【生物课件】植物DNA、RNA及蛋白的提取与分析

植物DNA、RNA及蛋白 的提取与分析

植物DNA提取

DNA提取原则

保证DNA结构的完整性 排除有机溶剂和金属离子的污染 排除其它核酸分子的污染 蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度 纯化后不应存在对酶抑制性的物质

植物DNA提取的方法

CTAB法 SDS法 煮提法

--植物DNA提取的经典方法

DNA提取的基本步骤

材料的准备(新鲜或冷冻保存) 细胞的裂解(液氮研磨，释放内容物) DNA的分离与纯化(酚氯仿抽提) DNA的沉淀与洗涤(2V无水乙醇或2/3V 异丙醇) DNA的干燥与溶解(ddH2O或TE)

CTAB法流程植物材料 裂解液沉淀

液氮研磨

抽提

离心洗涤

细胞裂解

上层溶液

干燥溶解

CTAB提取液主要成分CTAB: 十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可 溶解细胞膜，并与核酸形成复合物，通过有机溶剂抽提， 去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即 可使核酸分离出来。

Tris-HCl(pH8.0): 提供一个缓冲环境，防止核酸 被破坏。 EDTA:螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性。 NaCl: 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在 于液相中。

CTAB法步骤1.取约0.1g的水稻叶片在液态中磨成粉末，将适 量的粉末材料转移至1.5mlEP管中。 2.加入600µl预热(95℃)的1.5×CTAB缓冲液，然 后65℃温浴20~60min。 3.取出EP管，冷却后加入600µl 氯仿:异戊醇 (24:1)混合均匀，然后10000rpm离心10min,取 出后吸取上清液到另一新的EP管中。 4.加入2/3V异丙醇或2V无水乙醇混合均匀，冰浴至 DNA丝状物出现。 5.稍微离心沉淀DNA,倒掉上清液。 6.加入600µl75%乙醇洗涤，放臵30min。 7.倒掉上清液，室温下吹干DNA。 8.加入100µlTE溶解DNA。 9.取5-10ul电泳检测提取效果 10.-20℃下 贮存备用

注意事项

1. 所有用品均需要高温高压，以灭 活残余的DNA酶。 2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配 制。 3. 在提取过程，应尽量在温和的条 件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、 混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的 DNA。

DNA的质量检测

电泳 带型单一无拖尾现象 点样孔无残留杂质 OD值测定 DNA纯品的OD260/OD280为1.8, 若比值较高说明含有RNA,比值 较低说明有残余蛋白质存在。 OD230/OD260的比值应在0.4-0.5 之间，若比值较高说明有残余的 盐存在。

植物RNA提取

分离RNA的目的

RT-PCR Northern blot 构建 cDNA文库 Gene Chips 体外翻译

RNA提取的关键--防止RNase降解RNA

实验失败的主要原因是RNA酶的污染。 RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因 子。研究人员的手、唾液、灰尘、器械、玻璃制 品、塑料制品、电泳槽、各种试剂及各种组织

和 细胞中。 RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如 煮沸、高压灭菌等。 RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在 制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯 度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以 RNA的制备与分析操作难度极大。 在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污 染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。

防止RNase污染的措施1. 耐高温的器具(如玻璃制品、研钵、剪刀、镊子 等) 于180 ℃下干烤8h 2. 塑料耗材(Tip、EP管等)用0.1%的DEPC水浸泡过夜， 然后高压，再烤干备用 3. 实验用的氯仿、乙醇为RNA专用，水为DEPC处理水 4. 使用有效的RNase抑制剂：如异硫氢酸胍、RNasin 5.配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC,在37℃处理12hr以 上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的 试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制 6. 实验过程需带一次性塑料手套且经常更换 7.设臵RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。注意：DEPC有致癌之嫌 ，必须小心操作，防止接触与吸入 ！

常用的RNase抑制剂

DEPC(焦磷酸二乙酯):是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它 通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性， 从而抑制酶的活性。 异硫氢酸胍∶目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解 组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核 蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。 RNasin(RNA酶的蛋白质抑制剂)一种非竞争性抑制剂，可以和 多种RNA酶结合，使其失活 氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它 和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。

分离总RNA的方法1. 胍盐法：用异硫氰酸胍或盐酸胍和 -巯基乙醇变 性蛋白，并抑制RNase的活性，经酚氯仿抽提后 再沉淀。 2. 氯化锂沉淀法：因为锂在在一定pH下能使RNA相 对特异地沉淀，但容易使小分子RNA损失，而且 残留的锂离子对mRNA有抑制作用。 3. 苯酚法：用SDS变性蛋白并抑制RNase活性，经 多次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后， 用NaAC和乙醇沉淀RNA。

TRI Reagent提取总RNATRI Reagent含有异硫氰酸胍和苯酚，能 够有效溶解RNA,DNA和蛋白质。在加入氯 仿并离心后，上层水相中含有RNA。水相的 RNA经过沉淀和洗涤后几乎没有DNA或者蛋 白质污染

TRI Reagent提取步骤1. 研钵研杵预冷后,加入少量样品用液N迅速研 磨成冰粉状 2. 将样品(样品量不超过100mg)移入1.5mlEP管 中,迅速加入1mlTRI Reagent混匀,室温静臵 5min 3. 加0.2ml氯仿,剧烈振荡15S,室温静臵10min 4. 4℃,120

00g,15min;取上清于另一EP管中，加 0.5ml异丙醇混匀，室温静臵10min 5. 4℃,12000g,8min ;去上清，加1ml75%乙醇， 涡漩沉 淀 6. 去75%乙醇，室温晾干5~10min 7. 加30~50ulDEPC-H2O溶解 8. 电泳检测提取的RNA质量

注意事项

材料新鲜，冷冻材料切忌反复冻融，如要多次提取， 分成多份保存(液氮长期保存，-70℃短期保存) 先用液氮研磨植物材料，研磨用具必须预冷，碾磨 过程中及时补充液氮 研磨后立即加裂解液裂解，样品与裂解液充分接触 前避免融化 样品量适当，保证充分裂解，样品量过多会使内源 性RNase的抑制不完全，导致RNA降解 在使用氯仿抽提纯化时，要充分混匀，动作快速 RNA晾干时不要过干，会导致难溶 实验过程必须严格防止RNsae的污染

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