论文模板健胃愈疡颗粒对胃溃疡大鼠胃组织核因子_B的活化和IL_8表达的影响

制端粒酶活性与阴性对照组比较差异也有统计学意义。低浓度(A 、B 组)作用72h 后BEL 7404/ADM 细胞均部分抑制端粒酶活性,但D DP 、M M C 在72h 可完全抑制端粒酶活性,其在组间比较差异有统计学意义。说明DDP 、M M C 能显著降低耐药细胞BEL 7404/A DM 的端粒酶活性,这也许是其有效抗癌的另一作用机理,这与临床上应用DDP 治疗肝癌取得良好效果相一致,其作用机理尚待深入研究。

端粒酶活性的抑制与耐药细胞对药物敏感性的提高,端粒、端粒酶活性与肿瘤的发生、发展及转归密切相关,端粒酶不但是新型的肿瘤生物标记物,而且成为肿瘤治疗的新靶点,目前已在尝试应用端粒酶抑制剂治疗肿瘤。本实验研究发现DDP 和M M C 对肝癌耐药细胞(BEL 7404/A DM )可抑制其生长增殖,并使端粒酶活性表达降低,这应引起临床重视,对有肿瘤耐药时作为选择有效抗癌药的参考。

参 考 文 献

1

姜 飚,韦长元,唐东平,等.A DM 诱导人肝癌细胞株多重抗药性的形成.广西医科大学学报,2001,18(6):771 773.2

N ason Bur chenal K ,M aer z W,A lbanel L ,et mon

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3

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广西医科大学学报 2006A pr ;23(2)

*基金项目:湖南省科技计划重点项目(No.02SS Y1005 4)收稿日期:2005 07 10

健胃愈疡颗粒对胃溃疡大鼠胃组织核因子 B

的活化和IL 8表达的影响

*

凌江红 李家邦 申定珠 蒋荣鑫

(中南大学湘雅医院中西医结合研究所 长沙 410008)

摘要 目的:探讨大鼠胃溃疡胃组织核因子 B(NF B)的活化及白细胞介素 8(IL 8)表达在健胃愈疡颗粒(JWY Y)胃黏膜保护机制中的作用。方法:将56只SD 大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、JWY Y 组,改良O kabe 法建立大鼠乙酸性胃溃疡模型,造模后第8天和第16天分别应用原位杂交法、免疫组化学法检测NF BmR NA 及其蛋白的表达和IL 8蛋白的表达。结果:造模第8天,模型组N F BmRN A 及其蛋白明显从细胞质移位于细胞核,与正常组(0 41 0 17、0 29 0 11)、假手术组(0 54 0 15、0 38 0 15)比较其核阳性反应的细胞密度增加(5 92 0 61、9 13 1 21,均P <0 01),IL 8表达增加(58 95 7 34v s 9 55 1 58、11 00 2 21,均P <0 01);应用JW YY ,NF BmR NA 及其蛋白的核移位被明显抑制,阳性反应细胞密度显著减低(3 77 0 59、5 37 0 99,均P <0 01),IL 8表达亦显著减低(22 34 8 39,P <0 01)。模型组第16天与第8天相比N F BmRN A 及其蛋白部分从胞核移出细胞质,其核阳性反应的细胞密度显著减低(2 42 0 51、4 18 0 94,均P <0 01),IL 8表达亦减低(15 72 2 67,P <0 01);JWY Y 组N F BmRN A 及其蛋白和IL 8表达(1 69 0 11、2 96 0 46、11 35 2 54)均不及模型组(分别P <0 05、P <0 05、P <0 01)。N F BmRN A 及其蛋白表达均与IL 8的表达呈正相关(r =0 809、r =0 808,均P <0 01)。结论:JW YY 抑制大鼠胃溃疡N F B 的活化进而抑制炎症反应可能是其胃黏膜保护作用的机制之一。

关键词 NF B;白细胞介素 8;胃溃疡;化学诱导;中成药中国图书资料分类法分类号 R285 5

EFFEC T OF JIANWEIYUYANG GRANULES

ON AC TIVATION OF NF B AND EX PRESSI

191 韦长元,等 不同化疗药物对人肝癌耐药细胞BEL 7404/A DM 端粒酶活性抑制的研究

ON OF IL 8IN RATS WITH GASTRIC ULC ER

Ling Jiang hong,Li Jiabang,Shen Ding zhu,et al.(Institute of Integrated T raditional Chinese and West Medicine,Xiangya H ospital,Centr al South Univer sity,Changsha410008China)

Abstract Objective:To inv estig ate the effect o f Jianw eiyuyang granules(JWYY)on activation of nuclear B(NF B)and the ex pr ession o f IL 8in r ats w ith g astric ulcer,and to discuss the probable mechanism of its g astric m ucosa protective effect.Methods:56SD rats w ere random ly div ided into4g roups:norm al gro up,sham operation g roup,model g roup,and JWYY g roup.T he g astric ulcer w as induced in the r ats by acetic acid acco rding Okabe's m ethod w ith some mo dification.Im munohisto chem istry(IH)and In Situ H y bridization H istochemistr y(ISH)w er e used to detect the expressio n of NF Bm RNA and its pro tein as w ell as IL 8protein in the sto mach.Result:The8th day after the model w as made,NF BmRNA and its protein w ere significantly translocated fro m the cytoplasm into the nucleus,how ever,NF BmRNA and its protein remained in the cy to plasm of gastr ic epithelium in normal and sham oper ation gr pared to the nor m al g roup(0.41 0.17,0.29 0.11)、sham o peratio n g roup(0.54 0.15,0.38 0.15),their cell density of positiv e reactio n in nucleus increased(5.92 0.61,9.13 1.21,all P<0.01),so did IL 8pro tein(58.95 7.34vs9.55 1.58,11.00 2.21,both P<0.01).NF BmRNA and its pr otein significantly shifted out fro m nucleus to cytoplasm on the16th days.Cell density of po sitive reaction w as observed decreasing in NF BmRNA and its pro tein(2.42 0.51,4.18 0.94,both P<0.01)as w ell as IL 8(15.72 2.67,P<0.

01).The ex pr ession of NF BmRNA and its protein as w ell as IL 8in JWYY gro up(1.69 0.11,2.96 0. 46,11.35 2.54)w ere sig nificantly low er than those of the model gr oup(P<0.05,P<0.05,P<0.01). There w as a sig nificant positive cor relation betw een ex pression of NF BmRNA,its pr otein and IL 8(r=0. 809,r=0.808,both P<0.01).Conclusion:T he activation o f NF B and the fo llow ing inflamm ator y reac tion m ay be one of the pathogenesis of acetic acid induced gastr ic ulcer.JWYY inhibits the inflam matory reactio n by inhibiting the NF B activatio n,w hich m ay be o ne of the mechanisms of its gastr ic muco sa pro tective effect.

Key words NF B;inter leukin 8;g astric ulcer;chem ically induced;Chinese patent drugs

炎症反应在消化性溃疡的发生和愈合中起着重要作用[1]。核转录因子 B(N F B)与炎症反应密切相关[2]。白细胞介素 8(Inter leukin 8,IL 8)是炎症反应的重要介质,其启动子和增强子中含有 B位点,活化的N F B可调控其基因的诱导表达。已有实验表明N F B的激活参与胃溃疡的组织损伤[3]。健胃愈疡颗粒(JWY Y)是治疗消化性溃疡的有效成药[4,5],其机制还不完全清楚。为此,本研究复制乙酸性胃溃疡模型,探讨N F B及IL 8在JW YY胃黏膜保护机制中的作用。

1 材料与方法

1 1 动物:清洁级SD大鼠56只,雌雄各半,体重150~200g,由广西医科大学实验动物中心提供,并在该中心饲养。

1 2 药物、试剂与主要器材:JW YY:湘雅制药集团公司产品,批准文号:国药准字Z10960018。NF kappa B/p65(Rel A)A b 1兔多克隆抗体为美国L ab V isio n公司产品。即用型快速免疫组化M ax V isio n试剂盒(主要成分辣根过氧化物酶标记的多聚羊抗兔Ig G)、R 二联氨苯胺(D AB)显色试剂盒:福建迈新公司。I L 8兔多克隆抗体、N F Bp65mR NA原位杂交试剂盒(地高辛标记的寡核苷酸探针)、原位杂交专用盖玻片及多聚赖氨酸处理过的载玻片均购自武汉博士德生物工程公司。病理图像分析仪(DM R+Q550):德国莱卡。

1 3 方法

1 3 1 实验分组、造模与取材:将56只大鼠随机分为4组,即正常对照组(12只)、假手术组(12只)、模型组(16只)、JWY Y组(16只)。各组又各有半数大鼠分别为溃疡诱导8、16d亚组。采用改良Okabe乙酸涂抹法制作大鼠实验性胃溃疡模型[5],假手术组用生理盐水代替乙酸。术后24h开始灌胃。JWY Y组予JWY Y药液(蒸馏水配制,浓度为0 16

2 g/ml),其余各组灌服蒸馏水,量均为10ml/kg d-1。分别于造模8、16d分2批处死大鼠,剖腹分离鼠胃。在造模处即胃前壁胃小弯角切迹下剪取含溃疡大小约1cm!1cm胃组织,无溃疡则在相同部位取材,4%多聚甲醛固定,常规脱水、透明、石蜡包埋,4 m厚切片。

1 3

2 原位杂交检测:针对p65靶基因的mR N A序列为: 5? A G CG G GG CA T GCGCT T CCG C T A CA A GT GCG 3?; 5? G CCA G AT A CA GA CGA T CGT C A CCG G A T T G A 3?; 5? G CT GA T GG AG T A CCC T GA GG CT AT A A CT CG 3?。操作按说明书。杂交液按1#3稀释。

192广西医科大学学报 2006Apr;23(2)

1 3 3 免疫组织化学染色:石蜡切片置60?的烤箱5~6h 后,主要步骤如下:切片常规脱蜡至水,3%过氧化氢 甲醇室温下孵育10min,以阻断内源性过氧化物酶的活性,高压加热方法修复抗原,滴加一抗(NF B、IL 8工作浓度分别为1#150、1#100),4?过夜,滴加即用型M ax V ision试剂,室温15min,滴加链酶亲和素生物素复合体(SA BC),室温30m in,DA B显色,镜下控制反应时间,充分水洗,苏木素轻度复染,脱水、透明、封片。以P BS代替一抗作为阴性对照。

1 3 4 结果判断及统计学方法:由于N F BmR NA及其蛋白在激活情况下是位于核内的,故以胞核出现棕褐色颗粒为阳性表达。IL 8以细胞质出现棕黄色染色为阳性表达。以病理图像分析仪进行图像分析,测量阳性反应的细胞密度(即阳性反应细胞面积/测量框面积),所测数据以x s表示。采用SPSS13 0统计软件对数据进行处理,多组间比较用One Way AN O VA进行分析,方差齐采用L SD方法,方差不齐采用T amhane%s T2。两样本均数的比较用independent Sam ples T T est分析。相关分析采用非参数统计方法,计算Spearman相关系数。

2 结 果

2 1 各组大鼠胃组织NF BmR NA的表达

2 1 1 核移位分析:正常组和假手术组大鼠胃黏膜层上皮细胞胞质呈浅棕色或棕色,固有层间质细胞、黏膜肌层以下各层无明显染色,提示正常和假手术组N F BmRN A未被激活。而造模后第8天,模型组大鼠胃溃疡边缘黏膜固有层腺上皮细胞和间质细胞及肉芽组织炎症细胞胞核内见大量棕色颗粒,细胞质淡染或无染色,提示N F BmRN A明显从细胞质移位于细胞核。JW YY组颗粒状的胞核染色不及模型组。第16天,模型组再生黏膜上皮细胞即有细胞核染色又有细胞质染色,提示随着溃疡愈合,愈合溃疡再生黏膜部分NF BmR N A从细胞核移出细胞质,与此时P65具有失活和活化两种状态一致。JW YY组再生黏膜固有层上皮细胞细胞质染色为主,少量腺上皮细胞和间质细胞胞核染色。

2 1 2 N F BmRN A表达阳性反应的细胞密度:见表1。

表1 N F BmRN A在不同时间点胃组织的表达(x s)

组别n 阳性反应的细胞密度(%) 8d 16d

正常组60 41 0 170 49 0 18

假手术组60 54 0 15#0 52 0 13#

模型组85 92 0 61&2 42 0 51&?

JW YY组83 77 0 59&(1 69 0 11&*

注:与正常组比较,#P>0 05;与正常组、假手术组比较,&P<0 01;与模型组比较,(P<0 01,*P<

0 05;与同组8d比较,?P<0 01

2 2 各组大鼠胃组织NF B蛋白的表达

2 2 1 核移位分析:在正常和假手术组大鼠胃组织胃黏膜层上皮细胞细胞质呈均匀浅棕色染色,固有层间质细胞、黏膜肌层以下各层无明显染色。造模8d,模型组溃疡边缘黏膜固有层上皮细胞、间质及肉芽组织炎症细胞呈胞核染色,表明N F B蛋白已被活化,反映了炎症刺激激活后核移位的现象。造模16d,随着溃疡愈合,N F B蛋白从胞核移出细胞质,愈合溃疡胃组织既有细胞质染色,又有胞核染色;JW YY组在第8天、第16天两个不同时间点的核染色均不及模型组。

2 2 2 N F B蛋白表达阳性反应的细胞密度:见表2。

表2 N F B蛋白在不同时间点胃组织的表达(x s)组别n

阳性反应的细胞密度(%)

8d 16d 正常组60 29 0 110 27 0 09

假手术组60 38 0 15#0 39 0 12#

模型组89 13 1 21&4 18 0 94&?

JWY Y组85 37 0 99&(2 96 0 46&*

#P>0 05;与正常组、假手术组比较,&P<0 01;与模型组比较,(P<0 01,*P<

0 05;与同组8d比较,?P<0 01

2 2

3 各组大鼠胃组织IL 8蛋白的表达:IL 8蛋白表达主要位于黏膜上皮细胞细胞质,呈棕黄色染色。在正常胃黏膜及黏膜下层呈弱表达,造模第8天,模型组溃疡边缘黏膜底部及肉芽组织表达明显增多,JWY Y组表达不及模型组。16d后,模型组仍有少量表达,JW YY组的表达则降低至正常水平。图象分析结果见表3。

表3 IL 8蛋白在不同时间点胃组织的表达(x s)

组别n

阳性反应的细胞密度(%)

8d 16d 正常组69 55 1 5810 38 1 64

假手术组611 00 2 21#10 62 1 89#

模型组858 95 7 34&15 72 2 67&?JW YY组822 34 8 39*)11 35 2 54)# 注:与正常组比较,#P>0 05;与正常组、假手术组比较,&P<0 01,*P<0 05;与模型组比较,)P<

0 01;与同组8d比较,?P<0 01

2 2 4 NF B表达与IL 8表达的相关性:N F BmRN A及其蛋白阳性反应细胞密度均与IL 8蛋白阳性反应细胞密度呈正相关,分别为r=0 809、r=0 808(均P<0 01)。

3 讨 论

幽门螺杆菌(Helicobact er py lo ri,H p)和非甾体抗炎药(non stero ida l anti inflammator y drugs,NSA IDs)是导致消化性溃疡重要致病因素,二者都能通过诱导中性粒细胞浸润引起胃黏膜炎症反应包括炎症细胞因子如T N F 和ILs的表达,从而导致胃损伤[1]。在大鼠腹腔内或皮下注射I L 1!或T N F ,48h后可在已愈合的乙酸性胃溃疡的同一部位引起

193

凌江红,等 健胃愈疡颗粒对胃溃疡大鼠胃组织核因子 B的活化和IL 8表达的影响

溃疡复发,而抗中性粒细胞血清或抗体能完全阻止复发[6];减少中性粒细胞浸润和抑制炎症细胞T N F 产生的P ento x ifylline能加速乙酸诱导的大鼠胃溃疡的愈合[7]。可见炎症反应是影响溃疡发生、愈合乃至复发的重要机制之一。

NF B是参与炎症反应的一个重要转录因子,广泛存在于真核细胞中。正常情况下N F B多为p65和p50两个亚单位组成的异源二聚体,在未受刺激的细胞中,它与 B抑制蛋白(I B)结合以非活性状态存在于细胞质中,当其受氧自由基、内毒素、细胞因子等的刺激后被激活,导致N F B快速从细胞质移位进入细胞核内,结合在被诱导基因启动子序列上特异的 B,调控相应的靶基因表达,如调控前炎症介质(如T N F 、IL 1和IL 6)、黏附分子、趋化因子(如单核细胞趋化蛋白 1和IL 8)和一些炎性相关酶类的过度或持续表达,而使大量的炎性细胞积聚浸润于炎症部位,导致持续或放大的炎症反应[8]。大量证据表明,胃上皮细胞在H p攻击诱导下产生IL 8,其过程伴随着N F B的活化[9,10],IL 8表达水平与N F B活性相关;p50反义寡核苷酸(抑制N F B p50亚基的翻译)转染A DS细胞可阻滞H p诱导的IL 8的表达[11]。NF B及其调控的IL 8在与人类消化性溃疡相似的乙酸性胃溃疡中的表达尚未见报道。

本研究从基因和蛋白两个层次分析了乙酸性胃溃疡大鼠胃组织N F B的核移位情况,并半定量分析其表达量以及检测了IL 8蛋白的表达。结果显示,溃疡诱导后8d,N F B 明显从细胞质移位于细胞核内,核表达量增加,IL 8的表达量也显著增加,二者表达呈正相关。这表明在乙酸性胃溃疡中N F B被激活,后者可能引起其调控的靶基因IL 8表达增加,进一步产生炎症反应从而加重黏膜损伤最终导致溃疡的发生。溃疡诱导后16d,随着溃疡愈合部分N F B从细胞核移出细胞质,其核表达量及IL 8表达亦降低,这表明炎症反应至一定程度,可能经负反馈调节NF B渐失活,炎症细胞因子及其炎症反应随之减轻而终至自行愈合,这可能是乙酸性胃溃疡自愈的机制之一。应用JWY Y后,能明显抑制乙酸性胃溃疡诱导后的N F B的活化和IL 8的表达,提示JW YY的黏膜保护机制可能与抑制NF B的活化,进而抑制炎症反应有关。

JW YY由柴胡、党参、白芍、延胡索、白及、珍珠粉、青黛、甘草等组成。方中柴胡疏肝理气能调节下丘脑 植物神经功能,抑制迷走神经兴奋,党参健脾益气可提高机体免疫功能,二药合用通过调节神经免疫网络,扶正固本而消炎;元胡理气活血,能使周围的血流量和氧供增加,改善胃黏膜血循环,促进炎症吸收。珍珠层粉、白芨敷局部能祛除糜烂,收敛生肌改善胃部炎症保护胃黏膜,防止H+反向弥渗,青黛清泄郁热兼能制酸,白芍、甘草抑制胃酸、胃蛋白酶活性。全方通过调节神经免疫,改变局部微环境,从而改善胃部炎症,保护胃黏膜,有效的治疗消化性溃疡。结合既往研究结果JWY Y对T N F [12]、IL 1![13]均有抑制作用,推测JW YY的黏膜保护作用与其能抑制N F B活化及其诱导的炎症细胞因子网络从而抑制炎症反应有关。

参 考 文 献

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194广西医科大学学报 2006Apr;23(2)

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/rih4.html