活体动物体内生物发光和荧光成像技术

活体动物体内生物发光和荧光成像技术基础原理与应用简介

活体动物体内生物发光和荧光成像技术

基础原理与应用简介

文章来自中国生物器材网

文章目录：

一、活体生物发光成像技术

二、活体动物荧光成像技术

三、生物发光成像与荧光成像的比较

四、活体动物可见光成像仪器原理与操作流程

活体动物体内成像技术是指应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究的技术。活体动物体内成像技术主要分为可见光成像 (optical imaging)、核素成像（radio-nuclear imaging）、核磁共振（magnetic resonance imaging ，MRI）成像和超声（ultrasound）成像、计算机断层摄影（computed 为功能成像；超声成像和CT则适合于解剖学成像，通常称为结构成像。功能成像与结构成像比较，前者更能够反映细胞或基因表达的空间和时间分布，从而了解活体动物体内的相关生物学过程、特异性基因功能和相互作用。所以，活体动物体内功能成像技术可用于观察和追踪靶细胞、基因的表达，同时检测多种分子事件，优化药物和基因治疗方案，从分子和细胞水平对药物疗效进行观察，从整体动物水平上评估疾病发展过程，对同一个动物进行时间、环境、发展和治疗影响跟踪。由于功能成像的诸多优势，这项技术广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面，本文重点介绍活体动物可见光成像技术。

体内可见光成像(optical in vivo imaging)技术主要包括生物发光(bioluminescence)与荧光(fluorescence)成像两种技术。生物发光成像是用荧光素酶(luciferase)基因标记细胞或DNA，利用其产生的蛋白酶与相应底物发生生化反应产生生物体内的探针光信号；而荧光成像则是采用荧光报告基因（如GFP、RFP）或Cyt及dyes等荧光染料进行标记，利用荧光蛋白或染料产生的荧光就可以形成体内的荧光光源。前者是动物体内的自发光，不需要激发光源，可通过高度灵敏的CCD直接捕捉光信号，而后者则需要外界激发光源的激发才可以捕捉发光信号。传统的动物实验方法需要在不同的时间点宰杀实验动物以获得数据, 得到多个时间点的实验结果。相比之下，体内可见光成像技术通过对同一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标（标记细胞及基因）的移动及变化，所得的数据也更加真实可信。另外, 这一技术由于不涉及放射性物质，具有操作简单，所得结果直观，灵敏度高等特点, 在刚刚发展起来的几年时间内，已广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面。

一、活体生物发光成像技术

（一）技术原理

1. 标记原理

哺乳动物生物发光，一般是将Firefly luciferase基因（由554个氨基酸构成，约50KD）即荧光素酶基因整合到预期观察的细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，当细胞分裂、转移、分化时, 荧光素酶也会得到持续稳定的表达。基因、细胞和活体动物都可被荧光素酶基因标记。将标记好的细胞接种到实验动物体内后，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素(luciferin)，即可在几分钟内产生发光现象。这种酶在ATP，氧存在的条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且发光光强度与标记细胞的数目线性相关。

除Firefly Luciferase外，有时也会用到Renilla Luciferase。二者的底物不一样，前者的底物是荧光素（D-luciferin），后者的底物是coelentarizine。二者的发光波长不一样，前者所发的光波长在540~600nm，后者所发的光波长在460~540nm左右。前者所发的光更容易透过组织，后者在体内的代谢比前者快，而且特异性没有前者好，所以大部分活体实验使用Firefly Luciferase作为报告基因，如果需要双标记，也可采用后者作为备选方案。

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荧光素酶的发光是生物发光，不需要激发光，但需要底物荧光素。荧光素在氧气、ATP存在的条件下和荧光素酶发生反应，生成氧化荧光素(oxyluciferin)，并产生发光现象。

对于细菌标记，一般利用发光酶基因操纵子luxABCDE或luxCDABE，其由控制的编码荧光素酶的基因和编码荧光素酶底物合成酶的基因组成。利用这种办法进行标记的细菌会持续发光，不需要外源性底物。但是一般细菌标记需要转座子的帮助把外源基因插入到细菌染色体内稳定表达。

2. 底物荧光素的特点

荧光素由于诸多优点得到广大科研人员的青睐，主要特点如下：

(1) 荧光素不会影响动物的正常生理功能。

(2)荧光素是280道尔顿的小分子，水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透细胞膜和血脑屏障。

(3) 荧光素在体内扩散速度快，可通过腹腔注射或尾部静脉注射进入动物体内。腹腔注射扩散较慢，持续发光长。荧光素腹腔注射老鼠后约1min后表达荧光素酶的细胞开始发光，10min后强度达到稳定的最高点，在最高点持续约20~30 min后开始衰减，约3h后荧光素排除，发光全部消失，最佳检测时间是在注射后15~35min之间；若进行荧光素静脉注射，扩散快，但发光持续时间很短。科研人员根据大量的实验总结出荧光素的合适的用量是150mg/kg，即体重20克的小鼠需要3毫克的荧光素。

(4) 观察时间的间隔没有最短限制，只要观察的条件控制一致就可以。虽然底物在动物体内有一定的代谢过程，但是上一次底物的残留曲线可以知道，可以控制对下一次观察结果的影响。

3. 光学原理

光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，光子遇到细胞膜和细胞质时会发生折射现象，而且不同类型的细胞和组织吸收光子的特性并不一样。血红蛋白（hemoglobin）是造成体内可见光被吸收的主要因素，其吸收可见光中蓝绿光波段的大部分。但是在可见光大于600纳米的红光波段，血红蛋白的吸收作用却很小。因此，在偏红光区域, 大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到。利用活体动物生物发光成像技术最少可以检测到皮下的几百个细胞。当然，由于发光源在老鼠体内深度的不同可看到的最少细胞数是不同的。一般认为，每一厘米深度，发光强度衰减10倍，血液丰富的组织或器官（比如心脏、肝脏、肺脏）衰减多，与骨骼相邻的组织或器官衰减少。在相同的深度情况下，检测到的发光强度和细胞的数量具有非常好的线性关系，可由仪器量化检测到的光强度，反映出细胞的数量。

（二）活体生物发光成像技术应用领域

活体生物发光成像技术是一项在某些领域有不可替代优势的技术，比如肿瘤转移研究、药物开发、基因治疗、干细胞示踪等方面。

1．肿瘤学

活体生物发光成像技术能够让研究人员能够直接快速的测量各种癌症模型中肿瘤的生长、转移以及对药物的反应。其特点是极高的灵敏度使微小的肿瘤病灶（少到几百个细胞）也可以被检测到，比传统方法的灵敏度大大提高了；非常适合于肿瘤体内生长的定量分析；避免由于宰杀老鼠而造成的组间差异；节省动物成本。由于以上特点，使基于转移模型、原位模型、自发肿瘤模型等方面的肿瘤学研究得到发展。建立肿瘤转移模型，可以观察肿瘤转移情况，进一步探讨肿瘤转移的机制；可进行原位接种，观察原位以及原位转移模型，使肿瘤学研究更接近肿瘤临床发病的微观环境；通过建立自发肿瘤模型，可以观察肿瘤发生机理。（图11-1）。

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图11-1 肿瘤的长期检测，左图分别是7天，14天，30天成像。来自中国军事医学科学院

2．药物研究

在药效学评价方面，荧光素酶癌症模型可用于癌症体内用药在整体动物水平上进行长期疗效跟踪观察。利用无创伤活体成像对癌细胞生长的检测，可对癌症治疗之前和过程中的癌细胞的变化进行实时观测和评估。这种方式提供一个很好的对癌细胞的反应和复发评估的预诊断途径。用活体成像的方法比传统技术有更高的灵敏度，当用传统的方法还不能检测到瘤块时，用该技术已经可以检测到很强的信号。由于该技术只是检测活细胞，不能检测已经凋亡的细胞。而用传统的方法，不能区别正常细胞与凋亡的细胞，所以该技术可以比传统技术更早更灵敏的发现药物的疗效。

利用活体成像技术高灵敏度、观察方便的特点，在抗肿瘤药物临床前研究中，通过给予肿瘤接种的小鼠不同剂量，不同给药时间、不同给药途径，观察抗肿瘤药物的最佳给药途径、给药剂量及给药时间，从而制定合适的剂型与服药时间。

在药物代谢方面，标记与药物代谢有关的基因，比如CYP3A4等，研究不同的药物对该基因表达的影响，从而可以间接知道相关药物在体内代谢的情况。

在药剂学研究方面，可以通过把荧光素酶报告基因的质粒直接装载在药物载体中，观察药物载体的靶向脏器与体内分布规律（图11-2）。在药理学方面，还可以通过转基因小鼠的应用，观察药物作用的通路，用荧光素酶基因标记某一个兴趣基因，观察药物作用的通路。

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图11-2利用IL-1Β转基因小鼠筛选抗炎症药物，来自上海南方模式生物研究中心

3．基因治疗

基因治疗是将正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的。目前，基因治疗主要是以病毒做载体，可应用荧光素酶基因作为报告基因加入载体，观察目的基因是否到达动物体内的特异组织和是否持续高效表达，这种非侵入方式具有低毒性及免疫反应轻微等优点且可以直接实时观察，了解病毒或载体侵染的部位和时域信息；荧光素酶基因也可以插入脂质体包裹的DNA分子中，用来观察脂质体为载体的DNA运输和基因治疗情况；也可以表达荧光素酶基因的质粒裸DNA为模型DNA，直接注入动物体内，利用生物发光成像可以分析不同载体、不同注射位点、不同注射量对荧光素酶基因表达的影响，同时也可以时空量化分析基因表达的分布、水平和持续时间。这种可视的方法直观地评价DNA的转染效率和表达效率，在基因治疗研究中具有重要的指导作用。

4．干细胞及免疫学

用荧光素酶标记干细胞有以下几种方法：一种是标记组成性表达的基因，做成转基因动物，干细胞就被标记了，若干细胞移植到另外动物体内，可以用活体生物发光成像技术示踪干细胞在体内的增殖、分化及迁徙的过程；另外一种方法是用慢病毒直接标记干细胞后，移植到体内观测其增殖、分化及迁徙过程，研究其修复、治疗损伤或缺陷部分的效果，进一步探讨其机制。

可以通过标记免疫细胞，观察免疫细胞对肿瘤细胞等的识别和杀死功能，评价免疫细胞的免疫特异性、增殖、迁移及功能等；通过标记异体细胞，观察异体细胞对器官移植影响；也可进行一些关于免疫因子的研究等。

5．基因表达模式与基因功能研究

研究基因表达可以从影响基因表达的各个不同的层面进行相关的研究，如利用融合蛋白（p27-luc融合蛋白研究其在Cdk细胞分裂周期的表达），兴趣基因启动子控制的荧光素酶（Catenin在肿瘤转移的信号传导机制），siRNA方式和转基因动物等方法。

为研究目的基因是在何时、何种刺激下表达，将荧光素酶基因插入目的基因启动子的下游，并稳定整合于实验动物染色体中，形成转基因动物模型。通过这种方法实现荧光素酶和目的基因的平行表达，从而可以直接观察目的基因的表达模式，包括数量、时间、部位及影响其表达和功能的因素等；也可用于研究动物发育过程中特定基因的时空表达情况，观察药物诱导特定基因表达；以及其它生物学事件引起的相应基因表达或关闭。

6．蛋白质相互作用

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可利用动物体内生物发光成像技术研究活体动物体内蛋白与蛋白的相互作用。其原理是将分开时都不单独发光的荧光酶的C端和N端分别连接在两个不同的蛋白质上，若是这两个蛋白质之间有相互作用，荧光酶的C端和N端就会被连接到一起，激活荧光素酶的转录表达，在有底物存在时出现生物发光。在活体条件下研究药物对蛋白质相互作用的影响，可以观察到在体外实验中无法模拟的活体环境对蛋白质相互作用的影响。

7．细胞凋亡

利用活体动物生物发光成像技术，直接观察活体动物体内的细胞凋亡。具体原理是用分子生物学方法在荧光酶的两端连接上抑制其发光的蛋白(如雌激素)，但在其连接处加上caspase (细胞凋亡时特异表达的一种酶)的酶切点。细胞发生凋亡时，表达caspase，切开抑制荧光酶发光的蛋白，使荧光素酶开始发光。

8. 疾病机理

可以标记与某种疾病密切相关的基因，做成转基因小鼠，通过特定的药物作用或其他条件下该基因表达的变化，来推测该疾病的发病机理和药物对疾病治疗的效果等。

9．其他

如RNAi、蛋白质核运输等。在荧光素酶基因的一端接要研究的蛋白质的基因，另一端接肯定在细胞核内表达的蛋白的基因，当核外的蛋白运输到核内时，就会导致荧光素酶N端、C端靠近，恢复发光。

二、活体动物荧光成像技术

（一）技术原理

1．标记原理

活体荧光成像技术主要有三种标记方法。

（1）荧光蛋白标记：荧光蛋白适用于标记细胞、病毒、基因等，通常使用的是GFP、EGFP、RFP（DsRed）等；

（2）荧光染料标记：荧光染料标记和体外标记方法相同，常用的有Cy3、Cy5、Cy5.5及Cy7，可以标记抗体、多肽、小分子药物等；

（3）量子点标记：量子点（quantum dot)是一种能发射荧光的半导体纳米微晶体，是由数百到数万个原子组成的原子簇，尺寸在100nm以下，外观恰似一极小的点状物。量子点作为一类新型的荧光标记材料，其在长时间生命活动监测及活体示踪方面具有独特的应用优势。与传统的有机荧光试剂相比较，量子点荧光比有机荧光染料的发射光强的20倍，稳定性强100倍以上，具有荧光发光光谱较窄、量子产率高、不易漂白、激发光谱宽、颜色可调，并且光化学稳定性高，不易分解等诸多优点。主要应用在活细胞实时动态荧光观察与成像，可以在长达数天内进行细胞的分化和世系观察, 以及细胞间、细胞内及细胞器间的各种相互作用的原位实时动态示踪。不但如此，量子点还可以标记在其他需要研究的物质上，如药物、特定的生物分子等，示踪其活动及作用。

2．光学原理

荧光发光是通过激发光激发荧光基团到达高能量状态，而后产生发射光。同生物发光在动物体内的穿透性相似，红光的穿透性在小动物体内比蓝绿光的穿透性要好得多，随着发光信号在体内深度的增加，波长越接近900nm的光线穿透能力越强，同时可消减背景噪音的干扰，近红外荧光为观测生理指标的最佳选择。在实验条件允许的条件下，应尽量选择发射波长较长的荧光蛋白或染料。

（二）活体动物荧光成像技术应用领域

1．肿瘤学

活体荧光成像技术能够无创伤定量检测小鼠的皮下瘤模型。相对于生物发光成像技术，活体荧光成像技术检测时间较快，只需要不到1s的时间，同时不需要注射底物，节约了检测成本。但是需要选择近红外荧光检测深部组织，目前此波段的荧光蛋白种类有限，精确定量较难。

（1）GFP标记的肺肿瘤模型（H-460-GFP）

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H-460-GFP是一个绿色荧光蛋白表达细胞系，它起源于H-460肺小细胞肺癌，稳定转染了绿色荧光蛋白基因，并由SV-40启动子起始基因的表达。

通过H-460-GFP皮下肿瘤模型，建立小鼠肺癌的实验模型，可用来进行有关抗癌药物的筛选（图11-3）。可用于测量皮下肿瘤的生长和监测对潜在化学治疗药物的反应。

图11-3 左图是接种后1w荧光成像，右图是3w荧光成像（上海市肿瘤研究所供图）

（2）量子点标记细胞系

通过量子点可以标记肿瘤细胞，用量子点Qtracker® 705对MDA-MB-231乳腺癌细胞进行标记，皮下接种后动态观察其生长以及变化（图11-4）。激发光波长625nm ，散射光波长680nm。

图11-4 量子点标记肿瘤细胞不同时间荧光成像

2．抗体

分子探针的一端联有能够和生物体内特异靶点结合的分子结构（如肽类、酶的底物、配体等），另一端则是荧光染料。通过Cy5.5标记的抗体的体内代谢实验，可见肝、肾等处的分布（图11-5）。

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图11-5 Cy5.5标记的抗体的体内代谢实验（上海市肿瘤研究所供图）

3． 药学研究

荧光成像在药物制剂学研究，尤其是药物靶向性研究，药物载体研究中有巨大优势。有关专家正在设计用合适的荧光染料标记小分子药物，观察药物在动物体内的特异性分布和代谢情况，尤其是中药研究方面。

应用透射仪从样本底部激发光源，可以提高活体荧光成像的灵敏度和检测的深度。图11-6是应用NIR荧光染料标记的β淀粉酶来观察治疗Alzheimer病的药物的治疗效果，曝光时间仅为200 ms，激发波长680nm，散射光波长720nm。

图11-6 NIR标记的β淀粉酶成像

4．组织工程

通过发展EGFP基因表达的细胞系无创伤的评价组织工程的构建。通过EGFP标记的组织工程细胞移植到小鼠体内特制的支架上，观察该细胞的生长和变化，从而判断组织工程的成败与否。

三、生物发光成像与荧光成像的比较

（一）生物发光成像技术优点

与荧光成像技术相比较，生物发光成像技术主要的优势有：

1．特异性强，无自发荧光

以荧光素酶作为体内报告源的生物发光方法，是以酶和底物的特异作用而发光，特异性极强。动物本身没有任何自发光，使得生物发光具有极低的背景，极高的信噪比。但用荧光方法时，在受到激发光激发时，生物体中皮肤、毛发和各种组织及食物等都会产生荧光，特别是被标记的靶点深臧于组织内部，需要较高能量的激发光

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时，也就会产生很强的背景噪音。虽然荧光信号强度远远超过生物发光，但极低的自发光水平使得生物发光的信噪比远高于荧光。

2．高灵敏度

生物体内很多物质在受到激发光激发后，也会发出荧光，产生的非特异性荧光会影响到检测灵敏度。特别是当发光细胞深藏于组织内部，则需要较高能量的激发光源，也就会产生很强的背景噪音。荧光成像的灵敏度最高也只能在动物体内检测到约105细胞，相对于生物发光在动物体内监测到102数量级细胞的灵敏度要相差很多。

3. 检测的深度

由于生物发光的灵敏度高于荧光成像，对于需要深部成像的研究（检测的深度在3~4cm），如干细胞、原位肿瘤与转移，自发肿瘤等，应用生物发光成像是最佳的选择。

4. 精确定量

生物发光信号可以用于精确定量，因为荧光素酶基因是插入细胞染色体中稳定表达的，单位细胞的发光数量很稳定。即便标记细胞在动物体内有复杂的定位，亦可从动物体表的信号水平直接得出发光细胞的相对数量。而对于荧光，激发光需要穿过组织到达靶点，发射光需要从体内出来，路径较长。信号水平取决于激发光的强度、发光细胞的数量、靶点的深度、光线穿过的组织对其的吸收及散射等因素，使得荧光强度较难定量。荧光成像定量需要仪器的激发光能够保证持续长时间稳定，并均匀照射到动物体表。NightOWL ⅡLB 983成像系统通过荧光光路的特殊设计实现了对激发光的能量控制和调节，根据光源的大小与深浅针对性选择合适的激发装置，并且采用窄波带滤光片，提高了活体荧光成像的稳定性和灵敏度，并且该系统操作简单、费用低廉、不涉及放射性。

（二）荧光成像技术优点

在活体动物可见光成像技术中，相对于生物发光成像技术，荧光成像技术的优势主要表现在：

1. 荧光染料、蛋白标记能力强

荧光标记物种类繁多，包括荧光蛋白、荧光分子、量子点等，可以与基因、多肽、抗体等生物分子标记，作为分子探针使用范围广。同时，不同的荧光蛋白或染料还可对样本进行多重标记，同时成像。检测的波长范围从300~1100nm，某些仪器公司还提供全光谱的滤光片实现几乎所有荧光标记的体内成像。

2. 信号强度大

由于荧光是在外界光源激发下产生的能量转移现象，其光子强度较其它光学信号更强，持续时间长，信号所反应的样本信息量更丰富，对信号接收仪器的要求相对较低，仪器不需要必须配备低温冷CCD（如绝对温度＜-80oC），节省实验成本和购置成本。

3. 实验成本低

相对于活体生物发光成像来说，荧光成像费用低廉，无需注射底物荧光素。荧光发光基团只要在其合适强度的激发光激发下就可以发出定波长的发射光信号，整个反应不需要向动物注射任何昂贵的反应成分，只要保证荧光基团稳定，就可实现随时激发随时发光的效果。

4. 活体动物、动物尸体、器官全部可以进行成像

由于荧光是基于物理能量转移原理，对实验样本的生理状态要求较低，可以实现活体、尸体、尸解组织器官样本的光学成像。而对于生物发光，只有在活细胞内才会产生发光现象。

总之，生物发光和荧光技术，如何互为补充，取长补短，分别满足不同的研究领域，将来的发展方向是两种技术并重。对于不同的研究，可根据两者的特点以及实验要求，选择合适的方法（表11-1）。

表11-1 生物发光及荧光特点的比较

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优 生物发光

点

缺

点

特异性强，无自发荧光 信号较弱， 检测时间较长， 需要灵敏的 CCD 镜头， 高灵敏度，在体内可检测到几百个细胞 仪器精密度要求高； 检测的深度在 3-4 厘米 精确定量 需要注入荧光素，实验成本高； 细胞或基因需要转基因标记； 有些物质不能用生物

发光标记，如抗体、多肽等 很难用于人体。

荧光

荧光染料、蛋白标记能力强，多种蛋白 非特异性荧光限制了灵敏度，体内检测最低约 105 及染料可用于多重标记； 信号强度大，成像速度快； 细胞； 检测深度受限制；

实验成本低； 较难精确体内定量。 活体动物、动物尸体、器官全部可以进 行成像； 可衔接体内实验和体外实验，保持研究 的连贯性； 未来可能用于人体。 四、活体动物可见光成像仪器原理与操作流程 (一) 仪器原理 以 NightOWL ⅡLB 983 为例，来说明活体动物可见光成像系统的仪器设计原理。整个仪器由 CCD 配合密闭性 非常好的暗箱、荧光配件、麻醉系统和软件组成。CCD 镜头位于暗箱的左上方，荧光光源和光路位于右上方， 动物平台(可加热，以保持观察实验动物的体温)位于暗箱的下方，麻醉系统通过管道与暗箱连接。 选择适当的 CCD 镜头，对于体内可见光成像是非常重要的。选用的 CCD 镜头对于波长 450-700nm 的光必须具 有非常高的灵敏度和量子效率，而且由于需要探测的光源在皮下几厘米处，其噪声信号要尽可能的小。科研人 员经过探索发现，背照射背部薄化冷 CCD 是唯一合适的选择。这种 CCD 芯片温度可达<-800C,在该温度下， 芯片的暗电流和阅读噪音降到几乎可以忽略不计的水平，同时配合密闭性非常好的暗箱，使得该系统检测生物 发光和荧光具有无与伦比的灵敏度。CCD 由软件控制升降，自动聚焦，可以获得从 3.5 厘米到 25 厘米的连续 视野。 成像暗箱屏蔽宇宙射线及一切光源，可以使暗箱内部保持完全黑暗，CCD 所检测的光线完全由被检动物体内发 出，避免外界环境的光污染。 在荧光配件的设计方面，光源采用 75W 的钨卤灯，该系统首先实现了荧光激发光源能量从 0%-100%可调节， 并通过光导纤维反馈控制激发能量在检测时间内保持稳定，有利于定量的准确性。另外，还通过采用均匀照射 的激发装置、窄波带的滤光片等保证荧光成像能较好的去除背景噪音的影响，获得清晰的检测结果，较准确的 定量数据。 为了对实验动物进行可见光成像，需要将实验动物进行麻醉，以获得期望的观察角度及稳定的数据。对于生物 发光成像来说，由于检测的时间较长，一般建议使用气体麻醉。气体麻醉系统组成包括：气体蒸发器、诱导麻 醉箱、流量调节阀、单独控制开关的五通道小鼠麻醉室、废气吸收装置等组成。在成像前，将实验动物置入诱 导麻醉箱并被麻醉, 然后放入成像暗箱进行观察 软件系统负责仪器控制和图像分析。软件控制镜头的焦距、CCD 的升降、曝光时间、滤光片的更换和照明灯的 开启等，具有友好的

用户界面，操作简便。 (二) 实验操作流程

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1. 细胞标记或动物标记等

进行生物发光实验，首先根据实验内容的不同，用荧光素酶基因标记肿瘤细胞、干细胞、病毒、药物载体或动物，或者用Lux操纵子标记细菌。用荧光素酶基因标记可通过质粒、慢病毒或逆转录病毒等方法进行。

如果进行荧光实验，就用GFP、EGFP或RFP标记肿瘤细胞、干细胞、病毒或动物等，后者用荧光染料（包括量子点）标记需要检测的物质，如抗体，药物载体等。

2. 体外预实验检测

需要检测的细胞、病毒、细菌等标记后，在活体成像前，可以通过多孔板预先检测一下标记是否成功，荧光素酶或荧光蛋白的表达强度等，并据此筛选阳性克隆、绘制标记物的发光梯度曲线等。体外预实验是作为小动物活体成像解决方案中不可缺少的一部分。比如，利用体外预实验初步检测转染荧光素酶的肿瘤细胞发光值，选择转染率相对高且稳定的一批细胞进行体内实验。对于通常进行的细胞检测来说，具体可以通过活体成像仪器检测活细胞的发光强度，也可以通过体外化学发光和荧光检测仪检测细胞裂解液的发光强度。

当用体外化学发光和荧光检测仪时，可以更准确地捕捉到发光值、更稳定的输出发光值。对于生物发光方式而言，实验所需的仪器是微孔板式化学发光检测仪，如Berthold Centro LB 960。对于荧光方式而言，实验所需的仪器是微孔板式荧光检测仪，如Berthold TwinkleTM LB 970。(图11-7)

图11-7 左侧为Berthold Centro LB 960，右侧为Berthold TwinkleTM LB 970

3. 活体成像

首先麻醉实验动物，可采用异氟烷（isoflurane）或克他命/甲苯噻嗪（ketamine/xylazine）混合液麻醉实验动物。如果采用气体麻醉，可先注射底物。气体麻醉的优点是动物可以很快进入麻醉状态，一旦停止麻醉气体供应，动物会在几分钟内苏醒。

对于生物发光实验来说，接着注射底物荧光素。最佳的检测时间是在注射后15到35分钟之间。但需要注意的是，对于不同的动物模型，发光动力学过程并不完全一致，最好先进行预实验确定何时发光信号最强。

成像，对于生物发光来说，检测时间一般是1分钟到5分钟，如果信号特别弱，也可以延长到10分钟，如果信号特别强，也可在1分钟以内。对于荧光来说，检测时间是1秒以内。为节约时间，检测生物发光，最多可同时检测5只小鼠。对于荧光实验，麻醉好就可以马上检测。由于激发光照射的角度会影响检测的信号值，所以荧光实验建议每次只检测1只动物。

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