贴壁组织块反复消化法培养新生大鼠下颌骨成骨细胞及鉴定

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贴壁组织块反复消化法培养新生大鼠下颌骨成骨细

胞及鉴定

贴壁组织块反复消化法培养新生大鼠下颌骨成骨细胞及鉴定作者：鄂玲玲刘洪臣王东胜作者单位：中国人民解放军总医院口腔医学研究所，北京100853

【摘要】目的探讨经济、高效的原代新生大鼠下颌骨成骨细胞培养方法。方法将新生24 h SD大鼠处死并取出下颌骨，剪碎，用改良的贴壁组织块反复消化法培养细胞，噻唑蓝(MTT)比色法检测其增殖能力，通过相差显微镜观察，用骨钙素免疫荧光染色、碱性磷酸酶染色和钙结节染色方法对所获得的细胞进行鉴定。结果MTT实验显示接种后1～3 d内细胞增殖缓慢，为细胞生长适应期，第7天达到高峰，以后增长速度逐渐减慢。所培养的细胞能形成矿化结节，碱性磷酸酶染色、骨钙素染色和钙结节染色均呈阳性，具有典型的成骨细胞形态特征。结论改良的贴壁组织块反复消化法可获得大量且纯的新生大鼠下颌骨成骨细胞，所培养的细胞具有典型的成骨细胞形态和功能。

【关键词】下颌骨成骨细胞细胞培养

Primary culture and identification of neonatal rat′s mandibular osteoblasts with modified repeating enzymatic

digestion-adherent explants method E Ling-ling, LIU Hong-chen, WANG Dong-sheng. (Stomatologic Institute, General Hospital of Chinese PLA,

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Beijing 100853, China)

[Abstract] Objective To investigate an efficient method of primary mandibular osteoblasts(MO) culture. Methods The mandible harvested from 24 h SD rats was stripped off all soft tissues including the periosteum, rinsed and cut to trivial bone block under sterile condition. Then the bone block was subcultured in culture flask after digested with modified repeating enzymatic digestion-adherent explants method. The proliferation of the acquired cells were examined with assay of methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) and identified with invert microscope, immunohistochemistry stain of osteocalcin, alkaline phosphorase(ALP) stain and stain of calcified nodules. Results MTT assay showed that the cells grew slowly in 1-3 days of post-inoculation, it was cell growth adaptation period. At seventh day, the cells growth reached highest, then the proliferation of the cells was slow gradually. The cells were identified to be osteoblasts by invert microscope, immunohistochemistry stain of osteocalcin, ALP stain and alizarin bordeaux stain of calcified nodule. Conclusion The modified repeating enzymatic digestion-adherent explants method is an ideal methodto obtain and culture neonatal rat′s MO having typical characteristics.

[Key words] mandible; osteoblasts; cell culture

目前公认糖尿病是牙周病的危险因素。研究发现儿童、青少年糖尿病患者发生牙槽骨缺失风险明显高于非糖尿病者，其发病机理

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目前还存在争议[1]。新生大鼠下颌骨成骨细胞(mandibular osteoblasts，MO)的培养对探讨未成年患者系统性疾病与牙周病相互关系的实验研究有广泛的实用价值。成骨细胞原代培养的方法有多种[2-4]，本实验拟建立一种简单、经济、高效的原代培养方法以获得大量高纯度的成骨细胞，为进一步实验研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

H-DMEM、胎牛血清(Gibco公司，美国)，胰蛋白酶(Amresco 公司，美国)，噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)(Sigma公司，美国)，兔抗大鼠骨钙素抗体、正常山羊血清(北京中杉金桥公司)，罗丹明(TRITC)标记的山羊抗兔IgG(Jackson公司，美国)，DAPI(Biotium 公司，美国)，其他相关试剂均为国产分析纯试剂。细胞培养瓶、细胞培养板(Corning公司，美国)，3111型CO2恒温孵箱(ThermoForma 公司，美国)，DMIL倒置相差显微镜及MPS30曝光系统(Leica公司，德国)，FV500全反射激光共聚焦显微镜(Olympus公司，日本)。

1.2 新生大鼠下颌骨成骨细胞的原代培养和纯化

采用在成年大鼠下颌骨成骨细胞酶消组织块培养法[5]的基础上改良的方法，即贴壁组织块反复消化法对新生大鼠下颌骨成骨细胞进行培养。将出生24 h的大鼠置于75%乙醇中浸泡5 min，在无菌超净工作台中于颈部剪开大鼠皮肤，取出带有肌肉和筋膜的下颌骨，用PBS(含100 U/mL青霉素、100 Μg/mL链霉素)冲洗3次，完全剥离肌肉和筋膜，将下颌骨剪碎成2 mm×2 mm的骨片后，PBS冲洗骨

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片，去除残余血液，加0.125%胰酶，水浴振荡器中37 ℃、140 r/min 消化8 min，消化6次后终止，离心收集经酶消化后的组织块，去尽上清液后，组织块中加少量血清，再次剪碎至1 mm×1 mm，铺于培养瓶中，加含20%胎牛血清的H-DMEM倒置培养，4 h后翻瓶。待细胞爬出长至汇合单层时用含0.02%乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)的0.25%胰酶传代，血清终止消化后，轻轻晃动培养瓶后用吸管轻柔地远距离吹打组织块，吸出上清液，离心管中1 000 r/min离心4 min，弃上清，含20%胎牛血清的H-DMEM重悬细胞，接种于培养瓶中，37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下于恒温孵箱中培养。原组织块贴壁的培养瓶再加培养基于恒温孵箱中继续培养，待细胞爬出长至汇合单层时再消化收集细胞，反复多次，获得大量且高纯度的新生大鼠下颌骨成骨细胞。从原代培养开始，每天在倒置显微镜下观察细胞的生长情况和形态特性。

1.3 细胞生长曲线

取第1、6次爬出的第4代对数生长期细胞，胰蛋白酶消化，将细胞接种于96孔板中，接种密度为每毫升5×104个，每孔接种0.2 mL。从第1天开始，连续8 d MTT比色法于490 nm处测定光密度值，描记细胞的生长曲线，每组设12个样本。

1.4 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色

将第1、6次爬出的第4代成骨细胞接种在盖玻片上，培养7 d后用95%乙醇固定15 min，用Gomori钙-钴法[5]进行ALP染色。不加底物Β-甘油磷酸钠者为空白对照，人牙龈成纤维细胞为阴性对

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照。

1.5 细胞钙结节染色(茜素红染色)

将第1、6次爬出的第4代成骨细胞接种在盖玻片上，细胞汇合后局部聚集成灶，形成钙结节后用95%乙醇固定10 min，清洗后加入1%茜素红溶液染色5 min，冲洗5次后封片，显微镜下观察。

1.6 细胞骨钙素免疫荧光染色

将第1、6次爬出的第4代成骨细胞接种在盖玻片上，待细胞长至80%时弃去培养液，95%乙醇固定10 min后行免疫荧光染色[6]。方法为：取出细胞爬片，PBS漂洗3次，每次5 min。室温下用0.5%TritonX-100作用10 min，PBS漂洗3次，每次5 min。封闭血清室温孵育20 min后，加一抗(细胞骨钙素，1∶100)，4 ℃下过夜，PBS 漂洗3次，每次5 min。然后用TRITC标记的二抗(1∶50)室温下作用45 min，PBS漂洗3次，每次5 min，DAPI染核15 min，PBS漂洗3次，每次5 min。用90%的甘油PBS溶液封片，激光共聚焦显微镜下观察。

2 结果

2.1 原代细胞和传代细胞的形态学观察

在倒置显微镜下，原代培养24 h经酶消化后的组织块已贴壁，细胞从下颌骨碎片爬出，呈三角形或梭形。3 d后，爬出的细胞明显增加，以骨块为中心，向周围呈鳞片样生长，许多组织块爬出的细胞已汇合成单层。6～8 d，核明显增大，细胞形态多样化，胞浆丰富，向外伸展出生长突，生长突逐渐增多，细胞借突起相互连接，呈

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重叠生长(图1A)，原代时就有集落化生长趋势，并形成钙结节(图1B)。

A：原代成骨细胞重叠生长;B：原代成骨细胞形成钙结节

图1 原代培养6 d，从贴壁组织块中爬出的新生大鼠下颌骨成骨细胞倒置显微镜×100

Fig 1 The primary neonatal rat′s MO crawling from mandibular explants at 6 d of culture inverted microscope × 100

第1次爬出细胞的组织块长至3 d时，爬出的细胞许多已汇合成单层，消化传代，消化后的组织块继续培养，待爬出细胞后，再消化传代，依次类推，组织块反复爬出细胞，收集到大量的细胞。同一组织块连续6次爬出细胞(图2)。反复消化后，组织块爬出的细胞多呈三角形、多边形。爬出的原代细胞消化后汇合成单层即可传代，细胞在2～3 h内贴壁，展开后的细胞多呈三角形、多边形、纺锤型、短梭形、立方形，胞核呈圆形或椭圆形，居中或偏于一侧，轮廓清晰，可见1～3个核仁。培养相同贴壁组织块6次爬出的第一代新生大鼠下颌骨成骨细胞1 d时，细胞长满瓶底，多呈梭形或立方形，排列紧密，生长突相互连接。随着培养时间的延长，成骨细胞可呈重叠生长、集落化生长趋势。

2.2 细胞生长曲线

第1、6次爬出的第4代细胞接种后1～3 d细胞增殖缓慢，为细胞生长适应期，第7天达高峰，以后增长速度逐渐减慢，细胞数量开始下降(图3)。

2.3 碱性磷酸酶染色结果

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第1、6次爬出的第4代成骨细胞传代后，ALP染色结果显示细胞质内有黑色颗粒状物质，少量分散在细胞周围，2次爬出的细胞ALP表达一致。不加底物Β-甘油磷酸钠的成骨细胞(空白对照)及人牙龈成纤维细胞(阴性对照)ALP染色均为阴性(图4)。

2.4 钙结节染色结果

第1、6次爬出的第4代成骨细胞传代后，细胞汇合时均呈多层重叠生长，细胞呈矮柱形或方形，局部聚集成灶，形成钙结节，茜素红染色钙结节被染成橘红色颗粒或块状沉淀(图5)。

2.5 免疫荧光染色结果

第1、6次爬出的第4代成骨细胞骨钙素免疫荧光染色结果显示，成骨细胞呈阳性反应，细胞浆骨钙素染色后成红色，DAPI核染成蓝色(图6)。

3 讨论

新生大鼠下颌骨成骨细胞的体外培养对成骨细胞的实验研究有广泛的实用价值。在实验过程中，对其培养方法作反复调整改良可取得较理想的效果。改进后的贴壁组织块反复消化法操作简便、实用、经济，可用有限的动物获得大量且纯的成骨细胞。

目前，成骨细胞的培养方法主要有酶消化法[7-9]和组织块法[10-11]。酶消化法一般采用胶原酶消化、胰酶消化或胶原酶胰酶同时消化;组织块法则是将组织剪碎后贴壁即可，在培养成年大鼠下颌骨成骨细胞运用改良的酶消组织块培养法[5]取得了较好的效果。在此基础上，本实验针对新生大鼠下颌骨取材量少、骨片柔软、易贴壁等

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特点，对其成骨细胞培养方法进行了改良。改良的方法有以下几个特点：1)用0.125%胰酶消化组织块。一方面清除纤维组织、松解成骨细胞，既避免胶原酶消化分离细胞时对成骨细胞造成损伤，又加快成骨细胞从贴壁的下颌骨碎片表面爬出的速度，同时还提高了组织块法培养成骨细胞的纯度。另一方面低浓度胰酶能降低对成骨细胞的损伤;2)在37 ℃、140 r/min水浴振荡器中消化能更好地松解成骨细胞，传统组织块法一般为37 ℃孵箱内静态消化或隔一定时间用手晃动，即烦琐又不能很好地松解成骨细胞;3)收集的组织块中加少量的血清。血清营养丰富，且具有黏性，既利于剪碎的组织块贴壁，又使组织块贴得更牢，可避免贴壁组织块反复消化时脱落;4)贴壁组织块反复消化为此改良方法的关键。传统的组织块法培养细胞，原代细胞传代时，往往组织块随着细胞一起被吹打消化下来，待传代细胞贴壁后通过换液弃去漂浮的组织块，组织块仅仅被利用了一次。有研究者[12]也提到把吹打消化下来的组织块再重新贴壁继续培养，这种方法也存在一些弊端。首先，每次重新贴壁耗时耗力。其次，再次贴壁的组织块还需倒置培养2～4 h，反复下来降低了组织块的活力。贴壁组织块反复消化法不仅可避免这些问题，而且可大大提高细胞产量及纯度，经济实惠。在实验过程中，一瓶贴壁的组织块可反复消化、反复爬出细胞，爬出的细胞一次比一次纯，直到组织块细胞爬尽、脱落为止。做到这些要注意以下几点：1)剪碎的组织块中加少量血清，利于组织块贴得更牢;2)要用含EDTA的胰酶消化细胞，EDTA是一种钙离子鳌和剂，能使细胞快速消化下来，不影响到组织块的贴壁;3)消化细胞前要用

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PBS洗2遍，再快速用胰酶洗1遍，目的是洗尽培养瓶中的血清，便于细胞快速消化;4)原代细胞长至汇合单层即可消化，不易长得太密;5)传代时要轻轻用吸管远距离吹打贴壁的组织块，这样既能把经消化松动的细胞吹下来，又不会吹掉贴壁的组织块。

贴壁组织块反复消化法不仅适合培养新生大鼠下颌骨成骨细胞，也适合培养人及其他动物胚胎或新生时各种骨的成骨细胞，还适合不同年龄人和各种动物软组织需用组织块法培养的细胞。由于骨组织结构的特殊性，成人或成年动物骨较硬，常常贴壁不太牢，往往消化一次骨片就脱落，并且组织块爬出细胞较慢，故用改良的酶消组织块培养法[5]结合本方法会更好。

本实验采用贴壁组织块反复消化法从新生大鼠下颌骨中分离培养成骨细胞，每次爬出的细胞均为短梭形、三角形、多角形，并伸出突起。随着培养时间的延长，细胞大量增殖，呈多层重叠生长，可在局部聚集成灶，分泌骨基质并最终矿化成骨结节，碱性磷酸酶、钙结节、骨钙素染色均为阳性，从形态学、组织学和生化上进一步证实该方法培养的细胞具有典型的成骨细胞特性，为进一步研究系统性疾病与牙槽骨的关系奠定了基础。

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