Module 7 定量PCR数据常见故障排查
更新时间:2023-05-29 15:58:01 阅读量: 实用文档 文档下载
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Module 7: 定量PCR数据常见故障排查
定量PCR是什么?一种灵敏的实时监测目的基因PCR扩增的技术2
定量PCR的优势 灵敏度高(可以检测低拷贝的目标样本) 重复性好 不需要后续的操作(电泳 染色 凝胶成像等) 不需要后续的操作(电泳、染色、凝胶成像等) 简单的操作流程就能得到准确的定量数据3
PCR的三个阶段指数增长期:每经过一个循环PCR产物呈两倍增长 指数增长期 每经过 个循环PCR产物呈两倍增长PCR产物 PCR产物 (对数图) 对数图)指数增长期循环数4
PCR的三个阶段线性增长期:反应速度减缓 线性增长期 反应速度减缓线性增长期PCR产物 PCR产物 (对数图) 对数图)指数增长期循环数5
PCR的三个阶段平台期:反应速度进一步减缓并趋于终止 平台期 反应速度进 步减缓并趋于终止线性增长期PCR产物 PCR产物 (对数图) 对数图)平台期指数增长期循环数6
传统的PCR在平台期进行终点定量线性增长期 PCR产物 PCR产物 (对数图) 对数图) 指数增长期平台期凝胶电泳检测循环数7
指数增长期定量效果最佳(对数图)指数增长期同一样品10倍梯度稀释8
线性增长期定量效果 般 定量效果一般线性增长期 (对数图) 指数增长期同一样品10倍梯度稀释9
平台期定量效果差平台期 线性增长期(对数图) 指数增长期同一样品10倍梯度稀释10
实时荧光定量PCR如何工作?用方便的方法得到精确的定量数据11
PCR扩增和荧光信号增长 定量 PCR实验中, 通过检测报告基团的荧光信号增加来检 测每个循环中PCR产物的增长 可用作报告基团的荧光: FAM , VIC®, JOE , NED , TET , SYBR® Green I12
实时荧光信号增加荧光信号增加反应循环数13
参比荧光 校准孔间的物理荧光误差 (如PCR管盖厚度、透光性能不一 致等) ROX 荧 随Master Mix添加到每个反应孔中 随M t Mi 添加到每个反应孔中 故障排查的工具之一14
参比荧光ROX校准提高数据重复性10 ng 样本 A(Reporter) (Rox)孔1孔2Rn = Normalized reporter = Reporter / Rox15
ROX 校准 仪器软件自动进行ROX校准。 ROX校准为可选步骤,如果使用的PCR试剂没有添加ROX, 校准为 选步骤 如果使用的 试剂没有添加 或者ROX添加浓度不合适,请将ROX校准关闭。16
ROX浓度不合适或未添加17|Life Technologies Proprietary & Confidential|9/9/2011
修改软件中ROX的设置18|Life Technologies Proprietary & Confidential|9/9/2011
提供故障排查信息的软件界面 扩增曲线19
扩增曲线(对数图)20
扩增曲线(线性图)线性增长期指数增长期21
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