实验二粗蛋白的测定(最新整理)

实验二饲料粗蛋白的测定

一、实验目的

通过饲料样品中粗蛋白质的测定，让学生了解了解凯氏定氮法测定的基本原理，掌握

半微量凯氏定氮法测定饲料粗蛋白质的方法，掌握粗蛋白质含量的计算方法。

二、实验原理

各种饲料的有机物质在还原性催化剂(如CuSO4，K2SO4或Na2SO4或Se粉)的帮助下，用浓硫酸进行消化作用，使蛋白质和其它有机态氮（在一定处理下也包括硝酸态氨）都转

变成NH4+并与H2SO4化合成（NH4）2SO4，而非含氮物质，则以CO2 ↑，H2O↑，SO2↑状态逸出。消化液在浓碱的作用下进行蒸馏，释放出的铵态氮，用硼酸溶液吸收之并与之

结合成为四硼酸铵，然后以甲基红溴甲酚绿作指示剂，用HCl标准溶液（0.1mol/L）滴定，求出氮的含量，根据不同的饲料再乘以一定的系数（通常用6.25系数计算），即为粗蛋白

质的含量。

其主要化学反应如下：

1、2NH4（CH2）2COOH+13H2SO4→（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2（丙氨酸）

2、（NH4）2SO4+2NaOH→2NH3+3H2O+2Na2SO4

3、4H3BO3+ NH 3→NH4HB4O7+5H2O

4、NH4HB4O7+HCl+5H2O→NH4C1+4H3BO3

本法不能区别蛋白氮和非蛋白氮，只能部分回收硝酸盐和亚硝酸盐等含氮化合物。在

测定结果中除蛋白质外，还有氨基酸、酰胺，铵盐和部分硝酸盐、亚硝酸盐等，故以粗蛋

白质表示之。

三、实验设备

1、实验室用样品粉碎机或研钵；

2、分析筛：孔径0.45mm(40目)；

3、分析天平：感量0.0001g；

4、消煮炉或电炉；

5、滴定管：酸式，25或50ml；

6、凯式烧瓶：100或500m1；

7、凯氏蔗馏装置：常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式；

8、锥形瓶，150或250m1；

9、容量瓶：100ml。

三、实验内容

1、称取0.5～1g 试样（含氮量5～80mg ）准确至0.0002g ，无损失地放入凯氏烧瓶中，加入硫酸铜0.9g ，无水硫酸钾（或硫酸钠）15g ，与试样混合均匀，再加硫酸25ml 和2粒玻璃珠，在消煮炉士小心加热，待样品焦化，泡沫消失，再加强火力（360～410℃）直至溶液澄清后，再加热消化15min 。

2、氨的蒸馏

（1）常量直接茂馏法 将上述的试样消煮液冷却，加蒸馏水200ml ，摇匀，冷却。沿瓶壁小心加入40％氢氧化钠溶液100ml ，立即与蒸馏装置相连．蒸馏装置冷凝管的末端应浸入50ml 硼酸吸收液lcm 。加混合指示剂2滴，轻摇凯氏烧瓶，使溶液混匀，加热蒸馏，直至馏出液体积约150ml 。先将吸收液取下，再停止加热。

（2）半微量水蒸汽蒸馏法 上述试样的消煮液冷却，加蒸馏水20m1转入100ml 容量瓶，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，为试样分解液。取2％硼酸溶液20ml ，加混合指示剂2滴，使半微量蕉馏装置的冷凝管末端浸入此溶液；蒸馏装置的蒸汽发生器的水中应加甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，且保持此液为橙红色，否则应补加少许硫酸。准确移取试样分解液10～20ml 注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加10ml40％氢氧化钠溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，并在入口处加水封密好，防止漏气，蒸馏4min ，使冷凝管末端离开吸收液面，用蒸馏水洗冷凝管末端，洗液均流入吸收液。

3、滴定 用硼酸吸收氨后，立即用0.05mol/L 的HCI 标准溶液滴定，仍以甲基红或混合甲基红为指示剂。

在测定饲料样本中含氮量的同时，应做一空白对照测定，即各种试剂的用量及操作步骤完全相同，但不加样本，这样可以校正因药品不纯所发生的误差，吸收氨后的吸收液立即用0.05mol/L 盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变为灰红色为终点。

4、空白测定

称取蔗糖0.0lg ，以代替试样，按上述测定步骤进行空白测定，消耗0.05mol/L 盐酸标准溶液的体积应不得超过0.3ml 。5、计算

每m1的lmol/L 盐酸标准溶液相当于0.0140g 的N 。因此， 10025.60140.0)((%)25.6%'12?????-==?v

v m c v v N 粗蛋白质 式中：v 2—试样滴定时所需酸标准溶液的体积（m1）；

v 1—空白滴定时所需酸标准溶液的体积(m1)；

c—盐酸标准溶液的浓度(mol/L)；

m 一试样的质量（g ）；

v —试样的分解液总体积（ml ）；

v’—试样分解液蒸馏用体积（m1）；

0.0140—每ml HCl 标准溶液相当于N 的克数； 6.25一氮换算成蛋白质的平均系数。

每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。 当粗蛋质含量在25％以。

上，允许相对偏差为1％；当粗蛋白质含量在l0％～25％时，允许相对偏差为2％；当粗蛋白质含量在10％以下时，允许相对偏差为3％。

测定步骤的检验精确称取0.2g硫酸铵，代替试样，按测定步骤文字中的各步骤操作，并按公式计算（但不乘系数6.25），测得硫酸铵含氮量为21.19±0.2％，否则应检查加碱，蒸馏和滴定各步骤是否正确。

试样消煮时，加入硫酸铜0.2g，无水硫酸钠2g，与试样混合均匀，再加硫酸10ml，仍可使饲料试样分解完全,只是试样焦化再变为澄清所需时间要略长些。

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