pH_stat法和早醛滴定法测定大豆蛋白水解度准确性比较

pH_stat法的详细介绍

食品工业科技　　ScienceandTechnologyofFoodIndustry　　

分析检测

pH-stat法和早醛滴定法

测定大豆蛋白水解度准确性比较

姚玉静,崔　春,邱礼平,陈黎斌

(11广东食品药品职业学院,广东广州510520;21华南理工大学轻工与食品学院,广东广州510640)

摘　要:比较了pH-stat法和甲醛滴定法测定大豆蛋白的水解度的准确性,结果表明,水解时,两者测定结果接近;采用外切蛋白酶进行水解时,pH-stat,、二肽和三肽的解离系数高于多肽。关键词:酶解,水解度,测定

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Determinationofysfsoyprotein:acomparison

dsfstatandformol-titration

Yu-jing,CUIChun,QIULi-ping,CHENLi-bin

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(11Department,GuangdongFoodandDrugVocationalCollege,Guangzhou510520,China;21CollegeofLightIndustry&Food,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou510640,China)

Abstract:ThetwomethodsofpH-statandformol-titrationwerecomparedtodeterminedegreeofhydrolysisofsoyprotein1Theresultshowedthatthetwomethodshadthesimilardatawhenendoproteasewasusedtohydrolysesoyprotein1ThepH-statmethodhadalowerdatawhenexoproteasewasused1Thereasonwasthatthedissociationcoefficientoffreeaminoacid,di-peptide,tri-peptidewashigherthanthatofpeptide1

Keywords:zymolysis;degreeofhydrolysis;determination

中图分类号:TS201121　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1002-0306(2008)09-0268-03　　水解度(degreeofhydrolysis,DH)是衡量蛋白质

水解程度的指标,一般指蛋白质分子中由于生物的或化学的水解而断裂的肽键占蛋白质分子中总肽键的比例

[1,2]

+

。水解后的蛋白质的一些功能性质发生了

改变,如溶解性、乳化性质、发泡性质等,因而可广泛应用于食品工业。但在蛋白质的酶水解过程中,蛋白质水解程度的控制是十分重要的参数,因为过度水解会产生苦味,使蛋白质的风味改变,影响水解蛋白在食品中的应用。如对大豆蛋白而言,310%的水

收稿日期:2007-12-04

作者简介:姚玉静(1979-),女,博士研究生,讲师,研究方向:蛋白质

化学与工程。

基金项目:广东食品药品职业学院院级资助项目(2005009)。

解度能显著提高蛋白质的溶解性和乳化性,而无苦

味产生。因此,为了获得理想的风味和功能特性,必须严格控制蛋白质的水解度。测定蛋白质水解度的方法很多,都是依据以下三个原则:测定释放出的质子、测定水解过程中释放的氮以及测定水解过程中释放的自由α-氨基。目前常用采用测定蛋白质水解度的方法有甲醛滴定法、对苯二醛法(OPA)、三硝基苯磺酸法(TNBS)和pH-stat法等,其中甲醛滴定[3～5][6,7]法和pH-stat法在国内最为常用。然而,鲜有报道比较过甲醛滴定法和pH-stat法的准确性,有鉴于此,本文分别采用内切蛋白酶和外切蛋白酶水解大豆蛋白,并用pH-stat法和甲醛滴定法同时测定大豆蛋白水解的水解度,以比较其准确性。

1　材料与方法

[3]刘海兵1高级醇对啤酒风味的影响及其在啤酒生产中的

参考文献:

[1]KunzeW著,湖北啤酒学校翻译组译1啤酒工艺实用技术[M]1北京:中国轻工业出版社,19981

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究[J]1河南科学,2007(1):54～571　　　　2682008年第09期

控制措施[J]1酿酒,2005(1):54～551

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[5]余晓红,陈洪兴1啤酒酵母代谢副产物高级醇的影响因素研究进展[J]1酿酒科技,2006(10):78～811

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分析检测

111　材料与设备

大豆分离蛋白　哈尔滨黎明大豆分离蛋白厂;

TM

碱性蛋白酶(Alcalase)、风味蛋白酶

TM

(Flavourzyme)　购于丹麦NovoNordisk公司;其他化学试剂　均为分析纯。

DF-1型集热式磁力搅拌机　金坛市新一佳仪器厂;PHS-3C精密pH计　上海雷磁仪器厂;TDL-40B型离心机　上海安亭科学仪器厂;KDN-40A定氮仪、KDN-40消化炉　上海新嘉电子有限公司;BS60电热三用水箱　北京市医用仪器厂;HSG-ⅡB-6电热恒温水浴锅　上海仪表(集团)供销公司。

Vol.29,No.09,2008　　食品工业科技

酸性条件下进行水解,不能采用pH-stat法。

TM

将5%大豆蛋白液加入Alcalase1500U/g蛋白,酶解温度50℃,调节酶解液pH710,水解6h,分别用甲醛滴定法和pH-stat法测定大豆分离蛋白的水解度。由图1可见,pH-stat法和甲醛滴定法测定的大豆蛋白水解度结果接近,均为典型的酶解曲线,前2h酶解速度较快,水解度分别为12154%和12159%;随着酶解时间的延长,水解度的增长速度趋缓;酶解6h后,最终水解度分别达到14143%和15120%,甲醛滴

TM

定法的测定值略高于pH-stat法。Alcalase是一种内切蛋白酶,其大豆蛋白酶解产物主要为多肽,鲜有游离氨基酸和寡肽,如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等,

。

112　测定方法

11211　蛋白质含量的测定　采用凯氏定氮法(GB500915-85),同时参考KDN-04A定氮仪说

明书。

11212　pH-stat法测定水解度

DH=×100%

α×m×h

其中B:消耗碱量;N:;:,度(50℃)、中性pH,m:质量(g);h:,对于大豆分离蛋白h175。11213　甲醛滴定法测定水解度

DH=

h-h0

×100%htot

图1　甲醛滴定法和pH-stat法测定

Alcalase水解大豆分离蛋白

TM

212　甲醛滴定法和pH-stat法测定Flavourzyme

TM

水解大豆分离蛋白

将5%大豆蛋白液加入Flavorzyme1500U/g蛋

白,酶解温度50℃,调节酶解液pH710,水解6h,分别用甲醛滴定法和pH-stat法测定大豆分离蛋白水解度

,结果见图2。

TM

其中:h:采用甲醛滴定法测定的酶解液中的-NH2或-COOH基团的含量(mmol/g);h0:采用甲醛

滴定法测定的水解前原料中的-NH2或-COOH基团的含量(mmol/g);htot:每克原料蛋白的肽键毫摩尔数(mmol/g)。

113　大豆分离蛋白水解工艺

大豆分离蛋白和水(1∶15,m/v)室温下混合搅拌1h,20℃下8000r/min离心30min,除去不溶物,得到天然大豆蛋白提取液后,加热到95℃保温1h,再进行降温,调节pH和温度,加入适量的蛋白酶,进行酶解。

2　结果与讨论

211　甲醛滴定法和pH-stat法测定Alcalase水解

TM

图2　甲醛滴定法和pH-stat法测定

Flavorzyme水解大豆分离蛋白

TM

大豆分离蛋白

甲醛滴定法是在国内被广泛应用于测定蛋白质

+

水解度的一种方法,甲醛可与氨基酸和肽上的-NH3结合,形成-NH-CH2OH、-N(CH2-OH)2等羟甲基衍生物,使NH3上的H游离出来,这样就可以用碱滴定NH3放出H,测定酶解过程被释放出来的氨基,从而计算出水解度。值得指出的是,脯氨酸与甲醛作用生成的化合物不稳定,导致滴定后结果偏低;酪氨酸含酚基结构,导致滴定结果偏高。因此采用甲醛滴定法测定富含脯氨酸的原料,其结果偏低;采用甲醛滴定法测定微弱的水解物的水解度时,误差较大。pH-stat法是根据酶解过程中释放出的氢离子来计算水解度,pH-stat法测定简单,允许实时监控水解度,测定微弱的水解物的水解度时误差较小,但仅适合于在中性和碱性水解条件下进行测定;

[2]

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+

+

+

由图2可见,采用风味蛋白酶水解大豆分离蛋白时,采用甲醛滴定法与pH-stat法对水解度的测定结果相差较大,且随着水解时间的延长以及水解度的增加,甲醛滴定法的测定明显高于pH-stat法。风味蛋白酶水解6h后,甲醛滴定法和pH-stat法测定的水解度分别为14176%和9107%。风味蛋白酶是外切蛋白酶和内切蛋白酶的混合物,常用于蛋白质酶解液的脱苦或深度酶解蛋白质。大豆蛋白的风味蛋白酶酶解产物富含游离氨基酸、二肽、三肽等小分子肽。

α有关,而α因pH-stat法中水解度的计算与1/取决于温度、溶液的pH和氨基的解离度(pK值),具

体计算公式如下:

α=(pH-pK)

1+10

当酶解液的温度和pH不变的情况下,α仅与氨

(pH-pK)

2008年第09期　　　　269

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基的解离度pK值有关。如50℃下,多肽和蛋白质氨基的解离系数pK为711,而游离氨基酸、二肽、三肽氨基的解离系数为716,因此,pH为710时,多肽混合物和游离氨基酸、二肽、三肽混合物的α值分别为

α分别为210144和0120,与之对应1/27和510。对

α1/的低估导致pH-stat法测定的结果偏低。

NewYork:ElsevierAppliedSciencePublishers,19861

[2]檀志芬,生庆海,邱泉若,等1蛋白质水解度的测定方法

[J]1食品工业科技,2005,26(7):174～1761[3]隋伟,张连富1酶解虾加工下脚料工艺的研究[J]1中国

3　结论

采用内切蛋白酶对蛋白进行水解时,pH-stat法

和甲醛测定结果较为接近;而采用富含外肽酶的蛋白酶对蛋白质进行水解时,采用pH-stat法测定水解度会导致水解度偏低。

参考文献:

[1]Adler-NissenJ1Enzymatichydrolysisoffoodproteins[M]1

调味品,2005(12):54～581

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面,。因此,,赋予其法人资格,,拥有准公共权力,保障它们的独立性、权威性、公正性;同时也对其成立资格做出明确的规定,保证它的专业技术性;再者,建立对风险评估机构的监督约束机制,包括自律

[11]

机制、互律机制和外部监督机制。我国食品安全风险评估体系各机构的设置及职能分配可参照德国食品安全风险分析模式,即将食品安全风险评估、风险情况交流和食品安全风险管理分开机构设置,赋予其明确的职责与权限。由于食品安全风险评估具有专业技术性、科学性和客观性的特点,这就决定了其对资源(资金资源、技术资源、人力资源、信息资源)配置的要求高,而我国又是发展中国家,经济和科技水平相对落后,资金、人才和技术资源相对不足。因此,笔者认为,风险评估机构的运作机制可采用以下几种方式:a1风险评估机构负责对食品安全进行基于准确、客观、科学、全面的数据的评估,向消费者提供有关食品中可能存在及已被评估的风险信息,并提供各种可供选择的降低风险的行动措施,以及编制风险评估报告;b1为降低评估成本,提高社会资源的利用率,风险评估机构可委托经过依法设置和依法授权的、已获实验室认可和计量认证的、能为社会提供公证数据等技术服务工作的法定技术机构或组织为其提供风险评估的数据依据;c1风险管理机构根据风险评估报告,制定相应的食品安全风险管理措施,并监督执行。

]

的科学技术、食品的法律法规,更包括食品从业人员的道德伦理和公众对食品质量安全的教育和认识水平,以及政府对整个食品供应链的完整、协调、统一的监管。通过这种对食品安全的全方位、深层次的分析,最终建立起职责分明、法律法规健全、国际化的食品安全风险化解机制,预防食品安全风险演变为社会公共危机,化解食品安全风险。

参考文献:

[1]侯振建1食品安全与食品伦理道德体系建设[J]1食品科

3　结论

食品安全是民生问题,食品安全风险则是社会政治问题。因此,政府要构建有效高效的食品安全风险防范与化解机制,就必须全面深刻地理解食品安全的内涵和外延,即食品安全不仅仅是包括食品　　　　2702008年第09期

学,2007,28(2):375～3781

[2]黎军,赵海旭1专家聚首杭州讨论食品标准[N]1杭州日报,2007-11-061

[3]夏延斌1企业要勇于担当食品安全的领头羊[N]1中国医药报,2007-09-281

[4]温铁军1食品安全背后的污染问题1中国经济网http://www1ce1cn12006-12-011

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[6]闪淳昌1我国国民安全综合素质和发达国家相比存在很大差距1安全文化网http://www1anquan1com1cn12006-06-261

[7]秦富,王秀清,辛贤,等1欧美食品安全体系研究[M]1北京:中国农业出版社,2003,5166～701

[8]null1零售巨头将抬高门槛我食品供应商面临淘汰风险1国家食品安全信息中心http://www1fsi1gov1cn12007-11-161

[9]null1政协委员:尽快提升食品安全风险评估能力1国家食品安全信息中心http://www1fsi1gov1cn12006-03-271[10]钱永忠,郭林宇1德国食品安全风险分析概观[J]1农业质量标准,2007(4):53～561

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/rf5q.html