云师大植物生理学

本科学生综合性实验报告

学号： 114120146 姓 名： 段霞飞 学院： 生命科学学院 专业、班级：11级生物科学C班

实验课程名称：光合色素的提取、理化性质、分离、吸收光谱

教 师： 开 课 学 期： 2013 至 2014 学年 第二 学期 填 报 时 间： 年

云南师范大学教务处编印

一.实验设计方案 实验序号 实验二 实验名称 光合色素的提取、理化性质、分离、吸收 光谱及含量的测定 实验时间 2014 年 3 月、4 月 实验室 睿智 3 栋 428

(一)实验目的 1、掌握光合色素的提取方法以及了解有关的理化性质。 2、掌握光合色素的分离方法以及了解有关的吸收光谱。 3、掌握用分光光度计测定叶绿素含量的方法。 (二)实验原理及实验流程或装置示意图 I 光合色素的提取与理化性质： 光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。 提取液中无任何电子受体，因此可以观察荧光现象。 离体叶绿素在有氧气和光照条件下，发生光氧化作用，结构遭到破坏，形 成加氧叶绿素等产物。 叶绿素是一种双羧酸酯，可以发生皂化反应。 叶绿素分子中 Mg2+与仆啉环结合不稳定，可以被 H+、Cu2+、Zn2+等离子 所取代。 II 光合色素的分离与吸收光谱：

光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。 不同光合色素的分子量、分子结构、极性、溶解度、支持物对它们的吸附 力等不同，因而分配系数不同，故彼此可以分开。 叶绿素的卟啉环结构对光有很强的吸收，主要是红光和蓝紫光。 III 光合色素含量的测定 混合液中的两个或多各组分， 只要它们的光谱吸收峰不互相重叠， 仍然 可以根据 Lambert-Beer 定律(A = k L C)求出各组分含量。Lambert 定律： A = k L;Beer 定律 A = k C。叶绿素 a、b 在 80%丙酮溶液中的 Amax 分别为 663nm、645nm,由此得出：见推导过程 Ca = 12.7 A663 – 2.69 A645;Cb = 22.9 A645 – 4.68 A663 Ca+b = 8.02 A663 + 20.20 A64

(三)实验设备及材料 1、主要实验用具和仪器 研钵、 试管、 滤纸﹑三角瓶﹑天平﹑滤纸条﹑分光光度计﹑离心机﹑离心 管﹑A4 纸﹑吸管。 2、药瓶和试剂 CaCO3﹑石英砂﹑丙酮﹑20%KOH 甲醇溶液﹑苯﹑50%醋酸﹑醋酸铜粉末﹑ 四氯化碳﹑80%苯丙。 3、实验材料：植物绿色叶片

(四)、实验方法步骤 I 光合色素的提取与理化性质 光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，准确称取 2 g,放入 研钵中并加入少许 CaCO3 和石英砂及 5 ml 丙酮，充分研磨，再加入 10 ml 丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。 观察荧光现象：与光线垂直的方向观察色素颜色。 光破坏作用：1ml 色素提取液于

室内，1ml 于太阳光下，30min 后观察颜 色变化。 皂化反应：取一支试管，加入色素提取液 2.5ml,再加入 30%KOH 甲醇溶 液 1ml,摇匀，再加入苯 2.5ml,轻轻摇动，沿试管壁慢慢加入自来水 1ml, 轻轻摇动后观察，注意观察整个过程颜色的变化。 取代反应：取一支试管，加入 3ml 色素，逐滴加入 50%醋酸直至溶液变 为黄褐色。倒出一半，加入少许醋酸铜粉末，酒精灯上加热，与另一半比较 颜色的差异。 吸收光谱的变化：皂化和取代反应后的色素进行吸收光谱分析。

II

光合色素的分离与吸收光谱 光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，准确称取 2 g,放入

研钵中并加入少许 CaCO3 和石英砂及 5 ml 丙酮，充分研磨，再加入 10 ml

丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。 光合色素分离： 剪取适当长度和宽度的滤纸条→ 用上行纸层析法分离色 素→ 启动剂：石油醚：丙酮：苯=10:2:1。 吸收光谱的测定： 光合色素的吸收光谱：取色素溶液 1 mL,加入丙酮 3 mL,摇匀后在 分光光度计上 400 到 700 nm 处每隔 10 nm 进行扫描。 各色素的吸收光谱： 上述层析出的 3~4 种色素， 分别剪下后溶于 3 mL 丙酮中，按上述方法扫描。

III

光合色素含量的测定 方法一：快速测定法 由于叶绿素 a、b 在 652nm 处有共同吸收，k = 34.5 L g-1. cm-1。可

直接用便携式叶绿素测定仪测定植物叶片的叶绿素含量，最后浓度单位为 mg/dm2。 方法二: 分光光度计法 色素提取： 将上述植物叶片洗净并用滤纸吸干， 准确称取已知Φ 的叶圆 片 0.05g 左右，加入少许 CaCO3 和石英砂及 80%丙酮 2ml,充分研磨，转入离 心管中 (离心机使用) , 再用 5ml 80%丙酮洗研钵， 转入离心管中， 平衡， 5000rpm 离心 10min, 记录上清液体积，取 1ml 稀释到 4ml。 测定：以 1cm 比色皿分别测定 A663、A645。使 A 控制在 0.1 ~ 0.8 之 间。

(五)、实验结果与讨论

1、实验现象数据及观察结果： 光合色素含量测定 实验数据及计算 三类色素浓度: =0.862 =0.418A 由公式: =9.822mg/L =5.538mg/L

各叶绿素含量： V=10ml W=0.05g 由公式：

叶片面积： GSM=70-105 W=0.47g

叶面积 由公式：

W (g) GSM ( g / m2)

叶面

积=0.0067—0.0045(m2)

观察结果： (1)可以观察到荧光现象，因为在提取液中无任何的电子受体，因 此可以观察到荧光现象。 (2)皂化反应后的颜色分为三层.上层的颜色为黄色，中间层的颜色 为绿色，下层的为墨绿色. (3)在取代反应后的颜色为黄褐色。 2、对实验现象、数据及观察结果的分析与讨论： (1) 之所以发生荧光现象，叶绿体色素在透射光呈绿色，在反 射光下呈紫色，这是由于叶绿体色素主要吸收自然

光汇中的红橙 光和蓝紫光，未被吸收的光线透射过叶绿体色素溶液，呈现出绿 色；在可见光下，叶绿体色素受激发，再从激发态跃迁到基态的 过程中发出荧光，故反射光为深紫色。 (2)在向 2-3ml 叶绿体色素溶叶中加 20%KOH 甲醇溶液后，溶 液立即转化为黄褐色，稍微有点浑浊，不断震荡 3min 后溶液变 澄清，颜色 呈深黄绿色。分析：对于这一现象，我们查阅相关资 料后明白，向叶绿体色素溶液中氢氧化钾的甲醇溶液后，如不将 此溶液立即混匀，则两种溶剂 界面处的叶绿素分子会发生分子内 的结构改变，可能是 V 环 C10 的氢 原子转移到 C9 的氧原子 上，形成了羟基，双键的位置则转移到 C9 与 C10 之间。正由于

叶绿素分子的这种由酮式向烯醇式的变构 ,所以其颜 色由绿色变 为棕色。同时，C9 的羟基又可与氢氧化钾发生反应而生成 钾盐， 颜色也呈棕色。1 V 环在实验和对照的两支试管分别再加入 3ml 乙醚和 4ml 蒸馏水，两试管溶液均分为两层. (4)其颜色由下至上分别为黄绿色、 黄色、 橙黄色，由资料可 知由下至上依次为叶绿素 b、叶绿素 a、叶黄素、胡萝卜素； 其中 蓝绿色条带最宽，黄绿色条带次之，黄色、橙黄色条带较细，说明叶 绿体中含量较多的是叶绿素 a 和叶绿素 b。 另外，在距这四条条带 较远处，有一条黄色的条带，查阅资料得到，这是 叶绿素的降解产

(六)、注意事项 (1) 在观察荧光现象时试管的液体要要与光线垂直的方向观察色素的颜 色。 (2)在研磨时不宜加入过多的 CaCO3 和石英砂，研磨时间不宜过长，以 免破坏叶绿体。 (3) 在色素分离中， 滤纸条的长度和宽度适度， 过长会侵入到缓冲液中， 过宽会触到水管内壁。 (4)在皂化反应中只能用 20%KOH 甲醇溶液，而不能用 20%KOH 水溶液. 色素只溶于具有极性有机溶剂.

(六)、思考题 1、 为什么在皂化反应中只能用 20%KOH 甲醇溶液， 而不能用 20%KOH 水溶液？

答：因为色素不能溶于水，甲醇其实在这里只是当做溶剂使用，化 学中有“相似相容”,色素是有机物所以只能溶于有机溶剂2、光合色素的吸收光谱对我们理解光合作用有何意义？

答：叶绿体色素的吸收光谱的来年改革峰值分别在 430nm 左右和 660nm 左右。基本不吸收绿光，因而绿光被反射而是叶子(大部分) 显绿色。 也就是说主要吸收这些波长的光的能量在叶绿体内合成植物 所需要的物质。3、试论述高等植物光合色素的种类和生理功能

答：植物含有几种类型的叶绿素，它们之间的差别在于烃侧链的 不同。大多数能进行光合作用的细胞还有第二种类型的叶绿素， 即叶绿素 b 或叶绿素 c。在高等植物的

细胞中含有叶绿素 b,而在 其它一些类型的细胞中含有叶绿素 c 。不同类型的叶绿素对光的 吸收也是不同的，如叶绿素 a 最大的吸收光的波长在 420~ 663nm, 叶绿素 b 的最大吸收波长范围在 460 ~ 645nm 。当叶绿 素分子位于叶绿体膜上时，由于叶绿素与膜蛋白的相互作用，会 使光吸收的特性稍有改变。4、一般正常的植物叶片，Chla / Chlb = 3 / 1,你所测定的结果符合此比例吗？为 什么？

答：我算出的结果大约为 2:1,我所测出的结果不符合，我想原因可能 是在我们采集叶片时有用的叶片的差异， 因为在同一片叶子上的不同 部位叶绿素的含量是不同的.

5、两种测定方法含量有何不同？为什么？

答：快速测定法用便携式叶绿素测定仪测定植物叶片的叶绿素含量， 局部含量测定。比较准确，但不便于整体测定，取样多次平均值也不 能代表整体叶绿素含量；分光光度计法采用低杂散光,高分辨率的单 光束单色器,保证了波长准确度.波长重复性和更高的分辨率 ,自动 调 0%T 和 100%T,自动调波长用多种方法的数据处理功能 ,高分辨,宽 大的样品糟,可容纳 100mm,光径吸收池和相应的反射附件 ,仪器配有 标准的 RS-232 双向通讯接口,可外接打印机,打印相应的实验数据. 个性代的外形设计,轻触式按键使操作更为方便. 可见分光光度计广 泛应用于医药,卫生,化工,学校,生物化学,石油化工,质量控制,环境 保护及科研实验室等化学分析.

(七)、实验小结

本次试验持续时间较长，在试验中我们通过试验的过程对光合作 用的过程进一步的加深了解.通过本次试验，我们知道光和色素在 高等植物中有着重要的作用，光合色素能溶于具有一定极性的有 机溶剂，如丙酮、乙醇等。不同光合色素的分子量、分子结构、 极性、溶解度、支持物对它们的吸附力等不同，因而分配系数不 同，故彼此可以分开。叶绿素的卟啉环结构对光有很强的吸收， 主要是红光和蓝紫光。混合液中的两个或多各组分，只要它们的 光谱吸收峰不互相重叠， 仍然可以根据 Lambert-Beer 定律 (A = k L C)求出各组分含量。Lambert 定律：A = k L;Beer 定律 A = k C。 叶绿素 a、b 在 80%丙酮溶液中的 Amax 分别为 663nm、645nm,

光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。提 取液中无任何电子受体，因此可以观察荧光现象。离体叶绿素在 有氧气和光照条件下，发生光氧化作用，结构遭到破坏，形成加 氧叶绿素等产物。叶绿素是一种双羧酸酯，可以发生皂化反应。 成功之处：本次实验的成功之处是我们通过合作的方式完成实验， 并且获得了一些实验数据，还用分光光度计弄出吸收光谱图，通过 吸收光谱图

更加的了解高等植物的色素种类。 不足之处：在研磨是可能因为我们选择的叶子不同，导致结果不一 样。

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