原液加样。【切记：设置正常的细胞对照。每次实验要重复4次，计算标准差。】

37℃CO2培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液（从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔），加入维持液200μl继续在 CO2培养箱中培养。 (4) 培养

将培养板放置于CO2培养箱。培养温度37℃，培养5-7天。 (5) 测定结果

取出培养板，显微镜下观察细胞病变。

1、在离心管中用MEM将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-6。

2、将稀释好的病毒接种到96孔培养板中，每一稀释度接种一纵排，共8 孔，每孔接种100μl。

3、在每孔加入细胞悬液100μl，使细胞量达到2~3×105个/ml。

4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。（100μl生长液+100μl细胞悬液） 5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。 6、结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法。

五、TCID50的计算方法 PFUs=0.7×TCID50的滴度

1、Reed-Muench两氏法 病毒液稀释度 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 出现CPE孔数 8 8 7 3 1 0 无CPE孔数 0 0 1 5 7 8 累 计 CPE孔数 无CPE孔数 27 0 19 0 11 1 4 6 1 13 0 21 出现CPE孔所占的% 100（27/27） 100（19/19） 91.6 （11/12） 40（4/10） 0.7（1/14） 0（0/21） （CPE：Cytopathic effect细胞病变影响）

距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病

变率的百分数）

＝（91.6-50）/（91.6-40） ＝ 0.8

lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数 =0.8×(-1)+(-3) =-3.8 TCID50=10-3.8/0.1ml

含义：将该病毒稀释103.8接种100μl可使50%的细胞发生病变。

2、Karber法

病毒液稀释度 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

lgTCID50=L-D(S-0.5) L：最高稀释度的对数 D：稀释度对数之间的差 S：阳性孔比率总和 lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5) =-3.875 TCID50=10-3.875/0.1ml

含义：将该病毒稀释103.875接种100μl可使50%的细胞发生病变。

出现CPE的孔数 8 8 7 3 1 0 出现CPE孔的比率 8/8=1 8/8=1 7/8=0.875 3/8=0.375 1/8=0.125 0/8=0

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