Western_Blot专题

蛋白质免疫印迹技术及

常见问题分析张绍进

Western Blot

Western Blot简介

Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析

Western Blot

Western Blot 简介：

印迹法(blotting)是指将样品转移到固相载体上，而后利 用相应的探测反应来检测样品的一种方法。

1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方 法，称为Southern印迹法。

而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的 蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后 蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。

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Western Blot 基本原理

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Western Blot 优点

高分辨率的电泳技术 特异敏感的抗原-抗体反应

1-5ng中等大小的靶蛋白

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Western Blot应用

目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析

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Western Blot 流程

蛋白样品的制备

SDS-PAGE 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色

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蛋白样品的提取 通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白

水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系 统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质 最常用的溶剂 。

有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，

包括乙醇、丙酮和丁醇等。 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白

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蛋白样品的定量

目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford 法(考马斯亮蓝法)、Lowry法(Folin-酚试剂 法)、 BCA法等。但各有优缺点，大家可以根据 具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说 明操作，测定样品浓度。

蛋白质浓度测定的各种方法汇总：

/thread-23639-1-1.html

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蛋白样品的变性

2×SDS-PAGE上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH6.8) 1M DTT SDS 甘油 溴酚蓝 总体积 10 ml 20 ml 4g 20 ml 0.2 g 100ml

① 100mM Tris-HCl(pH6.8) ② 200mM DTT ③ 4%SDS ④ 0.2%溴酚兰 ⑤ 20%甘油 ⑥ ddH2O

DTT可临用前以1:4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20℃冻存。

按1:1比例与蛋白质样品混合，95~100℃加热5~15min, 冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25μl,总蛋白量20~ 50μg。

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SDS:

阴离子去污剂 变性剂 氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。 蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电 荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。 与强还

原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线 性化。

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蛋白质-SDS胶束的特点：(1)具有相同的形状，形状 像一个长椭圆棒

(2)平均1g 蛋白质结合1.4g SDS (3)短轴对不同的蛋白质亚 基-SDS胶束基本上是相同的 (4)长轴的长度则与亚基分

子量的大小成正比

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SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

不连续的电泳缓冲体系。 SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电 荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。

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【SDS-PAGE基本原理】SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的 样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可 以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级 和三级结构。 强还原剂巯基乙醇(或二硫苏糖醇，DTT)可以断开二硫

键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链 形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电 荷的蛋白质-SDS复合物。 蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。

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凝胶成分丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵 Tris-甘氨酸电泳缓冲液

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PAGE:聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰 胺(acrylamide,简称Acr)和交联剂(crosslinker)

N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide,简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网

状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度。是良好的电泳介质。

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聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式： 单体：丙烯酰胺(Acr);

交联剂：甲叉双丙烯酰胺(Bis); 催化剂：过硫酸胺或核黄素(AP); 加速剂：四甲基乙二胺(TEMED);

产物：三维网状结构凝胶 聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(free radicals) 的催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-redox systems)来

完成的。催化体系主要有化学催化(AP—TEMED)和光化学催化(核黄素——TMTED)体系。

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凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度(%)15

线性分离范围(KD)12-43

107.5 5.0

16-6836-94 57-212

SDS-PAGE浓缩胶(5% Acrylamide)及分离胶配方 表：/thread-20726-1-1.html

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不连续电泳：作用浓缩胶 分离胶 使蛋白样品浓缩 使蛋白样品分离

缓冲液PHpH6.8TrisCl pH8.8TrisCl

凝胶浓度低，2-5% 高，根据蛋 白大小

电泳

缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸系统。

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灌制分离胶

隔绝空气ddH2O 0.1%SDS:<8% 异丁醇：>8%

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灌制积层胶

插入梳子

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