改进的PMP柱前衍生化方法用于单糖的组成分析

Vol.27

2006年8月高等学校化学学报　　　　　　CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES　　　　　　No.81456～1458

[研究简报]

改进的PMP柱前衍生化方法用于

单糖的组成分析

林　雪,王仲孚,黄琳娟,白　泉,贾敬芬

共建教育部重点实验室,2.分离科学研究所,西安710069)

关键词　HPLC;12苯基232甲基252吡唑啉酮(PMP);衍生化;糖

中图分类号　O658　　　　文献标识码　A　　　　文章编号　025120790(2006)082145620311121(1.西北大学生命科学学院,陕西省生物技术重点实验室,西部资源生物与现代生物技术省部

单糖组成分析是糖结构分析的一项重要内容.上紫外或荧光基团,用HPLC进行分离,,、进样量少、检测限低及多模式等特点.

PMP(12苯基232甲基252吡唑啉酮)NaOH溶液中[1～3],LC的检测及分析,但会降低质谱检测的灵敏度,,这样不仅简化了衍生化反应的后处理过程,,省去了质谱分析前的脱盐处理过程.本研究建立了5种常见单糖的分析分离模式,对其进行质谱分析,用所建立的方法对标准二糖及3种多糖样品中的单糖组成进行了分析,取得了满意的结果.

1　实验部分

1.1　仪器与试剂　Waters269522996型高效液相色谱仪,色谱柱(SymmetryC18,5μmi.d.,319mm×150mm,美国Waters公司);基质辅助激光解析电离质谱仪(MALDI2TOF2MS,日本岛津公司).

12苯基232甲基252吡唑啉酮(PMP)、鼠李糖(Rha)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、乳糖(Lac)及三氟乙酸(TFA)(分析纯,上海医药集团);乙腈(色谱纯,Fisher公司);氢氧化钠、醋酸铵、冰醋酸及三氯甲烷(分析纯,天津化学试剂厂).

螺旋藻多糖样品SPPA21,SPPB21和SPPC21为本实验室提取、纯化.

1.2　实验过程　(1)衍生化标记.以氨水作碱液对样品进行标记:分别称取甘露糖、葡萄糖及半乳糖各010180g,鼠李糖010164g,木糖010150g,溶于5mL氨水中,取该溶液100μL,与100μL的PMP/甲醇溶液(015mol/L)混合,在70℃下反应30min.取出后冷却至室温,加入115mL纯水,真空[4,5]干燥,重复2次.干燥后的物质用1mL纯水及1mL氯仿溶解,充分振荡后除去有机相,重复3次.水相溶液以13000r/min的速度高速离心2min后,用水稀释20倍,进行HPLC分析.

(2)标准双糖与多糖的水解.分别称取乳糖及螺旋藻多糖SPPA21,SPPB21及SPPC21各2mg,加入2mol/L的TFA溶液1mL,封管,于121℃水解2h后,将样品真空干燥.

(3)标准双糖与多糖水解物的衍生化及分析.将水解后的乳糖与多糖按上述衍生化方法进行衍生收稿日期:2005212202.

基金项目:国家重点基础研究发展计划项目(批准号:2004CB520802)和陕西省重点实验室重点科研发展计划项目(批准号:05JS49)资助.

联系人简介:王仲孚(1971年出生),男,博士,副教授,从事糖生物学与糖工程学研究.E2mail:wangzhf@

　No.8　林　雪等:改进的PMP柱前衍生化方法用于单糖的组成分析1457化处理,按文献[3]的方法计算其摩尔比.

2　结果与讨论

2.1　糖的衍生化　文献[2]用NaOH溶液对单糖进行PMP衍生化时(013mol/LNaOH,70℃),在衍生化反应结束后,用盐酸中和是一个重要的步骤.而本文用氨水代替NaOH,用PMP对糖类物质进行标记,反应后不需酸中和,而是加入纯水后,通过真空干燥除去过量的氨水,使待测样品达到中性,简化了反应步骤,5种常见单糖衍生物得到很好的分离.其结果见图1(A)

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Fig.1　HPLC2UVchromatogramsofthePMPiveiandlactosehydrolysa(A)Peaks:1.Man;2.4.()Glc;2.Gal.Mobilephase:acetate

(0=5(o∶22);flowrate:1mL/min;UVdetection:245nm.

2.2　PMP衍生化方法由于用盐酸中和NaOH时产生了大量的盐,而盐会影响MALD2MS[图2(A)],需要在进行质谱分析前进行脱盐处理.用氨水代替NaOH作溶液的另一显著的优点是无需进行样品脱盐处理便可直接进行质谱检测,这样不仅不会影响质谱检测的灵敏度[图2(B)],而且减少了样品(尤其是微量样品)的损失

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Fig.2　MALDI2MSspectraofglucose2PMPderivatives

(A)Aqueoussodiumhydroxidesolutionwasusedasthebasemedium;(B)liquidammoniasolutionwasusedasthebasemedium.

2.3　最佳衍生化条件的选择　用氨水取代NaOH作溶液,以葡萄糖为基准物质,分别探讨了衍生化反应过程中所涉及的3个主要因素,最后确定了最佳反应时间为30min,最佳反应温度为70℃,最佳摩尔比为5∶1.

2.4　衍生化产物的HPLC分离方法的建立　分别考察了衍生产物的线性关系、最小检测限以及进样精密度和衍生化方法的重复性.单糖衍生物在较宽的浓度范围内具有良好的线性关系,而且无论是进样精密度还是方法重复性的峰面积的标准偏差值均小于3%,因此,在用氨水替代NaOH溶液的PMP柱前衍生化方法适用于单糖及多糖的单糖组成分析.

2.5　多糖样品的糖组成分析　乳糖水解后经衍生化得到的HPLC图谱见图1(B),经计算可以得到葡萄糖与半乳糖的摩尔比为0197∶1,基本符合1∶1的要求,由此可见,利用本文中的衍生化方法可以进

1458高等学校化学学报　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.27　行多糖的单糖组成分析.同时还对螺旋藻多糖SPPA21,SPPB21及SPPC21水解样品进行了衍生化分析,并采用112节中的方法求出各单糖间的摩尔比.3种多糖的单糖组成摩尔比与文献[4,5]中报道的结果一致.

3　结　　论

本文建立的糖类物质衍生化方法具有广阔应用前景,还可以用于碱性β消除反应解离O2寡糖链,对结构糖生物学研究有重要意义.

参　考　文　献

[1]　FuD.,ZopfD..Anal.Biochem.[J],1999,269:113—123

[2]　XUJin(徐　瑾),ZHANGLing2Yi(张凌怡),LITong(李　彤)etal..ChineseJournalofChromatography(色　谱)[J],2003,

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[3]　MADing2Yuan(马定远),CHENJun(陈　君),LIPing(李　萍)etal..ChineseJournalofAnalyticalChemistry(分析化学)[J],

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[4]　WANGZhong2Fu(王仲孚),PENGZhi2Ying(彭志英),HUANGLin2Juan(黄琳娟)etal..ActaPharmaceuticaSinica(药学学报)

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[5]　WANGZhong2Fu(王仲孚),PENGZhi2Ying(彭志英),HUANGLin2Juan(黄琳娟)etal..ChineseJournalDrugs(中国海洋

药物)[J],2001,(3):17—19

AnImprovedPMPDerig

ion

Xue2Fu13,HUANGLin2Juan,BAIQuan,JIAJing2Fen211

(1.LifeScienceCollege,KeyLaboratoryofMinistryofEducationforWestern

ChinaResourceBiologyandBiotechnology;

2.InstituteofModernSeparationScience,NorthwestUniversity,Xi′an710069,China)

Abstract　Animprovedcarbohydratederivatizationmethodemploying12phenyl232methyl252pyrazolone(PMP)wasdevelopedinthisstudy.Liquidammoniawasusedinsteadofsodiumhydroxideaqueoussolutiontoprovidethebasemediumforthederivatizationreaction.DerivatizationreactionandHPLCseparationconditionswereoptimized,includingreactiontime,reactiontemperatureandPMPconsumption.Thederivativesoffivereduc2ingmonosaccharideswerewellseparatedbyHPLC.Becauseweemployedammoniainsteadofsodiumhydro2xide,theexcessivevolatileammoniacanberemovedbyvacummdrying,thesederivativescouldbedirectlyanalyzedbyMALDI2TOF2MSwithoutdesaltingprocedure,possessingpotentialapplicationformonosaccharideandoligosaccharideseparationandsubsequentMSanalysis.ThismethodnotonlyincreasedtheMSdetectionsensitivity,butalsodecreasedsamplewastesduringpurification.Wesuccessfullyappliedthismethodtomo2nosaccharidecompositionanalysisofpolysaccharidesSPPA21,SPPB21andSPPC21purifiedfromSpirulinaPlatensis.

Keywords　HPLC;12Phenyl232methyl252pyrazolone;Derivatization;Saccharide

(Ed.:A,G)

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/rgnm.html