链霉素的生产

链霉素的生产

链霉素的生产 灰色链霉菌的扩大培养与保藏 链霉素的发酵与过程监控 链霉素的分离与效价测定 灰色链霉菌的扩大培养与保藏

种子扩大培养:简称种子扩培.是发酵工程的一个组成部分，其实指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。 种子扩培所得的纯种培养物称为种子。

种子扩培的一般过程：斜面菌种 → 一级种子培养（摇瓶） → 二级种子培养(种子罐) → 发酵

? 种子应具备要求

? 总量及浓度能满足要求。

? 生理状况稳定，个体与群体区隔明显。 ? 活力强，移种发酵后，能够迅速生长。 无杂菌污染。

? 种子扩培的目的 ? 接种量的需要。 ? 菌种的训化。

缩短发酵时间，保证生产水平。 种子的制备工艺

实验室种子制备阶段：

1琼脂斜面 2 固体培养基扩大培养 3摇瓶液体培养 生产种子制备阶段：种子罐扩大培养

斜面孢子培养

? 将砂土管（或冷冻管）保持的链霉菌孢子接种到斜面培养基，于27℃下培养7天。 摇

瓶种子培养 待斜面长满孢子后，制成悬浮液接入装有培养基的摇瓶中，于27℃下培养45-48小时，待菌丝生长旺盛。

种子罐扩大培养

取若干个摇瓶，合并其中的培养液将其接种10%于种子罐内已灭菌的培养基，通入无菌空气搅拌，在罐温27℃下培养62-63小时，然后接入发酵罐内已灭菌的培养基中，通入无菌空气，搅拌培养，在罐温27℃下，发酵约7-8天。 幻灯片8

斜面孢子培养：将砂土管(或冷冻管)菌种接种到斜面培养基上，经培养后即得原始斜面。 斜面培养基：

可溶性淀粉20g，硝酸钾1g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚镁0.01g，琼脂20g，水1000毫升，PH7.2-7.4（配置时注意，可溶性淀粉要先用冷水调匀后再加入到以上培养基中） 配制：按配方称量药品，加热搅拌至琼脂完全熔化，补水至1000ml。趁热分装于18ml*180ml试管，斜面以8ml为宜。分装完毕后，塞好棉塞并将试管捆扎好。 高压蒸汽灭菌：121℃灭菌20min，灭菌后趁热摆斜面。

摇瓶液体培养

摇瓶种子培养基：豆饼粉20g、淀粉40g、酵母膏5g、蛋白胨5g，硫酸铵3g，硫酸镁0.25g，磷酸二氢钾0.2g，碳酸钙4g，自来水1000ml、PH7.2-7.4。

配制：取干净三角烧瓶，250ml三角瓶分装培养基30-50ml，用棉塞包扎瓶口，再加牛皮纸包扎，在0.1Mpa下灭菌45-60min。

一、实验室种子的制备

实验室种子的制备一般采用两种方式： 对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法。 （一）孢子的制备 1，细菌孢子的制备 细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。培养温度一般为37℃。细菌菌体培养时间一般为1~2天，产芽孢的细菌培养则需要5~10天。

2，霉菌孢子的制备 霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。培养的温度一般为25~28℃。培养时间一般为4~14天。

3，放线菌孢子的制备 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。培养温度一般为28℃。培养时间为5~14天。 （二）液体种子制备

1，好氧培养 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（S. griseus）、产卡那霉素的卡那链霉菌（S. Kanamuceticus）可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。其过程如下： 试管→三角瓶→摇床→种子罐

2，厌氧培养 对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等），其种子的制备过程如下： 试管→三角瓶→卡式罐→种子罐

例如生产啤酒的酵母菌一般保存在麦芽汁琼脂或MYPG培养基（培养基配制：3克麦芽浸出物，3克酵母浸出物，5克蛋白胨，10克葡萄糖和20克琼脂与升水中）的斜面上，于4℃

冰箱内保藏。每年移种3-4次。将保存的酵母菌种接入含10ml麦芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25℃培养2-3天后，再扩大至含有250-500ml麦芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25℃培养2天后，移种至含有5-10L麦芽汁的卡氏培养罐中，于15-20℃培养3-5天即可作100L麦芽汁的发酵罐种子。从三角瓶到卡氏培养罐培养期间，均需定时摇动或通气，使酵母菌液与空气接触，以有利与酵母菌的增殖。

二、生产车间种子制备

实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。

1，种子罐的作用： 主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。 2，种子罐级数的确定

种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，取决于： （1）菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度； （2）所采用发酵罐的容积。 比如：

细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。 茄子瓶→种子罐→发酵罐 霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵

孢子悬浮液→一级种子罐（27℃,40小时孢子发芽，产生菌丝 ）→二级种子罐（27℃，10~24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐

放线菌：生长更慢，采用四级发酵 酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子 3，确定种子罐级数需注意的问题

（1）种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会

（2）种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染 菌机会

（3）虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。

菌种的保藏 ? 原理：

? 主要是根据菌种的生理生化特点，人工制造条件，是孢子或菌体的生长代谢活动尽量降

低，以减少变异。

一般可以通过保持培养基营养成分在最低水平，缺氧状态，干燥或低温，使种子处于“休眠”状态，抑制繁殖能力。

保藏方法

? 1.斜面冰箱保藏方法 4摄氏度 3—6个月 ? 2.沙土管保藏法产 孢子或芽孢微生物 1年 ? 3.菌丝速冻法 甘油作保护剂，零下20摄氏度 ? 4.石蜡油封存法 1年左右

? 5.真空冷冻干燥保藏法 任何微生物；一般五年以上

? 6.液氮超低温保藏法 零下196摄氏度；保护剂；保存期长

链霉素效价测定方案

试验目的： 1、设计链霉素效价测定方案 2、 熟悉并掌握抗生素效价测定方法

试验器材： 双碟 陶瓦盖 钢管、钢管放置器、玻璃容器 、毛细滴管 、灭菌刻度吸管 、称量瓶 、恒温培养箱 、万分之一天平、干燥箱、恒温水浴箱 、显微镜、抑菌圈测量仪或游标卡尺 、超净工作台 、冰箱、酒精灯、接种环 供试品称量量：50mg 缓冲液： 磷酸盐缓冲液（ph7.8）取磷酸氢二钾5.59g与磷酸氢二钾0.41g,加水使成1000ml,摇匀滤过。121℃蒸汽灭菌30min备用。 培养基制备数量

营养琼脂培养基：100ml,作为菌种活化用。

双碟数量：8套（供试品效价测定）+8套（预试验）。共16副

小钢管：32个（供试品效价测定）+32个（预试验），共64个，每个双碟 操作步骤

菌种 1）枯燥芽孢杆菌【Bacillus subtilis CMCC(B) 63 501】 2）枯燥芽孢杆菌菌悬液的制备

菌液制备 取枯燥芽孢杆菌的营养琼脂斜面培养物，加灭菌水2ml冲下菌苔，制成悬液，用吸管将此悬液接种于营养琼脂培养基上，均匀摊布，在37℃培养7天，取菌苔少许涂片，用革兰染色镜检，应有芽孢85%以上。用灭菌水将芽孢洗下，制成芽孢悬液，合并至灭菌大试管内，65℃水浴内加热30min，将菌体杀死，待冷后放冰箱储藏为浓菌液。 供试品溶液的制备

供试品估计效价1000000U/g.精密称取样品50.0mg，加水50ml，稀释制成1000U/ml溶液，吸取2ml加入100ml容量瓶中，加pH7.8磷酸盐缓冲液稀释至刻度，制成20U/ml溶液，吸取7ml加入100ml容量瓶中，制成1.4U/ml溶液, 吸取25ml加入50ml容量瓶中，制成0.7U/ml溶液,作为滴碟用供试品及标准品溶液。

培养基Ⅰ 胨5g 牛肉浸出粉3g 磷酸氢二钾3g 琼脂20g 水1000ml 除琼脂外，混合上述成分，调节ph值使比最总的ph值略高0.2，加入琼脂，加热溶化后滤过，调ph值使灭菌后为7.8～8.0，在115℃灭菌30min。

检菌为枯燥芽孢杆菌【Bacillus subtilis CMCC(B) 63 501 】 双碟的制备 预实验 将培养基用微波炉融化，保温使温度降至60℃左右，取8套已灭菌双碟，每套中加20mlⅠ

培养基，作为底层。将另外四个装量为100ml的培养基，于58℃保温，30min底层凝固后，往100ml培养基中分别加入菌悬液2.0ml,1.5ml,1.0ml，0.5ml,摇匀，于每套双碟中分别加5ml,并迅速摇匀，作为菌层。30min菌层凝固后，用钢管放置器，每套双碟中放入4只小钢管。将滴好的双碟放入37℃恒温室中培养18h。取出双碟，将钢管倒入消毒液中，盖上玻璃盖，用效价抑菌圈测量仪测量抑菌圈大小。 高剂量和低剂量的抑菌圈直径相差大于等于2mm的为最适加菌量。 供试品 将培养基用微波炉融化，保温使温度降至60℃左右，取8套已灭菌双碟，每套中加20mlⅠ培养基，作为底层，另一个100ml培养基，要于58℃保温，30min底层凝固后，往100ml培养基中加入菌悬液1.0ml(由预试验得到)，摇匀，于每套双碟中分别加5ml,并迅速摇匀，作为菌层。30min菌层凝固后，用钢管放置器，每套双碟中放入4只小钢管。 滴碟培养 取上述供试品溶液滴入钢管内，滴加顺序为：顺时

针,SH-TH-SL-TL。将滴好的双碟放入37℃恒温室中培养18h。取出双碟，将钢管倒入消毒液中，盖上玻璃盖，用效价抑菌圈测量仪测量结果。

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