非放射性EMSA实验技术的专题讨论 - 图文

网上找到的非放射性EMSA实验技术的专题讨论，看了一部分，感觉很有帮助，收藏起来慢慢的学习~~

来源： 耿冬峰的日志

EMSA实验技术探讨

EMSA是一个比较复杂的试验技术,由于工作原因接触这个试验技术到现在也有三年多的时间了,做了大概也有几百次吧, 那倒理想的试验结果的同时也碰到了很多莫名的问题和结果,到现在为止还有没有解决的,找不到原因的一个问题,呵呵! 现和smalldonkey商量一下将我对这个实验技术的总结和一个心得写出来给大家分享,批评指正.

EMSA实验技术作为一个经典的DNA/protein,RNA/protein的检测技术,不是很多简单的实验技术可以替代的!比如曾经在我们这个论坛中有站友提到这样一个问题: 某公司的激活-和转运检测试剂盒，监测是否激活NF-KB测试剂盒原理：

NF-κB未被激活时和IκB-α形成一个复合物，分布在细胞浆中。在炎症因子、生长因子或趋化因子等可以激活NF-κB的刺激存在的情况下，IκB-α会在Ser32和Ser36被磷酸化，随后被泛素-蛋白酶体途径降解。NF-κB和IκB-α解聚后，其核定位序列被暴露，从而被转运到细胞核内促进NF-κB依赖的基因转录。通过免疫染色检测NF-κB的主要亚基p65是否被转移到细胞核内，就可以判断NF-κB是否被激活.本NF-κB激活－核转运检测试剂盒仅染色p65，不染色RelB、C-Rel、p50和p52。使用本试剂盒染色后NF-κB呈红色荧光，细胞核呈蓝色荧光.思考信号转导和检测的理论我做了这样的回答(个人意见.大家可以讨论!):

这种理论上来讲可行,但是实际操作可能拿不到你想要得结果,原因很简单,凭染色来判断是很难区分程度上的差异的,就比如做WB实验,经典的还是化学发光的方法,显色的方法只能得到信号比较强的蛋白,遇到信号比较弱的蛋白就误差很大了, 第二点,并不是所有能进核的蛋白都有结合DNA的能力,如果结合了那才是真正的参与转录的转炉银子, 有的入核后却不能和DNA结合,只能等着被降解!

其实总体而言大家做试验时都希望成功,但是EMSA试验技术的独特性和复杂性决定了,要想做成功EMSA试验,拿到阳性结果可总结为一句话: 把握整体,注意细节!

我觉的EMSA的整体性包括6大点:探针制备(设计,合成,标记,纯化,退火);个人实验设计(时间剃度浓度查阅文献等);核蛋白制备;浓度测定;EMSA操作;实验时竞争设计. 这六大点都是会直接影响到EMSA试验的成功与否! 中间就必须注意到这六大点的细节,包括操作细节,在这点上,我倒是很佩服美国佬的态度,我记得3.5年那几个美国佬给我培训的试验技术的时候就严格的按照他们的规定每一个细节操作,并养成一个实验习惯; 比如其中的一点:他们培训我们在配置溶液的时候只要是液体的东西无论什么养成一个习惯就是摇一摇,因为有些溶液静止时间长了有效的大颗粒可能下沉,要是直接取会造成不均匀的误差,到时候试验结果出了问题,很难推断操作错误的地方,养成一个习惯即使是蒸馏水也摇一摇,呵呵,倒不是说的这么夸张,但强调的是一个严格而良好的试验习惯! 呵呵,言归正传,实验技术毕竟是一门动手性很强的科学,理论还是和动手还是有一定差别的, 希望我的一些理论能给大家帮助.下面我大概的介绍一下EMSA的一些理论和自己试验的心得,以便站友学习,

另外,EMSA是一个很大的试验.我一时间也不能把所有的都罗列出来,只能等大家遇到问题,只要我有时间在线就尽力帮忙交流, 呵呵 ! 我做的最多的还是NFKB,此外还有AP-1,STAT3,STAT5,HIF等,希望能于大家交流. 简介:

EMSA ( Electrophoretic Mobility Shift Assay ) 凝胶迁移实验是一种研究DNA与蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的常用技术。这项技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。当核转录因子与一条人工合成的特

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异的DNA或RNA结合后，其在PAGE中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的DNA，从而检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋白转录或调节因子。 发展:

从发展史来看,这项实验技术起初是用32P同位素标记人工合成的寡核苷酸形成探针,但是由于同位素的放射性很强,而且半衰期为14天,所以从定购到标记再到做完试验,必须14天完成,种种制约因素导致现代科技发展非同位素EMSA试验技术,这就出现了地高辛标记为探针的非放射EMSA实验技术.在实践中没多久,地高辛标记为探针的非放射EMSA实验技术就暴露了一个严重的缺陷,标记的探真纯化后灵敏度弱,导致实验结果的信号不行,最终就出现了现在的生物素标记探真的EMSA实验技术.配合化学发光技术良好的解决了灵敏度的问题,到目前为止, 生物素标记探真的EMSA实验技术广为应用! EMSA试验成功的关键因素:

1.

1.试验设计,

主要是你用药品刺激细胞时,设计的药品浓度和时间剃度的问题,这个很关键,很多同学不注意这一点,最后试验确实是拿不到阳性结果,比如我一前一个朋友用药物处理SGC7901细胞,就是因为时间点设计的不好EMSA试验结果是阴性的,后来根据自己药品刺激的特性重新设计了刺激时间剃度,最终得到阳性结果! 所以这个设计很关键!!!

给一个个人的实验总结希望能帮助大家:一是受体结合类的直接刺激激活信号通路的方法，一般达到EMSA核转运高峰的时间比较短，大概控制在30min-2h之间，很多时候都是在45min和1h达到高峰，当然还有合适的浓度！！！二是是你用的是药物刺激产生受体可能时间会长一些,因为药物还有一个渗透和刺激产生细胞因子的过程.时间可以长一些,主要根据自己的药物刺激特性确定时间点. 2.核蛋白样品的制备;

制备蛋白样品的关键是:1.注意用专用的和核蛋白抽提试剂来做,才能使制备的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和构像.2.掌握好核蛋白的浓度和纯度,尤其是浓度. 能入核的蛋白本来就不是很多,所以核蛋白的浓度往往不会很高,但是EMSA试验对核蛋白的浓度要求还是听高的! 一般要求在1ug/ul以上!有时候稍微低于这个数量级也可以,但是不能太低,否则影响结合反应拿不到结果. 这就要求核蛋白抽提尽量避免核蛋白的损失.

同时,一般制备核蛋白的材料为细胞和组织, 细胞要比组织好做的多,最重要的是用细胞得到核蛋白的纯度比组织要高很多. 而组织抽提后杂蛋白相对较多!杂蛋白多会影响试验结果不容易得到EMSA阳性结果!! 3.探针的制备:

又很多站友都在问我生物素标记到3’端还是5’端,其实我觉得最好还是两端都标记,这样才能更好的提高灵敏度, 国内的标记技术我还不是很了解,我们这边的探真都是国外定做的,还算可以,其制作程序如下: 合成寡核苷酸---标记生物素---纯化---退火合成双链.也是一个比较复杂的过程.

4.EMSA实验技术.

这一点主要是操作的细节问题! 下面会更细的谈到. 技术要点:

关于技术要点,我在这里只提一下关键的几点需要注意的细节操作,其他的照正常程序就可以了! 1. 制胶

必须是非变性PAGE凝胶,我们实验室一般用6.5%的非变性胶.制胶很重要,直接影响电泳的效果!一般控制在5分钟凝固的效果.

2

10X TBE 1.0ml

40% Acrylamide（40%聚丙烯酰胺） 3.3ml 50% Glycerol（50%甘油） 1.0ml dH2O（蒸馏水） 14.8ml

TEMED（四甲基乙二氨） 20μl 脱气10min

10% AP（过硫酸氨） 120μl 总量 20.0ml

2. 一般试剂盒包括的试剂

l 10X Binding Buffer（10X 结合反应液）(-20 oC) l Poly (dI:dC) (dI:dC)（聚核苷酸竞争物）(-20 oC) l 6X Loading Buffer（10X 上样缓冲液）(4 oC)

l Cold oligonucleotides（非标记竞争性寡核苷酸）(-20 oC) l Biotin-Labeled Probe（生物素标记探针）(-20 oC) l Streptavidin-HRP（链霉亲核素-HRP）(4oC) l 2×Blocking Buffer（2× 封闭液）(4 oC) l 5×Washing Buffer（5× 洗涤液）(4 oC) l Equilibration Solution（平衡液）(4 oC) l Binding-membrane（结合反应膜）(RT) 3. 结合反应

每次结合反应需1-5μl核蛋白(根据核蛋白浓度而定)，根据不同的核提取物浓度加入核提取物用量，用双蒸蒸馏水将终体积调节到15μl （1） 结合反应体系： 10X 结合反应液 1.5μl

Poly(dI:dC)(dI:dC) 1.0μl 细胞核提取物* ? μl 双蒸水* ? μl

混匀室温静置20 分钟 生物素标记的探针 0.5μl 总量 15μl

混匀室温静置20分钟或以上。

（2）特异性反应确认竞争反应体系： 10X 结合反应液 1.5μl

Poly(dI:dC)(dI:dC) 1.0μl 细胞核提取物 ? μl

未标记的竞争性寡核 2.0μl 双蒸水* ? μl

混匀室温静置20 分钟 生物素标记的探针 0.5μl 总量 15μl

混匀室温静置20分钟或以上。 其中: 探针用量:

这相当于10-50fmoles的DNA探针。我们通常是最少50fmol.

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蛋白样品用量:

一般用量在2---20ug(控制在1-5μl)蛋白, 总体系15ul. 细胞核抽屉物浓度都比较低,组织的一般都比较高,因为杂蛋白较多.

poly(dI:dC)(dI:dC):

它由肌苷和胞嘧啶组成。由于其特定的结构，可抑制蛋白对标记探针的非特异结合，避免假复合物。 在凝胶迁移反应中加入poly(dI:dC)(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中其它DNA结合蛋白结合，比如转录调节因子的非特异结合。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly(dI:dC)(dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核 抽提液:

每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)(dI:dC)。 未标记的竞争性寡核:

做为竞争的探真来说,其实就是没有标记的转炉银子的寡核苷酸,用量一般是正常探真的50-100倍. 再这里我引申的解释一下其他的对照的含义: ◆.

常规反应

(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针)； ◆

阴性对照反应

(核蛋白＋标记探针); ◆

阳性对照

(核蛋白＋标记探针)

◆ 探针冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋标记探针100倍量的未标记探针)；

◆ 突变探针的冷竞争反应(含激活的目的转录因子的 核蛋白＋标记探针＋标记探针100倍量的未标记突变探针)；

◆ Super-shift反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋目的转录因子的特异抗体).

4.

预电泳和电泳：

0.25X TBE在冰上120V 预电泳1小时; 务必换掉预电泳的缓冲液, 用新的0.25X TB低温下150V，电泳约60分钟。 注意横压电泳的时候注意电流的数字变化,记录开始电泳和电泳结束的电流数据的变化! 5. 电转运

在0.5X TBE中390mA电转移40分钟, 注意转运膜的选择, 有一种离子加强型的转运效果比较好! 我当初选择过一般的和离子加强型的,还是离子加强型结合效果好! 6.紫外交联:

正规的应该是紫外交联仪的使用,但是很多单位没有交联仪,那就用无菌操作台上的紫外等下10cm处交联10分钟就可以了!这个数据是我做了好多次试验才摸索出来的! 条件比较成熟!可以借鉴! 7. 化学发光反应

包括Blocking Buffer 30分钟封闭, Streptavidin-HRP标记, Washing Buffer洗涤; Equilibration Solution平衡, 这些按照规定操作即可! 没有太多的细节,只是注意两点,一是期间结合膜的表面一定不能干燥!!!二是Streptavidin-HRP不能加在膜上,而是加在液体中混韵后在

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将膜放在液体中孵浴. 8. 化学发光图像显示

两种方法:化学发光数字成像与检测和感光胶片冲印成像

操作基本和Western 试验操作相当, 只是这个膜是一次性的,不能重复使用, 一定保存好图片!!! 由于跑得是非变性凝胶,蛋白保持天然构想和活性,所以代条很可能是一块一块的而不像WB那样很规整的一条细线,这个很正常!!!

希望大家交流讨论!有对EMSA试验感兴趣的可以跟贴讨论!!!

有机会发一些试验图片评论一番,呵呵这个图是做的一个有较多对照的图片,可惜的是待测的样品没有阳性,而且核蛋白的浓度很低, 结合反映中没有能足够多的加入样品的量 1.弱阳性(TNFa刺激),蛋白量比较少, 2.阳性对照,(TNFa刺激) 3.冷竞争对照;

4,P65,supershift

5------其他样品!这个图是用小鼠肾脏组织做的为来源的核抽提物的NFKB图, 就是在转运操作的时候凝胶和结合膜之间的气泡没有排干净导致效果不好!

所以以后大家操作的时候切记,气泡的危害!~!!这个图是我再用TNFa刺激肿瘤细胞后得到的核蛋白的NFKB的EMSA试验图片,后面的都没有阳性,前面的是不同的刺激浓度得到的图片,

在一般的试验中,这个图片效果还算可以,发个文章没问题

如果你觉得阳性的表达太强了,可以降低结合反映中的核蛋白量,这样带条会更好看些!!!这是一个反例!!!

这个图很明显是一个曝光过渡的图片!!!但是阳性的带相对比较浓! 所以在最后成像的时候大家一定的注意曝光时间,

最好多几个时间点, 因为毕竟EMSA的试验最后的结合膜不能在用了,这个不同WB试验, 所以这个试验结果很重要,不要吝惜自己几个胶片!!!ji结果重要!!!不错, 收藏!!谢谢, 我做的时候在请教高手!!!好贴子,

正在做,有问题肯定来打搅大家的.今天就遇一个,关于试剂配置. NP-40怎么配啊,订回来就是一瓶,没有浓度,没有分子量.

还有蛋白酶抑制剂是不是非要加啊,光有PMSF够不够,希望大家指教.我们自己用的NP40买回来 的时候也是液体(原液) ,你用多少就计算好百分比就用双蒸水稀释就行了啊, 蛋白酶抑制剂最好都加上,可以抑止蛋白酶降解的作用! PMSF是必须有的!!!

而且PMSF有毒,味道很浓!!! 操作时候注意哦!!!我现在正在委托公司做EMSA,之前做了报告基因的启动子活性检测,从活性最高的以及软件预测的有特异性转录因子的那段元件作为EMSA的探针来检测该特异性转录因子在所研究基因中的活性,我现在很担心这样做是否正确,因为拿到国外合成一条探针需要1800元人民币,再加上做EMSA的费用3200元人民币,如果由于我的实验设计错误,没有结果肯定被老板P死的,所以想请教LWP19813-4年前曾经做过，那时我和师兄摸索了差不多9个月才做出来，后来有其它同事及外校单位的同道请教我，并且发了高IF的文章，深有感触：按文献是基本搞不定的，很多东西需要自己摸。组织是非常难的，而细胞则很容易提核蛋白的。我想提醒同道，如果你做的是组织，核蛋白往往少，敏感度不高，放射自显影有时胶片不显影的，如果你单位或附近有磷屏设备，我提议以下做法绝对可行：电泳后，小心剥离胶片（过程一定小心，否则影响条带的质量，见下图），放于一块虑纸上，直接在灯下慢慢烘干（不能快！）。然后用保鲜纸封好，在磷屏下显影。国内也可以合成吧！EMSA试验一般都是用已知的寡核苷酸来做成探针, 鉴定目的蛋白是不是转炉银子的方法, 看老兄的试验似乎是用蛋白的是否有EMSA阳性结果来判断DNA的哦!

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呵呵, 不过这个不是不可以, 主要根据自己的课题来判断, 如果你觉得你的要检测的那个DNA是否会结合蛋白参与后续的基因调控, 这个结果应该也是很重要的, 因为这预示着一个信号通路的判断的关键环节!

不过我对老兄的课题不是很了结, 上面说得只是我的理解, 希望能够借鉴, EMSA试验就像楼上的老兄说得, 理论不难,但是一到了试验操作,中间的问题会很多, 如果真是条件有限, 时间有限,交给个技术成熟的公司做也是一个很不错的选择! 呵呵3.探针的制备:

又很多站友都在问我生物素标记到3’端还是5’端,其实我觉得最好还是两端都标记,这样才能更好的提高灵敏度, 国内的标记技术我还不是很了解,我们这边的探真都是国外定做的,还算可以,其制作程序如下: 合成寡核苷酸---标记生物素---纯化---退火合成双链.也是一个比较复杂的过程.

先标记生物素再退火？退火时90多度的温度会不会影响生物素的结构稳定？我都是先退火再标记的不会啊, 一般都是这么操作的啊, 做的探真用了好几年了都没问题,呵呵!!! 上面那个supershift 就是用P65抗体做的生物素标记的探针,

好多关于生物素标记的资料都是先标记单练然后退火的,有兴趣可以查一下,呵呵!!!各位前辈好：

我课题也刚刚开始，是做肠粘膜损伤机制的研究的，其中就有一项指标是测定大鼠肠粘膜NF-KB的表达的，查了很多文献，发现检测方法好多，初来咋到，也不知道选哪个方法，看到各位前辈在NF-KB检测上都有相当的经验，希望能赐教，非常感谢！

我们共有60只大鼠，我想如果让公司帮忙做的话，需要多少MONEY哦，什么公司可以提供一下吗，呵呵，谢谢，谢谢！

还有留取标本时有没有要特别注意的呀？？我想请问一下EMSA显影时的压片时间一般为多长呢？

好像听人说有在-70放一个星期的，是吗？

另外我想确认一下探针的浓度，混合物里面生物素标记探针的终浓度是多少？是fmol级别吗？有用pmol级别的吗？用磷屏常温下24小搞定显影啦，而且数据直接保存在电脑上。呵呵,你做的还真是多, 不过EMSA还是比较烧钱的啦!!! 保守估计你要是找公司代作的话保守估计的一万大洋吧,呵呵

不过标本最好是新鲜的抽提组织样品比较好,如果不想自己抽提,可以直接液氮动存!!!楼上的那个仁兄是从磷屏显影来讲, 那么我最熟悉的是非放射的,就从生物素的角度来讲;

关于压片时间, 这个不容易讲 , 因为这和你的底物发光效率,生物素标记程度,等因素有关. 但是不管怎么样,一般的底物也就是30S, 1min, 2min,这几个片子时间就差不多了,如果你还有心思,可以在压个4分钟的,呵呵!

我每次做结合反映,15ul体系用探真量是50-250fmol,不过250fmol肯定是过量的!!!通常都有很多自由探真在底下!!!版主,那个PolydI;dC 可不可以不加,要是 必须加的话,在哪里可以定到,(我用的人家别人的试剂盒,里面的用光了.)PolydI;dC是结合非特异性的一些杂蛋白,否则里面会有好多非特意的带,所以最好还是加上, PolydI;dC一般都是大包装的, 你可以搜一下看有没有分装的!请问 ：有那位大侠知道化学发光法EMSA中 洗涤液的配方？good对于EMSA，我一直都有一个疑惑。 就是EMSA究竟可信性是多少？

所谓的EMSA，其实就是在体外，将某一种核酸和某一种蛋白混合在一起，然后看它们是否能相互结合。

但是众所周知，体外环境和体内环境是完全不同的。

很有可能在体内，这种核酸和这种蛋白由于细胞区域定位的问题，根本不会相遇，也根本不会有结合的事情发生。但是在体外，当它们相遇时，它们却能结合。

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也有可能在体内，这种核酸和蛋白的浓度相当的低，在这样低浓度的状况下，它们不会结合。但是在体外EMSA实验中，核酸和蛋白的浓度都增加了好几十倍。导致反应向阳性的方向进行，这种情况又该如何解释？

所以EMSA结果阳性，是能结合的必要条件，但却不是充分条件。所以个人认为EMSA的重要性其实不怎么高。

和EMSA相比较而言，个人认为ChIP（染色质免疫沉淀）的数据还更可信一些，因为ChIP起码是活体细胞实验，但是ChIP对抗体要求较高，这是ChIP自己的缺陷。 国外现在验证某种核酸和某一蛋白相结合的常用方法是原位杂交和免疫染色。原位杂交显示核酸的定位，免疫染色显示蛋白的定位。如果两者的定位一致，那基本能肯定两者相互作用。大家好

我是初涉实验室的 医学生 很多东西都不懂 很着急 实验马上就好开始了 实验 需要用到 EMSA 技术 可我不是很懂 也从未做过 希望得到你们的指导 如果有相关的资料 谢谢你们发给我， 我的邮箱 chenming830427@yahoo.com相互交流学习嘛！ 呵呵，我也正准备做EMSA ，有几个问题不大明白，请教一下：

1 请教一下楼主凝胶的配方跟蛋白的分子量大小有关系么？我的蛋白34KD，DNA片段150bp，用你提供的凝胶配方可以么？

2 最后曝光的胶片具体是什么方法？我们实验室没有人做过这个实验，并且我们做WB时用的都是化学显色法，能否具体讲一下最后的显影过程？或者说使用的是什么仪器？谢谢啦！1。我们一般做NFKB ，AP等转录因子等都是这个配置方案，有时候也用5％，6％的，不过可不能再低，再低效果就不好了。

2。非放射性的EMSA试验最后的成像和WB一样，也是用底物化学发光的方法，可以压感光胶片，也可以用化学发光成像系统成像得到电子图片，两个各有优点，呵呵！哦，这样，这个胶分浓缩胶和分离胶么？可不可以把5％，6％胶的配方告诉我呢？谢谢呀！我没有查到，我查到的NATIVE-PAGE怎么还有分离胶和浓缩胶呢？很遗憾不能亲自看楼主做一遍，会帮助我很多啊还有一个问题忘了问，我的蛋白是从细菌里提取的，包涵体蛋白，实在得不到可溶的，所以是经过变性复性后得到的蛋白并且没有纯化，EMSA试验可以做出来么？我请教一下,电泳完后,切胶转膜时如何把握切胶的分寸.谢谢大侠啊小弟最近正要做EMSA方面的内容，遇到几个问题需要向楼主请教

1.小弟做的也是NFKB，想问一下楼主，楼主的探针是自己设计和标记的么？还是有专门的试剂盒提供，小弟查了一下pierce公司的EMSA试剂盒并且电话询问过，对方说探针要自己设计。如方便的话，楼主是否可以告知您设计的探针序列及标记方法，或者介绍几个不错的生物公司帮忙设计和合成生物素标记的探针。

2.请问楼主用的是哪种核蛋白抽提试剂，能否介绍几个效果比较好并且价格不太高的。小弟初次接触EMSA相关的内容，感觉有很多地方还是不清不楚，迫切希望楼主的帮助和指导。能否请楼主留下联系方式，邮箱或者QQ,小弟的QQ是705786937，方便的话请加我，多谢。我给的做胶的资料中，你可以计算一下凝胶的浓度，我给你的是6.5％的，你可以按照比例计算一下，用双蒸水补齐其他就行！我平时用的是6.5％的！

这个不分分离胶和浓缩胶！这个不好说，只要你的蛋白天然构象没有改变，结合活性没有变化，就应该没有问题！这个站友怎么说切胶转膜啊！ 呵呵，如果多余的胶你可以切，在转啊，不过我很少切，也没怎么切过，一般都是直接转，电泳的时候留点羞愤兰做标记，掌握一下，呵呵bayunye战友做EMSA试验，港开始是比较难，因为这个试验涉及的东西太多了！

我觉得如果有现成的探针还是用现成的比较好，我们的探针都是国外定做的，回头我将我得序列发给你，这个序列都是公认的！

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相关的资料我回头在发给你！

另外你做的是细胞还是组织？啊好的，谢谢楼主！我会试试，非常感谢！看到了LWP兄给我发的信息了，不胜感激，在此谢过LWP1981战友您好:

我最近做了一次,曝光什么都没有,连探针都看不见, 没有荧光. 我不知道哪里出问题了,很着急,

考虑是a. 蛋白太多了, b. 转膜时,只要胶上看不到溴酚蓝就说明转完了吗? c, 连接的时间是不是越长越好,

我找不到原因,使用过的呢绒膜可以再连接吗?

真得很感激您,为我们提供宝贵的经验,iceangletree，

没有探针得话，要是找原因，那就多了，探针问题？转运问题？紫外铰链问题？底物化学发光问题？

蛋白上样量也不宜太多，太多了效果也不好！

电泳得时候留点羞愤兰，转膜得时候可以做为指示！

另外转运用的尼龙膜是一次性得，不能重复用啊！！！去年做过一次EMSA，当然了，转录因子浓度比较高，所以很顺利。探针是从公司合成的2条互补引物（24 bp），都是5'端标记上Dig，拿回后按等mol数混合、变性、缓慢退火。调整探针浓度至1ng/ul。 都按照常规方法做，就是注意几点：

1、凝胶一定要提前几个小时配好，避免凝聚不完全；

2、一定要预电泳至电流不再变化为止，用枪将加样空冲洗干净；

3、电压还是稍微高一点好。（我是-bio-rad III的小电泳槽，预电泳200v，电泳是200v 10min，150v 20min）当然要用冰合冷却了。高电压快速电泳可以避免探针掉下来。 4、转膜时候不要时间太长了，电压也不能太高。我用biorad电转，25v 25-30min足够了。 个人感觉，EMSA成功的关键还是蛋白的质量和转录因子的浓度。请教高手,我电泳160v 3h 的结果 ,是不是仅有探针,没有我的蛋白.

我的蛋白是10ug.探针加多了是20pmol. 溴酚蓝的位置,我曝光后就是几团黑, 非常感谢. （缩略图，点击图片链接看原图）非常 感谢LWP1981 等 战友给予的帮助,iceangletree，你这个图，2，3，4，样品的上部各有一条带，按照我经常做的经验，那个带应该是阳性带，但是这个需要做个对照核实一下，可以在边上做一个冷竞争探针，阴性对照，阳性对照之类的，

另外我还有疑问就是。你的电泳怎么还是160V跑了3h，正常来说你的电泳时间太长了啊，我正常也就是160V电泳1h，电泳的电流开始的时候是13－15mA，电泳1h后电流强度是10mA左右。

另外按照你的量探针的量确实很多，但是free probe信号不强，而且跑了3h，后面还有那么多的空间没有跑到头，这点有点不对头，所以更详细的应该知道你的电泳缓冲夜和电泳时候的电流情况1非常 感谢LWP1981你好，我是用promega的试剂盒来做生物素标记的EMSA的，本来之前已经试好了条件，做出来的片子效果也还可以，但是现在系统中不知哪部分出了问题，压出来的片子总是会背景很高，时间一久就成了张黑板，所以想请教一下，可否知道是什麽原因，多谢！楼上的，一般背景比较高的因素很多，封闭液配置，封闭的时候膜不能干燥，HRP不能不均匀的加载膜上，封闭的时间，曝光时候底物的发光效率，曝光时间。。。。都是要注意的！ 这个试验虽然看起来简单，要是顺利的话，很容易就出结果，但是稍有不留心，结果就不好，或者很差的结果，要是找问题还是比较麻烦的！多谢搂主指点，我再试试这是我用pierce试剂盒做的，左边3个是标准品，右边是我自己的探针和蛋白。核蛋白浓度BCA测的是2mg/ml，反应时20ul体系加了1ul蛋白，20fmol探针，从做到右是探针、蛋白+探针、蛋白

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+探针+ 冷探针、蛋白+探针+突变探针。最右边一个孔没压出来，时间太短了，有一张压了20分钟的压出来了。

都没有蛋白与探针结合的条带，请问到底是为什么呀刚刚发的图倒了我做的是组织的NFkB,设计的探针是根据SANTACRUIZE的说明上设计的。 万分着急中，谢谢各位高手啦谢谢楼主的经典帖子，我目前正做EMSA实验，遇到不少麻烦，楼主的信息解决了一些疑难。现有些别的问题想请教一下，关于探针设计的问题，我猜想DNA/PRO结合带中可能是某种转录因子，比如说是CTCF因子，那么我要设计特异结合CTCF因子的竞争探针，请教一下这样的探针应该怎么设计，遵循什么原则？片段的长短有要求吗？（我查文献得知CTCF因子主要结合CCCTC结构，请问探针设计的时候要多长的片段，需要加保护歼击吗？光那么段的片段会于蛋白结合吗？）注意看看！学习中！一般而言，探针的制备都是配套的，就是标记的探针和冷竞争探针，其实冷竞争探针和探针的DNA序列是一样的，一般的转录因子结合探针都是结合某一段关键的几个碱基，但是几个碱基很不稳定，所以两头就要加一些稳定的碱基，做成23bp左右的大小片段，然后计算位阻，5，3，端标记，纯化，退火等，得到你要的探针用于EMSA实验！dawnblack,

你的片子背景到是很干净，但是没看到阳性的带啊，只有自由探针的东西啊！检查一下你的探针和样品核蛋白的质量！ 一般如果没有阳性带，最起码应该有个非特异性的带！楼主这就是我苦恼的地方啊,只有自由探针条带,现在不知道问题到底出在哪了,你说探针质量是什么意思,怎么检查,而样品质量又怎么检查呢,我的探针是生工合成自己退火的,序列是用的通用序列,不知道会有什么问题呢我也用的pierce公司的kit

不知道blocking buffer可以自己配置吗?哪位兄弟能告知下配方哦.谢谢.我也用的pierce公司的kit

不知道blocking buffer可以自己配置吗?哪位兄弟能告知下配方哦.谢谢.我哭啊,为什么我做了一个礼拜都没有阳性条带出来啊核对谈针的序列，生物素标记位置，探针浓度，工作液浓度，退火操作是否正常。。。 浓度的计算等1

我正常使用的是200fmol，（这个是过量的！）好贴子,收藏！kit自带的blocking buffer用得真得很快呀！有谁知道blocking buffer的配方阿？楼主，您好！从你发的关于EMSA的知识，我受益匪浅。我课题方向是WNT通路，刚开始进行试验设计。不知您是否做过关于WNT通路中，用EMSA检测TCF-4的DNA结合能力。可否给一些指点，谢谢！LWP1981战友：

你好！从你发的关于EMSA的知识，我受益匪浅。我课题方向是WNT通路，刚开始进行试验设计。打算做关于WNT通路中，用EMSA检测TCF-4的DNA结合能力，不知您是否有做过，可否给一些指点，谢谢！我没做你的转录因子，不过这些都是相通的，不同的地方只是在探针的设计和研究对象的不同 而已！！！有问题可以pm我我后面做EMSA的蛋白是原核表达提取的活性蛋白，现在只对蛋白进行了亲和纯化，这样的蛋白直接做EMSA对实验有影响么？请教楼主及各位高手：我做EMSA 先是做标记探针后标记效率的检测，可正张膜都发荧光，是不是膜就没封闭呢？我用的是碧云天的化学发光试剂盒，封闭液和洗涤液都是清亮的！想请教一下，我是药品刺激24小时后测组织NF－KB，－70度保存，不知道这样设计NF－KB能不能测得出来？你的问题有几种可能： 1，HRP加多了，

2, 封闭液，洗涤液，平衡液都没有起作用！

这种情况还看不出探针的质量，探针的质量主要是通过条带判定，纯化的蛋白要是复活了，蛋白保持了天然构想和结合活性，具有结合DNA的能力，可以用EMSA来检测的。那主要看你属于那种药物了，药物的作用原理来决定你刺激的有效时间，象TNF等药物就是短时

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间作用了，一般做组织－70短期保存没什么问题！万分感谢楼主LWP1981 百忙之中的答复！

再请教最近实验遇到的几个问题：

1、我做的是SP-1，用的是6%的非变性胶，电泳100V 1h45min，溴芬兰跑到了2/3处，是不是电压有点低？时间有点长呢？会不会影响结果呢？

2、转膜用的是380mA 45min。可也没用溴芬兰印记（像你前面提到的跑胶时留点溴芬兰，看转膜的效果，可我的膜上什么痕迹都没有，兰色都没，我用的是硝酸纤维素膜。）这是什么原因呢？是不是电流大？时间长了 ？

3、转完膜以后是不是把膜上的液体吸干后就可以马上进行紫外交联了？

4、设计探针（22bp大小）时除通用核心结合序列外其它碱基的设计选择，对蛋白结合有影响吗？

先提前谢谢各位大侠百忙之中的关注与支持！1.影响不大，不过要低温电泳！ 2.电流不大，注意看看电压变化，另外我们都是用的尼龙膜！ 3.是这样交联的！

4.其他碱基主要保护作用！LWP1981战友： 你好！我打算做关于线粒体转录因子A与线粒体DNA的D-loop区的结合能力，不知道有些什么不同，能否给些指点？谢谢！我刚开始做实验，想做NF－kB，有些基本的问题想请教，试剂盒都从哪里订的，请推荐几个公司，万分感谢楼主啊，我终于找到组织了。

我用的是invitrogen的EMSA。做的是NF-κB。探针可以泳动，蛋白质很慢，结合物就根本没有出点样孔。电泳条件是100V90MIN，0.5×TBE的PH8.3，蛋白质7.8ug，DNA1.75pmol，为什么啊？急切！ 盼！我的QQ是187331354方便加？手头上暂时只有这张图，帮忙鉴定下。祝楼主万事如意，万寿无疆。似乎你的蛋白体系有点问题啊，加样孔好多都没进胶， 我通常用0.25×TBE的PH8.3

探针用的200fmol，电泳一般用160V涌动！你这个问题主要是设计好了，有结合就可以进行，呵呵什么样的蛋白体系好啊，我蛋白只加了7.8ug啊，就是探针的量有点多。我跑了蛋白maker，72kD的跑起来都没有问题啊。电流大概是5mA，会不会有点低？和binding buffer 和蛋白本身的活性有没有关系？5mA电流太小了啊,我通常都是到了13-15mA了!蛋白结合反应一般是5ug!LWP1981战友： 接着请教一下，线粒体转录因子A与线粒体DNA的D-loop区的结合是有的，国外有人做过。只是因为线粒体转录因子A存在于线粒体中，所以是否第一步应该提线粒体蛋白？其他的还有什么不一样吗？谢谢！LWP1981战友： 接着请教一下，线粒体转录因子A与线粒体DNA的D-loop区的结合是有的，国外有人做过。只是因为线粒体转录因子A存在于线粒体中，所以是否第一步应该提线粒体蛋白？其他的还有什么不一样吗？谢谢！请教一下，提组织核蛋白的试剂盒用哪个公司的好？想问一下大家，你们提取的蛋白透析和纯化了吗？PIERCE 货号78833我跑了150V9MA还是没有动 可能是蛋白的问题 你要透析或者纯化吗

试剂盒选的哪种？请楼主指教一下啊!我想在invitrogen公司合成NF-KBp65的探针,给我序列的那个同学说是合成两条,两管分装的,拿来后融解再聚合的.您的帖子中说的好像直接就合成双链了,我是不是可以要求公司直接给我双链的探针.

我以前没做过,可能是比较幼稚的问题,不好意思,请指教.一些公司有现成的NFKB的标记好的探针工作液，干嘛还得自己合成啊，直接买来就用了，还省事情，呵呵

要是制作的话当然是单链标记好后纯化，然后自己退火合成双链！呵呵，我没用过这个都不敢推荐，哈哈

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用过感觉比较好才敢推荐，哈哈那我要买NF-KB的探针工作液,我不想费事,我需要可以做人和小鼠的生物素标记的探针,最好能保存时间长些.不知哪个质量好的公司肯单卖这个探针?多谢关注!!!谢谢楼主,推荐一下好的尼龙膜吧!大体说一下过程，楼主帮看看原因所在： 使用碧云天gs009试剂盒。

NF-KB探针自己标记，斑点杂交检测效率约为50％，没有纯化探针，杂交结果尚可。 但是核蛋白结合后转膜杂交根本没有信号，主要过程如下： emsa 的page胶： 5* TBE buffer 2ml 水 14.2ml

29：1 arc/bis 3.2ml 80%甘油 600ul 10％ap 150ul

temed 10ul

凝聚3小时后，上样，无溴芬兰。

（说明书上说10×的TBE buffer使用1ml，我的是5×buffer，使用2ml对么？ 是不是说明书上的10×意思是稀释到0.5×，所以我的5×buffer可以理解为10×buffer？？） 转膜

0.5× TBE buffer 作为缓冲液

380mA,60分钟。这次制冷效果不好，出现胶黏到膜上的情况了，但是我多转了两个无关蛋白，剪膜下来使用立春红染色效果很好（虽然有胶的碎末在膜上，但是蛋白条带清晰可见） 出现胶黏到膜上的情况是不是因为产热太多？？？ 交联和显色

这些步骤和检测效率的方法一致，斑点杂交检测效率感觉很好，但是不知怎么的，预实验四次了，转膜后的显色结果总是惨不忍睹，楼主及各位有什么高见？

这是最近一次结果，如下（从左到右顺序,电泳方向从上到下，无冷竞争泳道： 游离标记探针泳道 结合泳道1 结合泳道2 空泳道）：

（缩略图，点击图片链接看原图）奇怪的是，连游离非结合探针泳道也没有成形的显色，而探针直接点膜杂交显色的效率检测结果很好，为什么会这样？ 转膜和核蛋白结合有什么问题么？楼上的哥们，你写的很多，问题也很多，最起码的探针没有纯化都敢用！！！这个危害很大的啊！

纯化的问题没解决，后面的实验结果就是操作在对也不实在了！！！楼主的帖子实在太好了,我也和各位EMSA的实验同志们一样遇到一些问题

我4年前也做过EMSA,是同位素标记的,在别人的实验室,一切条件都很成熟,我就没遇到什么问题,重复三次结果都很好,文章也发表了,点值还比较高,但我对可能遇到的问题就没办法解决了.

现在我用生物素进行标记,用的碧云天的KIT,也遇到楼上一位兄弟所遇到的情况,我用KIT的自带探针检测标记效率,显色时膜上一片荧光,肉眼都可以看见.HRR的稀释比例是按KIT推荐,我怀疑是紫外交联的问题.今晚按楼主推荐超净台10cm下10分钟,HRP也将稀释浓度提高一点,试试看,有好的结果向大家报告.

也不知那位兄弟的问题解决了没有,如果封闭液\\洗涤液\\平衡液出问题就只有找公司了.有一个情况我刚忘写了

不知封闭液\\洗涤液\\平衡液各起什么作用,

封闭液\\平衡液都用的KIT的原液,洗涤液KIT推荐用重蒸水或miliQ级水1:5稀释

现在的实验室没有,我用的去离子水稀释,会不会是洗涤液没有作用,导致整张膜都发荧光为

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什么呢？

我是第一次做，所以按照盒子上的建议说不纯化也可以，我怕纯化后丢失，所以没有纯化。纯化的时候能加糖原载体么？为什么呢？

我是第一次做，所以按照盒子上的建议说不纯化也可以，我怕纯化后丢失，所以没有纯化。纯化的时候能加糖原载体么？报告大家,我今晚用没有稀释的KIT自带探针、HPR稀释比例1:4000，检测到了!!!!说明紫外交联及之后的步骤都没有问题。 不过膜上还是在暗处肉眼可见一片荧光，说明KIT推荐的HPR稀释比例1:3000过高，下次还需调整到1：5000，否则背景太深。

同时还说明了一个问题，KIT自带探针的标记效率也不高，按它介绍的最高1：50稀释根本检测不到，更不要说1：100，1：500及更低的稀释比例了。

我标记的探针纯化过，没稀释的也没检测到荧光，看来标记效率就更差了，但还是鼓起勇气往后做做看，退火后再检测一次双链的效率，然后再继续走完看看。 青石战友如果将探针纯化后能检测到标记效率再来看后续的实验吧。

其中提到的一些问题：冷竞争指没有标记的探针进行的实验，Poly dI-dClouPolydI-dC的作用楼主在前面已经叙述非常清楚;

转到膜上的是蛋白质-DNA复合物,探针,蛋白质,只有探针和结合了探针的蛋白质最后会检测到荧光;

我没有发现什么地方需要去除SDS

EMSA胶中的甘油的作用我不是很清楚,是否可以请教下楼主纯化的目的是去掉没有标记的双联, 而发光的是标记好的双联,但是结合蛋白的只要序列相同都可以结合,所以如果是阳性可能变成弱阳性,弱阳性可能就是阴性了!

没有纯化,从根上就没有过关,后面的问题就更大了!!!sds会变性蛋白,蛋白变性了就没有结合活力了,EMSA试验就失去意义了,

凝胶种的甘油主要是调节样品和胶的渗透压平衡!!!可是kit的纯化方案就是酒精沉淀啊，那不是标记和未标记的都沉下来了么？ 谢谢你的回答

另外想请教一下，为什么叫冷竞争？ 冷指什么意思？

再次感谢SDS的作用我知道,在EMSA实验中没有什么地方需要用SDS啊,当然也就不用去除

是因为青石战友有这么一问,所以我不明白他在什么地方需要去除SDS 青石战友提到的冷竞争

指的是没有标记的探针和标记的探针进行竞争结合靶蛋白上的结合位点 按青石战友的提法,冷在这里可以理解为没有标记的探针哦 有意思呵呵 那么说标记放射性探针称之为热探针了？！

我们知道emsa的装置肯定是和蛋白电泳混用的，但白点用的sds会残留的，所以我才说去掉sds，不知痕量级的sds有没有影响？ 谢谢回答，祝讨论愉快。问题1 ：

可是kit的纯化方案就是酒精沉淀啊，那不是标记和未标记的都沉下来了么？ 问题2：

标记放射性探针称之为热探针了？！ 问题3：

凝胶种的甘油主要是调节样品和胶的渗透压平衡! 如何起作用的？ 抱歉 问题越来越愚钝了青石战友用的是不是碧云天GS008KIT? 我刚发现它的说明书有个很大的错误!!!!!

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(不知以前 用过它家KIT的战友用的情况怎样,还是我自己做不出来找的原因) 我想先请问下你在进行效率检测时是在它推荐的哪一个浓度上检测到荧光的? 看你前面的介绍,你是用的点杂交的专门设备吗?

我就是直接点到膜上进行检测的,只有KIT的自带标准品没有稀释的情况下(400nM)可以检测到荧光.

按照它的说明书探针标下来顶天达到20nM的浓度,根本检测不到,更不要说后续实验了. 我已经给公司发email了,希望大家一起探讨,尽快将实验开展起来!!!呵呵,探针的制作不是那么容易的!!!尤其是自己以前没做过,然后买盒子来作,把握很不足的!!!哪里可提供生物素标记服务呀？谢谢了！可以买现成的,不过只有常用的几种!比如NFKB, SP3等谢谢楼上的，可是哪里可以买到现成的啊，碧云天不提供这种服务。我就是做NFkB的VIAGENE , 给你发了pm消息, 你自己看吧!青石战友用的是不是碧云天GS008KIT? －－－－

是的，但是我觉得我的问题是探针上。

探针也是碧云天的 好像有问题 ，但是直接点膜很好，一跑胶就非常模糊，我今天用银染看了一下，探针和蛋白结合的泳道几乎什么都没有？？？？ 而且单纯探针整个泳道黄乎乎的，真是晕死啊？难道反应过程中把我的探针消化掉了？？？？有没有这个可能？？

另外，今天重提了蛋白 但是检测显示在225和310各有一个吸收峰值，为什么呢？280周围没有吸收峰？

问题多多啊 谢谢回答楼上的战友，我也用的碧云天的标记KIT

在标记的50ul体系中，有water, TdT, TdT buffer, probe, Biotin-11-dUTP 其中Biotin-11-dUTP的终浓度可达到0.5uM, 探针纯化可去除TdT buffer和Biotin-11-dUTP

没有纯化的探针点杂交效果虽好，但是要考虑是Biotin-11-dUTP的贡献，实际探针的标记效率并不高，这对后续实验影响是致命的。

我开始用的NC膜，暗室一片荧光，杂交效果一塌糊涂

前面也有战友提到暗室里看到膜上一片荧光的状况，估计也是用的NC膜

换用尼龙膜后就没有背景了，边摸索条件边把经验告诉大家，避免走弯路。今天跑了下胶,150V, 1h,10mA

转膜用的是Bio-Rad半干转印仪,开始380mA恒流,电压从开始的25V转10分钟后达到95V;我担心电压太高,发热,又改为25V恒压,20min,电流在128mA,转膜完发现还是有些发热,胶比较模糊,在空泳道上点的溴酚蓝倒是完全转到膜上的.跑胶后泳道没有变黄,是转膜后膜局部有些发黄.我在跑胶时也跑了一个多余的蛋白,转膜后用丽春红染色检测下转膜情况,在加样孔下方仿佛有一条带,而且尼龙膜就没法洗干净,整个红透了.我想是因为EMSA电泳条件和转膜条件\\膜都和Western所用不同,没有可比性.只有最后化学发光检测才知道. 今天没有时间做后面的实验,可怜啊,没有暗室,只有明天天黑了来做实验. PS: KIT推荐的是湿法电转膜装置,390mA(100V) 30-MIN,转印槽放冰浴中. 我想请教下楼主:

1.请问你用的是湿法电转还是半干电转?转印过程是恒流控制吗?那电压大致在什么范围内? 2.转膜后膜会不会出现变黄的现象?需不需要象western那样,转一个多余的蛋白,然后剪膜丽春红染色大致检测下转膜情况?

先谢谢了!呵呵, 好几天没来,好热闹啊!!! 楼上的哥们,

我发在坛子里的操作步骤和试验条件都已经是经过好几百次试验后的结果了,你怎么还在这

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摸索啊!!!

好好看看我给你的中文操作步骤, 没必要在模了, 在模都是浪费你的时间和费用,呵呵~ 尼龙膜不能立春红的,要是染了就废了,呵呵! 洗不干净的!!! 我一前试过! 呵呵湿法电转: 390mA 横流40min 电压基本在港开始70-80V 40min后电压50-65V

不同电泳仪器,稍微有点差异@但是要考虑是Biotin-11-dUTP的贡献 你说得对，但是生物素能固定到膜上么？我不知道，但是不排除。

第二我用变性非变性page检测了一下探针，发现探针泳道没有任何东西，不管是标记未标记。是不是探针完蛋

了？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？晕死！探针也是买的碧云天的，今天自己合成了，真是！！！生物素是标记在基因序列上，膜结合的是DNA和蛋白，交连后就很牢固了，所以，一般来讲没什么问题，除非你的探针有问题，那就是实验根本的问题了！！！这个很重要！！！探针问题是基本的问题，也是很重要，关键的问题！一定要重视！

如果探针搞不定，后面操作在正确都不会拿到结果！游离生物素能标记在膜上么？ 探针检测使用银染可以么？

谢谢。自由探针可以结合到结合膜上！！！，

不过我还是觉得你没有必要把那些时间和金钱浪费到自己搞探针上，好一点的还是买个现成测定好的工作液合适！除非你是研发自己的探针，呵呵，这东西不好弄，我们实验室的都是国外专业公司定制的，老实说人家做的确实不错！！！你是说游离生物素能标记到膜上？ 嗯，我也打算买一个现成的算了。emsa真的就是蛋白和探针的问题，大实话啊。当然，你看一般的图片都有自由探针在底部，都是转运后经过紫外教练结合在结合膜上面的！我也是做NF_KB的EMSA实验，低温下电泳80分钟，转膜显色后，整个膜长约5CM，发现自由探针和探针+蛋白两条带之间很近（<0.6CM），而且在加样孔下面0.5CM处有一条明显的带（较探针+蛋白带亮），这条带与探针+蛋白带之间距离很远（>2.5CM），自由探针带很亮，请问战友，自由探针与探针+蛋白之间的距离有多远呀，那个加样孔下面明显的带怎么解释呀，我都怀疑这个探针+蛋白带是不是真的呀？收藏，谢谢！准备做EMSA，要从组织抽提蛋白，怯阿！以后有问题在具体请教！按照你的说法，应该上面的那条带是阳性带，但是为了确保，建议做个冷竞争对照确定一下！挨着探针的那个应该是非特异的带！～组织的蛋白有时候也不好提取，注意专用的EMSA试剂盒，和相关文献的查询！！！谢谢版主，今天再次做了一下，阳性对照（用皮尔斯公司的样品）、阴性对照、冷竞争和突变冷竞争都做了，加三个样品共做了七条带，但割胶的时候没留加样孔下0.5CM以上的地方（我昨天怀疑它是非特异性带，探针以上的那条带为NF_KB带），结果今天所有自由探针上面都有一条带，现在我把昨天的图片和今天图片都发过来，请你帮我看一下。这是昨天的图

3.tif (219.55k)不好意思，我本来想把图片改成JPG格式上传的，但一更改就非特异性条带就没有了，所以就用文件夹上传了，麻烦你再帮我看一下今天的图片。

4.tif (219.55k)的3，4两张图，就图片而言，我倒是觉得上面加样空下面0.5cm处的那条带可能是阳性的带，我一般做NFKB－EMSA实验，结合膜的长度大概是7cm，底部是自由探针，上面的位置是阳性的结合带！这个主要和你的电泳时间有关，下面的都是非特异的带或者是自由探针条带！另外纯的再有探针是比溴酚蓝跑的快！

要想确定最好做个冷竞争竞争对照看看！！！这样更把握！感谢LWP1981，今天又重新做了一次，冷竞争阴性对照也做了，凝胶上下均留了，跑电泳的时间延长（低温150V、90分钟），结果发现除阴性对照外那条所谓的阳性带还在，但我觉得那条带离加样孔很近，估计

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也就0.2－0.3CM，我怀疑是蛋白没跑出来孔，但我今天转膜后紫外交联（离紫外灯10CM约15分钟）时发现一个很有意思的现象，在离加样孔约1CM的地方出现一条白色带（阴性对照的这条带有点靠前），我开始怀疑是蛋白沉淀，结果封闭结合辣根过氧化物酶、漂洗后这一白色带不见了，想请问那条白色带可能是蛋白吗？还有你认为紫外交联多久（我转膜是半干转）合适，不会引起结合带被洗脱（我做了五六次，每次发现膜上非特异性带很少，几乎没有背景）？

附件内为今天做的图片，从左至右依次是冷竞争、三个样品及一个阴性对照。麻烦你再次帮我看一下。

3.tif (219.55k)非常感谢这个板块的存在，受益匪浅！做了近两个月的emsa，摸了很多的条件，都只看到自由探针的条带。突然想起有次在加样孔下面一点点有个条带，以为不是，看来是错了，以前膜的长度就四五厘米，那次有近6cm，看来是目的条带的位置没被转到膜上去。给你的意见已经回复了你的邮件了! 包括中文操作步骤,其中的试验条件,比较成熟,你可以参照一下!谢谢，但我这边有些条件不一样，实验室只有半干转仪器，另我是在紫外灯交联过程中发现离加样孔约1CM处出现一条白色带，交联后在可见光下也可见，我当时怀疑是不是反应体系内东西（如MgCL2、结合缓冲液等）盐析造成的，用封闭液封闭后就不见。你说的那个带,说真的,我还没看到过, 港开始我还以为是不是某个特异的蛋白在紫外光激发下的蛋白,似乎不是,不过封闭作用,会史非特异的杂带杂质等封闭掉! 我觉得你应该在蛋白样品上招招问题!

另外,半干转的方法,我没有用过,不过以前一个朋友用过,好像是200mA转了60min~

你可以试试!小弟买了Roche公司的\gel shift kit, 2nd Generation\第一次做没什么经验，kit

买回来也没仔细研究，快做了才发现还要自己准备一些东西，现在就差 1) Hibridization bags;

2) X-ray film; （Roche叫 Lumi-Film Chemiluminescent Detection Film）

3) nylon membrane, positively charged

这三样东东，Roche都有的卖，但订Roche的东西至少等1个月（小弟在南京，是博飞代理的），现在真等不及了。

有哪位大侠帮忙推荐一下那家公司这三样东西比较好，而且长年有现货的。先谢谢了！by the way,

小弟邮箱gumian7@sina.com刚合成了生物素标记的NF-kB 的两条寡核苷酸引物,用什么试剂溶呢? 退火条件是什么?有人知道吗?你是在哪个公司合成的，据我所知，上海英骏合成的是用100nmol Tris-HCL,10nmol EDTA 配制，复性液（10*）为100nmol Tris-HCL,10nmol EDTA ，1mol NaCL。10ul退火体系为：两条寡核苷酸引物100nmol/ml各1ul,复性液1ul，DEPC处理的双蒸水7ul。退火条件为：65度10分钟左右，自然冷却至室温（约一小时）即可。

皮尔斯合成的探针又说退火条件为：两条寡核苷酸引物混合后维持95度5分钟，后自然冷却至室温。

第一种退火条件我用过，可以，第二种方法我一个同学用过，也可以。都可以试试。 如果担心退火条件不好，可以退火后用2ul跑一电泳看看有没有带。

记得退火后分装保存于－20度。你合成的探针一般,给你的单字上都提供融解退火条件的!!! 你可以根据他提供的条件退火!

注意, 一般不同的探针GC等含量不同,TM值稍有不同,我现在做EMSA也是用的PIERCE的试剂盒，我的protein-DNA complex好像是沉淀在加样孔里了，不知道怎么办。另外我的蛋白质是外源表达的纯化蛋白在20uL体系里加了45ng和90ng，都沉淀在加样孔里了，不

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知道是不是蛋白质的量多了？我这个蛋白分子量是12KDa左右。有经验的朋友帮帮忙啊！搂住,我最近要做st的转录因子,准备用的VIAGENE公司的盒子,他们的盒子里面也包扩了标记好的探针和结合膜,不用自己在找探针等东西了, 你用过没有,给点意见,不知道有没有人用过Millipore的EZ-TFA试剂盒呢？号称是替代EMSA的产品，实际效果怎样？我就是在英骏合成的,给我的是粉末,你说的复性液10乘的浓度也很低是不是可以用PCR buffer来配啊? 那引物可以用水溶吗?我现在用PIERCE公司的试剂盒做NF-KB的EMSA,我想问的是上样电泳时,上样缓冲液对NF-KB和探针的结合到底有无影响.我们最近都是按说明书上说的每个20ul反应体系中加了5ul上样Buffer.很多文献和园里的都说上样Buffer可干扰NF-KB和探针的结合,有用过PIERCE公司的试剂盒做NF-KBEMSA的大侠,能否给点意见.有图吗,我们也发现最后发光显色后在加样孔下0.1~0.3cm处有很亮的条带,不知道是什么?正考虑是否是蛋白是否过量呢,你有图吗,一起看看,望能找到答案请问你这张图中NFKB的阳性带到底是哪条?条带很多,能否给我们表一下,太感谢你了!!你可以考虑用15ul，10ul反应体系试试，我平时经常用10ul和15ul的，

另外加样的时候把孔清理干净，把加完loadingbuffer的样品高速离心一分钟在上样！我们实验室有几年了做EMSA也是用的是VIAGENE的盒子，好处就是配套齐全，不用自己在摸索条件或者购买结合膜等之类的不全和试剂，尤其是他提供了调剂好的探针工作液和成熟的实验条件倒是最大好处！

但是不好地方就是仅仅限制在NFKB，ST,AP-1 ，等他们有的几个转录因子上，如果要是新的转录因子的话他就没有优势了而PIERCE的就占了优势，但是PIERCE的劣势也是确是在盒子里东西不全，还得自己购置结合膜，制备探针等，尤其是制备探针有时候煞费心机，呵呵，

所以两个公司的有所互补，应该取长避短！

你可以根据你自己的需要来综合利弊挑选，要是在他们的范围内的话，我觉得还是viagene的就不错，要是你做别的转录因子PIERCE的就不错！loading buffer是对反映体系有一定的危害。危害主要是里面的溴酚蓝对protein/DNA复合物有抑制作用，

所以在这点上客观的来讲，我并不赞同PIERCE的loading buffer， pierce的loadingbuffer 溴酚蓝含量很多，在这点上我倒是比较倾向VIAGENE的，loadingbuffer中的溴酚蓝很淡！呵呵，这个图是我做的原图，里面有阳性，阴性，竞争，supershift， 很简单靠上面就看的出来！LWP1981，你好，我想请你帮我看看我的结果，我做EMSA也有一个多月了，但是做出来的东西总是不尽人意，我是自己在公司合成的探针，用的PIERCE的KIT，碰到的问题是200倍非生物素标记的探针总是无法完全竞争掉，于是我用了500倍，1000倍，可以竞争掉一个区域的条带，但是我需要做的是该探针和两个转录因子的结合。泳道分别是Free probe ,蛋白1+probe,蛋白2+probe，蛋白2+500倍非生物素probe，蛋白2+1000倍非生物素probe，蛋白+抗体1，蛋白+抗体2。是不是我上面的那条带是非特异性的？楼上的，没看到你的竞争有什么效果啊！！！还有抗体那一栏的！！！ 还有就是注意一下，冷竞争反应中加入探针，不只是量的不同，顺序也是不同的！！！谢谢，是的，我做了几次都是这样的结果，冷竞争竞争不掉。也不知道是什么原因，冷竞争反应中我是先加非标记的探针和核蛋白孵育二十分钟以后再加的生物素标记的探针的。顺序应该是这样的， 我们通常用20－50倍就可以竞争掉了！ 如果竞争不掉，你哪个可能就不是 NFKB阳性了，建议最好弄个阳性对照验证一下看看！请教楼主及各位前辈： 我即将要做NF-KB的EMSA,看到大家的帖子，感觉很幸运。

在此有一个问题想请教：我们实验室只有用来做western blot的电泳仪和转膜仪器，请问用这个可以做吗？还是需要买特殊的仪器？

谢谢！不好意思，在请教个问题：supershift用的抗体是抗转录因子的吗？这个方法和不叫

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抗体的有何利弊？

谢谢！做非反射性的EMSA也用不到别的特殊的仪器，有WB的那套装置就可以做了！ 至于抗体，EMSA有专用的EMSA的抗体，你可以，这个抗体一般不同于WB的！十分感谢：）各位大侠：

我是新手，准备测NF-KB活性，用PIECE公司的试剂盒，有谁在用或者用过啊？能否给点资料啊 这是我的QQ：76273135 谢谢啊我想问问你们做EMSA用的核蛋白是用KIT抽提的吗？用的是哪里KIT？我用的PIERCE的胞浆核蛋白抽提试剂盒，做的结果不满意，是不是因为核蛋白的质量不高？回头我给你中文操作步骤,呵呵目前市场上KIT很多的, 还是用专用的比较好点, 不过觉得PIERCE的比较贵,呵呵

viagene的!EMSA有专用的EMSA的抗体？请问下，这种抗体有什么特殊要求？我是刚开始准备做NF-KB活性检测，需用PIECE公司的试剂盒做EMSA，新手上路，啥也不知道，也没人教，只能拿着说明书做，各位大侠能否不吝赐教啊，这是我的qq：76273135请问各位前辈：EMSA试剂盒哪家公司的比较好？参看前面的帖子回复,主要看你做什么转录因子了, 市场上好几个,各有各自的好处,

根据自己的情况定了, VIAGENE, pierce,等的有EMSA专用的抗体,他们的抗体说明书上有, 我们用的是SANTA

的,浓度很高!摊子里面资料多了,可以自己学习学习,呵呵,慢慢来刚开始做EMSA ，买的PIECE公司的试剂盒做NF-KB活性检测，各位大侠有中文操作步骤吗？我的邮箱是xiaoying0218@yahoo.com.cn,不胜感激请教楼主关于提核蛋白的问题，我要做的是大鼠肺组织，买了pierece的核蛋白提取试剂盒，请问一般每个标本取多少mg组织来提？因为我的标本有七十多个，取的组织多了怕试剂盒不够用，取得少了又怕提的蛋白不够，谢谢了150-200mg150-200mg的话，按照pierce的说明一个试剂盒做不到二十次，可是我有七十多个标本呢，怎么办啊？我门通常是大概在150mg左右来提取核蛋白的,适当少点没事,但是不能少太多啊!!!请问LWP1981

一般来说要加抗体的话需要多少ug呢? NF-kB的亚基那么多是不是都要进行实验? 还有想请教一下加抗体的具体实验步骤

是先将体系配好,加入抗体和核蛋白抚育30min后再加入探针 还是在核蛋白与探针抚育后加入抗体?

还想请问一下 我用的200倍冷探针竞争,能明显使条带减弱,但是不能完全竞争掉,是不是可以加大倍数? 多谢!！ ！

我们通常用2ug，P65,P50抗体都可以啊！ 探针完后在加抗体赋予，

竞争也可以加大倍数的！LWP1981 请教一下，activemotif的核蛋白提取试剂盒是不是很烂？？

我的游离探针非常漂亮，整个膜也是清晰（没法扫描抱歉），但是就是没有结合带，我测核蛋白浓度的时候发现不是280吸收，而是310-320nm的吸收峰，这是怎么解释？适用的是activemotif的核蛋白提取试剂盒！！！activemotif的核蛋白提取试剂盒 裂解细胞核的时候使用的是去污剂，不知道对于蛋白探针的结合有没有影响？？

LWP1981 使用的哪个试剂盒？activemotif用过么？是不是有些问题？？？？看大家都遇到这么多问题，真庆幸我做一次就做好了。去污剂如果要用，就用特别柔和的那种！ 我用的是VIAGENE的，

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当然去污剂用的多了也可以使蛋白变性的拉！！！有没有人知道哪家公司代理做EMSA啊我是想做miRNA和蛋白之间的结合关系的，谢谢。

或者指导下这方面的方法也行。有好几个都在做呢，哈哈，请问各位，为什么我的游离探针会有两条带，这个应该不是shift的条带吧？提核蛋白时，大家有没有觉得蛋白很难吹散啊，振荡也没有用。

还有我是自己设计引物，退火。 EMSA用的探针浓度很低50fmol，我合成引物浓度大概20uM/ul，是不是先退火，然后再稀释，这样要稀释10*9倍，这样对吗？有用过pierce的核蛋白提取试剂盒的吗？必须要用蛋白酶抑制剂吗？看到论坛里不少用pierce的盒子的，请教一个问题，转膜时应该能看到蓝色转到膜上的是吧，可是我转完后膜上什么也没有，我用的是390mA，4度转膜45min，我不明白问题出在哪里我也看不见条带，用半干转的时候就能看到，我也不知道原因在哪里，是不是湿转的转移液已经把颜色稀释了。我用的是pierce公司的emsa试剂盒，其他液体还很多，就是blocking buffer和4*wash buffer用完了，请问哪里可以单买这两个试剂，或是配方自己配。谢谢。若没有，大家有用过国产的EMSA试剂盒的嘛？效果如何，能否给我推荐一下。非常感谢大家！很正常，一般到了那一步都是比较难吹散的，

你制作探针 的时候，说明书上应该有退火条件的！！！按照他的操作就行◎！！基本都是大同小异！

探针浓度我至少用200fmol的不管那个公司的核蛋白提取试剂盒，蛋白酶抑制剂，必须有的！！！

其实，我觉得，viagene的更不错，五百多大洋做50多次，里面还都包括了蛋白酶抑制剂，我们实验室就一直用的，效果不错！反正自己合计啦！！！呵呵是啊，羞愤兰很快就转导膜上了， 转膜的时候注意电压和电流的变化！湿转应该没问题啊！ 我自己都用湿转，转了几百编了，呵呵，从来没有出过问题！！！我一直在用用的条件是0.5*TBE 390mA 30-40min.你可以试试！

半干转也可以，好像前段时间我一个朋友问过，在坛子里面也有讨论的，印象中记得好像是200mA，60min，效果还可以，你可以翻一番前面的网页看看，应该有的！最近比较忙，也没有上来及时回复大家，不好意思啊！

鉴于这么多站友对不同公司的盒子这么迷茫，发了不少短信给我，我也回复了不知道几遍了，我还是今天抽空发到坛子里面，希望大家都看到后有所借鉴和帮助，减少一些问题！ 其实对于试剂盒的问题，按照我做了这几年的EMSA试验， 能给大家提供的意见是： 目前市场上能做非放射性EMSA的试验比较多的也就是pierce 和Viagene， 其中viagene中国公司也在做EMSA的技术服务工作， 两个试剂盒各有优缺点，pierce优点：大众化，自己去合成探针，自由选择，自己配套！ 缺点：有时候点比较背的是一个盒子做完了合适的试验条件没有没出来，还没拿到自己要的结果，另外盒子里面缺的试剂还得自己购买！ viagene的盒子优点是：专业化，针对性比较强，分的比较细，专做NFKB,STAT3,AP-1,TWIST等转录因子，条件都已经固定的，直接做就行，成功率很高（至于都有那些，自己去查）而且生物素标记的探针，结合膜都已经包括了，不用费劲的去配套其他试剂！相对来说性价比比较高， 缺点是：你要是做的转录银子不在这个范围内，就不保证，这种情况下就不建议用了，

所以根据自己的试验情况有针对性的来确定，并不是说人云亦云，

我把这个大概的说一下，希望大家根据自己的情况来做，尽量避免在试验上出太多问题，要是有了问题在在坛子里面讨论！！！LWP1981 牛人啊，有空向你请教！请教楼主，您所说的要购买EMSA专用的抗体，想请问在哪可以买到，货号是多少？我刚刚看了SANTA的网站，它的抗体没有标明EMSA专用的，是不是用于WESTERN的就可以了？（我做的也是N

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F-KB）

不好意思，小弟刚刚接触EMSA，还有很多问题不明白，以后会多向LWP1981请教啊！请教楼主，我打算到公司定制Biotin-标记的DNA探针，定做的是单链还是双链？如果是单链，是不是要自己变性， 退火？我记得Pierce的试剂盒里面EBNA是双链的。 谢谢！回头帮你查一下我们用的抗体批号吧，一般做EMSA的抗体特异型很强，浓度也很高，做WB的一般很难作出来EMSA的抗体super的条带，做的是单连的，一般需要自己计算浓度然后退火合成双联， EBNA是双联的，不过那个只能是个简单的对照工作的，不能用来做你要的EMSA试验对照！你要合成什么探针？谢谢！我要做NFkB

这样理解对不对？我需要定制非标记的DNA探针和biotin 标记的DNA探针。两种探针都分别是两条互补的DNA单链,买回来之后，分别按1:1混合，退火合成双链。请问你的退火条件是什么，95度水浴加热，5min, 自然冷却？ order的时候，是不是分别order两条链？like 5' biotin-....XXXX...-biotin 3' 3' biotin-....XXXX...-biotin 5'

看了前面的帖子，你推荐两端标记，对吗?两端标记信号更强？我是到invitrogen定制。 EBNA是作为系统对照的，我自己的EMSA lane分别是#1 biotin-labled DNA, #2 Protein extract + biotin-labled DNA, #3 Unlabeled DNA+protein extract + biotin-labled DNA. #1 #3是对照， 如果成功的话，应该是在#2出现shift band. 对不对？

这些问题是不是太初级，呵呵，多谢!楼主大人，我也是最近刚刚接触EMSA，做的NF-κB，用的是上海杰美的试剂盒，但是可能因为放置时间过长（我们是以前的师兄一月份就买了，可是现在才开始做，但是保质期是一年），胶底液无论如何也不凝（直接怀疑失效了）现在怀疑试剂盒里的东西是不是还可以用，想请教下竞争和结合反应体系的构建可以有配方吗？那个标记探针和核蛋白及寡核苷酸已经有了，谢谢楼主大人，不胜感激~~~~~楼主大人，还想请教下我的样品核蛋白一组有五个，我设想是要每一个跑三个泳道（这样的话我认为能得到军数和标准差），两块BIO-RAD板子有二十个泳道，有老师告诉我说竞争反应用一个泳道就可以，是不是这样？还有，竞争反应中应该加入寡核发苷酸，但是说明书上只说加100ng,在结合反应中说明书上说不加寡核苷酸。关于标记探针我也有点疑问，结合反应中标记探针的量应该大于竞争反应中探针的量吗？谢谢楼主大人，感激涕零~~~~~请问大家转膜是用的0.5*TBE吗？可是我们实验室的老师做WB都是用的特定的转膜液（有Tris,甘氨酸，SDS，甲醇等），不知道该用哪个啊？先做了预实验，把配胶，跑胶和转膜练习了一遍。有点疑问，向楼主和大家伙请教！

预电泳 120v ,1h, 用的是pierce kit里面的5*loading buffer 稀释蛋白样品，没有加探针之类的，15ul，上样, 150V ， 1小时。跑出来的条带和western不一样。溴酚蓝染料跑成两部分，跑得快的浅蓝色，1h大概到胶底部，滞后的鲜艳蓝色，大致在胶二分之一处，跑了两回都这样（如图），正常还是不正常？还是pierce的loading buffer里面有两种染料？另外因为溴酚蓝会影响Protein-DNA 结合，还在犹豫要不要用试剂盒里的loading buffer.我做的是NF-kappa B. 大家有建议么？

转膜没有问题，0.5* TBE, 390mA,40min. 溴酚蓝转到膜上了，转膜过程中，buffer温度在15度左右，要不要再低些？ 谢谢了！发不了图片。

sudan919：跑胶和转膜都用0.5*TBE BUFFER，这和WESTERN 是不一样的。谢谢valleylily!

我上周用0.5*TBE半干转膜，200mA，1h，染料倒是全转到膜上了（胶上已经看不到溴芬兰）。但是最后出来的胶片上还是什么都没有，这是什么原因啊？（电泳和转膜都在冰上进

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行）

跑胶过程：预电泳120mA,1h,不上样；电泳150mA,2h40min,每孔按说明书加20微升。问题：为什么两个多小时溴芬兰才跑了一半？（感觉效率太低了~郁闷~~）请问大家这是什么原因啊？ 谢谢！还有一个小问题：请问紫外交联的原理是什么啊？结合反应的体系一般说明书里面肯定有的，各自的盒子有不同，你可以参看，这个是重要的部分！EMSA用0.5*TBE （PH8.0）WB用Tris－甘氨酸缓冲液，两者不同的！切莫混用！！！他们的盒子中的loading buffer 好像是这样的，不过我用的盒子中间没有那条带，应该算是正常的，

好多文献好像说loadingbuffer 中的溴酚蓝对结合反应有些影响，所以平时我用的盒子里面的laoding中溴酚蓝的浓度很小；

转膜RT下就可以，温度的影响不大，注意看横留下，电压的变化1为什么两个多小时溴芬兰才跑了一半,这个原因很多，buffer浓度，电泳仪，电压，电流，电泳槽等都有，尽量检查一下，一般转膜的话，溴酚蓝可以做为个指示的作用，可以参考！紫外教练的目的是使探针和膜形成共价键，更为稳定，不至于洗涤的时候被洗掉，但是控制紫外强度和照射时间，照射过度了造成损失，照射不到位，交联效果不好，条件合适才是度！谢谢楼主，我打算还是先用pierce盒子里面的buffer，毕竟他们做了无数遍，至少先把对照做出来。不行，打电话去问了。

另外，看到一loading buffer的配方：250mM Tris-HCl ( PH 7.5),0.2% 溴酚蓝，40% 甘油。自己配制也挺容易。我的结果出来了，是nf－kb的 但是结果不好分析，大家帮我看看，究竟有没有迁移条带？

第一条带是单加游离探针，第二条带至第六条是不同的处理组别。

我看到貌似有两条迁移带，不是很懂，难道第一条带是传说中的加样滞留？

请楼主和各位帮忙分析一下，谢了先。今天第一次做，结果很好！只做了一个样品，和EBNA对照，期待接下来的各组样品能有好的结果！ 谢谢楼主的指点和战友们的帮助！

这两个星期，我把坛子里的帖子细细看了无数遍，真的受益匪浅！ LWP1981提供的protocal 非常成熟，真经啊！ 谈点自己的心得。

我用的是pierce的kit，可能对使用pierce的战友有点用。做的是NF-kB.

有文献说溴酚蓝会影响DNA-Protein结合，做的时候，看着鲜艳的蓝色条带，我心里还真不踏实。跑胶的时候是出现两排条带，转到膜上也是两排，非常蓝，而且不漂亮，另外，胶一碰到滤纸和膜，蓝色就沾上去了，我当时直嘀咕，不会DNA就这么掉了吧，事实证明不用担心。

样品组，我的biotin-probe用了200fmol, non-labeled probe 20pmol，是过量的，最后未结合的探针（跑到溴酚蓝处的条带）非常亮。预电泳120v 1h,电泳160v 1h, 转膜390mA,40min. 其他严格按照pierce 的protocol做就行。 和老板讨论了一下，探针就还用这个量吧。 再次感谢大家！我再接再厉！sudan919 wrote:

我上周用0.5*TBE半干转膜，200mA，1h，染料倒是全转到膜上了（胶上已经看不到溴芬兰）。但是最后出来的胶片上还是什么都没有，这是什么原因啊？（电泳和转膜都在冰上进行）

跑胶过程：预电泳120mA,1h,不上样；电泳150mA,2h40min,每孔按说明书加20微升。问题：为什么两个多小时溴芬兰才跑了一半？（感觉效率太低了~郁闷~~）请问大家这是什么原因啊？

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谢谢！

预电泳120v,1h；电泳150V.你要说的是这样，对不？如果是120mA, 150mA,就不对了！电泳用恒压，转膜用恒流。我是湿转，不知道半干转膜的条件。

关于胶片上什么都没有，可能是标记探针的问题，可能是紫外交联不好，还有就是后面HRP的浓度，孵育时间。鉴定一下你的探针，如何？楼上的，能不能发图看看？ EBNA是什么？抱歉不懂，能说说么？ 哦，应该是楼上楼上的呵呵谢谢valleylily!

做了两次预实验，结果都一样，什么也没有！除了转膜，其他条件都跟你一样（我用的就是kit里的样本探针），电泳恒压转膜恒流，紫外用紫外交联仪和紫外灯下都照过，可就是不出来。

着急啊~老板还老催！~~~~55555555555

是不是半干转真的不行啊？拜托大家想想办法啊~~~~我的图片：

1 2 3是Pierce kit里面的EBNA对照，这是用来检测实验体系的，如果这个都做不出来，实验系统肯定有问题。lane 2 shift, 昨天的信号太强，今天减少上样量，就不这么黑了。 4 5 6 是我的一个样品。中间一个lane，出现shift band. 和qingshi一样，上样孔下面有条带，我觉得可能蛋白和探针的非特异性结合，因为lane 4没有蛋白，也就没有这样的条带，而在lane 6也没有被未标记探针竞争结合掉。同样，qingshi的第一道也没有这样的条带。我的是组织提取的核蛋白，是不是可以减少蛋白量？请大家帮忙看看，提点建议！再次感谢这个帖子，少走了很多弯路！我还有一个问题：怎么分析各组间shift的差异？ 条带的深浅？宽度？shift的位置？这些是不是考虑的因素。

另外，看以前的帖子，楼主提到了super shift, 是不是加了抗体？有机会请教一下相关的信息。sudan919 ：你用的kit 里面有像pierce这样的control system么？如果有，做一次不就知道方法有没有问题了？valleylily 谢谢分享讨论 你说的很对，

1 如何去掉加样孔中的残留？难道真的是蛋白上氧量太多了？ 2 如何进行不同样品间的定量比较，是不是控制蛋白的上样量？

望讨论哇噻，几天没来，这里好热闹！ 哈哈那个盒子里面的CONTROL只能用来验证试剂盒是否工作，不能用来做真正的对照，切忌！很明显的，加样孔大量残留啊！关于残留的问题和蛋白上样的量关系不是很大，我以前做过10ug上样，也没什么残留现象！倒是注意操作中的细节！

偶们实验室用的VIAGENE公司的EMSA盒子比较多，比较有经验，关于PIERCE的盒子里面的其他的配置，偶不是很清楚，也很少用pierce的，所以帮不上忙的地方大家就讨论拉或者找pierce的技术支持解决，呵呵，我用的pierce的核蛋白提取盒子，没用蛋白酶抑制剂，用来提取原代悬浮细胞，步骤如下：1.取20ul细胞(2*e6) 1000转离心3分钟，2.去上清（但是我没看到分层）就把1.5ml ep管底部的底部保留，后面的就严格按照pierce的步骤做，但是提出的蛋白很少，有时候甚至几乎测不到，请问我的问题出在哪里？我也是这个意思，control 出来了，至少证明实验步骤和试剂盒没有问题。那就是样品，探针等的问题吧！qingshi, 谢谢！这的确是个问题。我以前也觉得加样孔残留，但是自己做过，和看过结果后，我对加样孔残留的说法持保留意见。

条带显示的是biotin-DNA，对吧？如果残留，那么所有的泳道都应该有，但事实是，只有加了蛋白提取物的孔有，而且这个位置已经出了上样孔，我的片子上，还不止一条呢！理论上，如果所有的探针都没有结合的话，都应该跑到溴酚蓝的位置。上面的条带，我觉得可能是-蛋白和标记探针的非特异性结合-很强，连百倍浓度的非标记探针也不能竞争掉。是不是跟

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蛋白量以及poly( dI:dC) 浓度有关？

我的是组织蛋白，上样是15ug, 比较多，因为不是用pierce的试剂盒提的，而且放在-80半年多了，所以担心核蛋白的浓度，以及杂蛋白。

想试试降低蛋白量，提高poly( dI: dC)浓度，但pierce的poly( dI: dC)实在太少了。 请有楼主和战友们指正。谢谢！看来下次要试试viagene的盒子，多少钱?看到这个帖子之前，就订了pierce的，所以……我倒是希望自己能积累点pierce的经历，可以和大家分享！没有用蛋白酶抑制剂，这是主要问题吧！

还有离心后没有看到细胞，说明细胞太少了。一般100mm dish or 25T的培养瓶长满，悬浮细胞很多呢！至少能看到比火柴头大的团块。离心3分钟，有点短，5-10min,试试？没蛋白酶抑制剂你也敢用啊，呵呵，小心很快降解了啊，蛋白酶很厉害的，呵呵 做emsa细胞不能太少啊！ 否则得到的核蛋白会不够用的！祝大家，中秋快乐！！！ 哈哈！比较各个样品间的tf差异如何做的？是不是把总抽提蛋白的量都调整到一致然后看shift带的强弱？？ 楼主

valleylily 等。。

你们怎么做得呵呵，请教了。如图，这次很不好，还是两个问题：

1 比较各个样品间的tf差异如何做的？是不是把总抽提蛋白的量都调整到一致然后看shift带的强弱？？

2 加样孔中的残留如何去除？

尤其是第一个呵呵，各位多多发言了。1. 我也是这样做的。

2. 我也没有找到好办法。最近开了一次会，看到别人做的，也没有能消除，不过背景低多了，可能他做的是细胞。我现在头疼的是背景很高。跑胶的时候要不要时间长一点？上次试着降低标记探针的浓度，背景好看了，但结合条带没有出来。挺郁闷的！1 比较各个样品间的tf差异如何做的？是不是把总抽提蛋白的量都调整到一致然后看shift带的强弱？？ －－－－－－－－－－－

如果调整量到一致了，怎么定量比较shift带的强弱？非变性胶当天配制了没有用，能不能四度冷藏到第二天用？？？

有人做过这种事情么？能行么？qingshi, 我没有做过，不过变性胶经常4度过好几天再用！用封口袋装好，里面放点蒸馏水，防止胶干掉。按道理是可以的，还有预制胶卖呢，可是没有经验，不好说，到时候找不到原因。

qingshi, 你做的是组织核抽提物么？蛋白量用了多少？我出现binding 信号不强的问题，就加大了蛋白量，发现信号反而弱了。现在通常用15ug，探针用200fmol，总觉得蛋白量太多，但又不敢随便改。你分别用多少呢？我看你片子底端的游离探针比我的好看多了。 关于加样孔下面的条带，我看国外的网站上讨论过，大家众说纷纭，总之几个细节，1冲洗加样孔，2.loading buffer里的溴芬兰（我尝试过不用loading buffer 直接上样，binding信号强了，似乎没有解决加样孔残留问题）3，有人说新鲜制备双链探针，解决了问题了，他也不知道是不是这个原因，我倒想尝试一下。 关于定量，我看文献上就是这么做的。

做出shift band来似乎不是很难，但漂亮的结果很难，重复漂亮的结果更难！

谢谢你的分享!楼主最近也没有空来了！嗬嗬！我的问题真多啊！可以冷藏一宿，不过要全部放在电泳夜中保存，问题不大！呵呵，最近比较忙，呵呵，

结合反应的蛋白用量是有一定的限制的，并不是加的越多越好，太多了，结合效率会大大降低的！！！切忌！

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loadingbuffer 还是加上好，否则容易散样现象！

至于残留，我觉得影响因素还是：凝胶制备杂质多，样品中杂质多，可以离心解决，再就是冲洗加样孔不干净，可以试试！至于残留，我觉得影响因素还是：凝胶制备杂质多，样品中杂质多，可以离心解决，再就是冲洗加样孔不干净，可以试试！ 组织蛋白真不好弄。请教楼主：

1.冲洗加样孔这个技术活有什么诀窍么？你用多大体积的移液枪冲洗？ 2.反应体系上样前可以离心么？如果可以，你用多少转速？有一种很细的墙头可以伸到孔里面任何一个部位，我用的是这种枪头！

可以离心，不用高，三千来转就可以了！谢谢回答啊 我用的是15ug蛋白 50fmol的探针

我正在做其他的探针呢，有结果后在讨论呵呵

重复性确实是个天大的问题，我都要疯了。呵呵，这段时间这么安静！ 呵呵

慢慢做，分子实验耐心些！请问楼主及各位前辈，如果我已证实两个基因的表达成正相关，比如说，A表达增加，B也增加，A表达减少，B也减少。已知A是转录因子，那么，如果我想用EMSA进一步检测两者之间的关系，实验该如何进行？不知我对EMSA的理解有没偏差？该方法能否用于这样的实验呢？还请LWP1981 及各位师兄师姐不吝赐教！感激不尽了！两种蛋白的相互关系经典的检测方法是酵母双杂交

EMSA是检测蛋白和核酸的结合活性 A是转录因子，你用EMSA检测的是在不同处理条件或时间点A与DNA结合的活性关系。最近也在做EMSA 用的是碧云天的GS009 试剂盒 还刚开始 看了大家的交流 感到实验会很艰难 相信和大家相互交流 会有新的突破感谢jackney2008的回复，我的理解是A(转录因子----蛋白）和B基因的启动子或增强子中特异序列相结合后，促进或抑制B基因的转录，翻译。以这样的一种方式来证明B基因是A基因的靶基因。不知这种理解对不对？

但是，不知是不是我理解错了，EMSA反应体系中是A的蛋白（比如HIF-1)和一段同位素标记的双链寡核苷酸链反应，好像与B基因没任何关系，那这样即使结果阳性又能说明什么呢？我想可能还是我理解不到位吧，但我们实验室之前又没人做，希望各位能点拨一下，晚生感激不尽了！！！！！请教先辈们一个问题 核抽提物怎样保存？-20可以么

能保存多久？非常好，谢谢你的劳动液氮或者－80，－20暂时一周内可以保存我最近想做FOXO转录因子的EMSA，为了省钱我想先做预实验，我用未标记的探针与核蛋白抽提物结合，结合缓冲液中无poly dI:dC。我跑了6%非变性胶以后把胶用0.5mg/ml的EB染色，发现有未结合探针的条带，但是没有阳性条带，无论是非突变探针还是突变探针都只有探针条带。请问用EB染色这样灵敏度是否足够检测到结合的探针？LWP1981 和valleylily大侠， 最近做了好多次大鼠肾组织NF-KB的EMSA，上传一张，恳请帮忙。我用的探针是上海生工合成的，肾组织取50mg，加样量10ug。自加样孔到可疑NF-KB的一条条带用200倍未标记探针竞争不掉，做了3次几乎都一样，快崩溃了! 请大侠们帮忙分析下！图中： 1道：pierce公司提供的EBNA组 2道：大鼠肾核蛋白＋标记探针组

3道：大鼠肾核蛋白＋标记探针＋200倍未标记探针。问一下各位,EMSA可以不用KIT吗? pierce的KIT好贵.orz还是用好的kit ，省心啊！怎么很冷清啊？你可以加一个阳性对照在旁边，这样更容易判断，清楚一些！一般竞争50倍就可以了，100倍算是高的了！麻烦问一下LWP1981站友,核蛋白样品的制备完之后,有没有什么标准来判断一下我的核蛋白抽得质量怎么样?

BIOTIN标记是标记单链还是双链?

我刚开始做..可能问的问题有点白. 请多指教!一般有专门提取核蛋白的盒子，按照操作就可

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以，完事可以测定蛋白浓度看看，探针是双联的！哈哈，想不到半年不关心，兄台还专门开了专栏，还得到那末多ddmm的追捧，可贺啊LWP1981，谢谢您的建议！如果特异性竞争反应中未标记探针浓度太高会有影响吗？我做的是组织，阳性对照用细胞的可以吗？

我经常碰到高速离心（1,6000g）后的核沉淀很难被打散，有什么好办法？楼主大人我也碰到相同的问题，抽提肌肉组织核蛋白时核沉淀很难打散，涡旋根本没用，怎么办？而脂肪组织的核沉淀很好打散，搂主大人有什么建议吗？ 另外，EMSA紫外交联之前要不要把膜弄干？看Millipore的说明书上写紫外交联以前要把膜弄干否则水分子影响铰联效率，但是EMSA试剂盒说明书上又说膜不能干掉，到底要不要弄干？谢谢！我用的PIERCE的，里面强调在膜未交联前千万不能弄干的，原因不详！ 这个核沉淀困扰我很久了，问了技术员也说只能尽量打散，晕！我明天再做一次看看！ 你说脂肪组织的核沉淀好打散，也是指16000g离心后的核沉淀吗？是啊，脂肪组织16000G离心后沉淀很好打散。

昨天做了EMSA发现膜很湿地交联后做出来一片白板，怀疑是没交联上导致洗膜什么的过程中都被洗掉了。有没有可能是转膜的问题啊？我也考虑过是不是转膜的问题，于是把转膜后的胶用EB染色发现没有条带，尼龙膜我也用EB染了，不过不知道尼龙膜能不能用EB染色，反正尼龙膜上用EB染色也没看到条带。转膜时我用400mA转了30min。除了转膜和紫外交联以外应该没有其他问题因为探针的点杂交试验是有结果的。呵呵，空着也没事，有这方面资源，大家交流交流啦！呵呵，一般要是做NFKB的EMSA阳性对照，用细胞比较好！呵呵，至于竞争我们做的最大在100倍吧

至于沉淀，实在散不了也没办法，间隔的多吹打几次，影响应该没那么大的！至于打散的问题，我说过了，尽量散一些，如果散不了也没招，影响应该不是很大，毕竟他的原理是通过渗透作用，而不是通过机械原理作用的！还有就是紫外交联的，我就单独说了： 紫外交联部分吸干膜表面水渍，在交联，

封闭以后就不能在让膜干了！！！否则。。。。尼龙膜和凝胶的放置顺序是对的吧？ 电转缓冲液是新配的吗？

一般转膜结束后凝胶是透明无色的，而尼龙膜上会有蓝色的染料。谢谢LWP1981 啊，我今晚再试试！哎。又是白板一片。这次膜弄干了紫外交联的。转膜方向肯定没错，膜上有染料。难道是探针降解了？好奇怪点杂交做出来好好的。不过做EMSA时候探针量只有40fmol，而点杂交时用了800pmol，是不是ECL敏感度不够啊？咨询一下大家。我实验室的电流最大能调到200mA 请问大概要转多久才合适呢？楼主好，我买的KIT 里也说千万不能干，你能说说你要弄干的理由吗 谢谢！还有一个问题，我电转的时候调到200MA后，电泳仪自动跳到恒压了，只有把电流调到170左右才能恒流工作。请问这是怎么回事？恒流和恒压多实验结果有什么影响？谢谢!

我知道探针是双链的.. 我的意思是标记是标记单链就可以了,还是两条链都要标记? 谢谢! 我想自己先做一下,毕竟盒子还是满贵的... 看起来抽核蛋白的buffer也不复杂.呵呵，我说的是，从转运到交联再到封闭前这段时间膜表面干了没事，从封闭以后到成像膜是不能干掉的，

剩下的恒压恒流变化就是你得电泳仪的问题了，呵呵都要标，其实制备探针还是挺烦的，呵呵请问一下结果如何分析，用什么软件，以灰度值还是光密度值表示lichander wrote: 我也考虑过是不是转膜的问题，于是把转膜后的胶用EB染色发现没有条带，尼龙膜我也用EB染了，不过不知道尼龙膜能不能用EB染色，反正尼龙膜上用EB染色也没看到条带。转膜时我用400mA转了30min。除了转膜和紫外交联以外应该没有其他问题因为探针的点杂交试验是有结果的。

我也有类似的问题，点杂交正常，那说明问题出在转膜和紫外交联。我是转膜380mA，40

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min，膜上有溴芬兰，紫外交联120mJ/cm2，1min。紫外交联的时候是不是只要表面没有多余的液体就可以了还是要再干一点？不知还有什么细节需要注意，请大家帮帮忙!我是用湿转的方式， 条件和你一样， 交联的时候可以用无菌操作台上的紫外灯下10cm照射10min 代替紫外交联仪来做，我做的效果挺好的！测定的应该是灰度值！hoho,我把转膜电流改成190mA转1h，转膜后晾干，紫外交联用手提紫外灯下1cm 5min终于做出来了。我想可能是由于我的探针才20bp，另外尼龙膜孔径0.45um，用400mA转膜早就穿出去了。呵呵,EMSA实验条件一般有很多说法的!!! 涉及的东西太多了,呵呵谢谢楼主各位帮我看一下我的EMSA实验结果：

实验目的：筛选与探针特异结合的蛋白，即蛋白未知

探针为RNA,5‘端绿色荧光标记，蛋白为细胞粗提蛋白，电泳后直接对凝胶进行荧光扫描，三次重复实验带型均相同，结果如图：

图1.左起荧光条带lane1至lane5均为：蛋白+标记探针，只是用量不同，lane6只加标记探针 请问：除了加冷竞争探针还有什么方法可以排除非特异性结合？如果做了冷竞争仍然有几条带可以说明这几条带都是特异结合吗？

（缩略图，点击图片链接看原图）再请教各位： 突变探针是怎么设计的？与标记探针有什么区别？

还有EMSA的阴性对照和阳性对照是怎么做的？我东西都是自己配的，没用试剂盒，而且蛋白未知或者说是不太确定，怎么做这些对照？多谢各位大侠！哦，你是用的荧光标记的探针啊，大部分都是用生物素标记做化学发光的，不过原理大志相同，做个竞争对照即可说明问题！或者做个对照，排除非特异结合！这几天做了EMSA,曝光见图片，好像在c区是NF-KB条带，因为被未标记探针竞争掉了，但看别人文章的图片好像b区的位置更像NF-KB，但在我的EMSA中却无法竞争掉，很困惑，想让大家帮帮忙！

我用的是大鼠肾脏抽提核蛋白的，浓度为2.51ug/ul，加了3ul，我用都是pierce的。 （缩略图，点击图片链接看原图）不知道NF-KB的阳性对照要用什么来做啊？谢谢！肿瘤细胞,TNFa 刺激即可, 很多文献有报道1我打算用胰腺癌BxPC-3细胞做一下阳性对照（没有TNF刺激），不知是否可行？这两周做EMSA遇到些疑惑，想请教楼主：

1、我的EMSA胶在转膜后用EB染色，发现加样孔中有很亮的条带，但是孔下没有EB染色条带，说明有很多东西没跑进胶里，或只是跑进去一点点，这些到底是什么东西？是蛋白和poly dI:dC的复合物吗？还是我做的胶有问题？不过我的电泳电压确实比较小，100V，预电泳半小时后电流才4mA，打算下次用200V跑跑看。

2、我的shift条带很靠近胶的上缘，为了让孔中的东西多跑出来点，我电泳至二甲苯青（就是琼脂糖电泳用的loading buffer中的除了溴酚兰以外的那条带）跑到胶底端，游离探针都不见了，发现shift带下来一点了，但是仍然靠近胶孔，而且转膜后的胶用EB染色仍然在胶孔处发现很亮的条带。难道是说有些蛋白就根本跑不出来？我怀疑因为这些蛋白没有结合SDS，如果等电点与结合反应液的pH相等，那么这些蛋白带中性电荷的话在电压下根本不会泳动。

3、发现一个很困惑的现象，即我光加蛋白的孔(也加了binding buffer和poly dI:dC)也曝出shift条带来了！幸好这个shift条带和我目的shift条带位置不一样。我很纳闷，没有生物素标记探针的孔怎么也能HRP发光呢？难道是蛋白内源生物素？能不能做阳性可以查查文献,常见的细胞应该有报到,

EB的结果我没看过, 不过孔中积累的,应该是杂质或者太大的分子,一般转录因子都是很小的,很容易进胶,有时候我们加样前都离心一下, 你做组织的蛋白话,很容易发现内源性的,这个没什么大惊小怪, 也就是传说中的NS带, 不过电泳中不能有SDS噢!哦，我那个转录因子

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蛮大的，有80多KD，所以shift条带很靠近上缘呵呵，非得探针跑出去才能把shift条带分开。能不能发张图看看啊？下次拷过来看看，因为我们实验室用的是CCD，管理员不让随便插U盘拷数据，怕中病毒，要拷也得联系值班老师太麻烦了，所以一直留在电脑里嘿嘿噢, 冷CCD那种啊,呵呵,不错,那套仪器挺贵的, 我们实验室也是用冷CCD,呵呵,

不过冷CCD仪器对底物的灵敏度要求比较高!我用pierce的盒子做emsa，标准品做出图之后，再用抽提的核蛋白做（1.2ug\%ul），蛋白上样3ul，100v电泳1小时，380ma转膜50分钟，超净台紫外灯10cm照射15分钟，结果曝光出的片子上只有几个芝麻粒的黑点，请问各位大侠我的问题出在哪里？谢谢我用的尼龙膜是砝码西亚（amersham）的0.45u,请问有用过的吗？大家都用的哪种膜啊？谢谢拍绿色荧光标记用什么？CCD吗？拍绿色荧光可以用CCD啊, 不过激发光源不同而已!一个是化学发光,一个是激发荧光,虽然光的来源不同,但是CCD都可以捕捉到图像!哦，那么用绿色荧光标记探针就可以直接用胶拍照了？那岂不是很简单可以这么讲,不过我自己觉得转运到膜上更好些,以前做过GFP的荧光蛋白,用我们的成像系统成像效果还不错,不过在胶上不好操作, 后来转到膜上感觉还不错,还好保存,呵呵!

主要是激发光源合适,要是激发光源不合适,那就完蛋了!

呵呵请问各位有谁知道PIECE盒子里的blocking buffer的配方是什么啊？我的用完了，急用啊！blocking buffer 等后面的一套东西, 还是买kit比较好, 大家都能配, 那就不叫kit 了, 呵呵谢谢楼主的帖子和回复，让我受益不少。

但是我一丝不苟的按照楼主的方法进行了实验仍然没有得到binding条带，只能看见很深探针的条带，以下是我的实验条件和问题。

1 我用的试剂盒是PIERCE的，检测的是NF-KB和AP-1的结合带都没有出来。

2 上样的核蛋白是从HUVEC细胞中提取的，用的碧云天的核蛋白提取试剂盒，上样量从2－10ug都检验过。

3 胶配的是6％的，APS加的量多了些，20ml的体系加了300ul，会有影响么？

4 电泳的设备是Biorad，8×8×0.75cm，0.25×TBE的缓冲液，电压150v，电流才6到7m A，电流小会不会影响复合物的迁移，是不是和胶比较薄有关系？ 5 转膜的条件是390mA，1h。

6 紫外交联仪120mJ/cm，1分钟。奇怪的是交联完了以后能看见离加样空很近的地方有白色的条带，封闭完了以后就看不出来了。 7 探针是2年前合成的，如何检验探针的质量？没有降解或者断裂？我用标记biotin和未标记的竞争探针跑了琼脂糖电泳，发现标记的确实比没标记的跑的慢一点，但是没标记的探针出现了两条带，标记的只有清晰的一条。这个实验能否说明探针没问题？ 8 我显的片子上在离探针很近的地方有一条带，但是估计是非特异的条带。

我的问题有可能在哪里了，做了半个月了都没有得到结果，非常的着急啊！万望高手予以指导，大家也可以来讨论以下我的失败原因。多谢！@_@胶上不好操作什么意思？难道不是把胶剥下来直接拍照就行了？那个。。其实根据原理就可以知道配方是什么。你后续的试验使用SA-HRP与膜杂交那肯定跟核酸杂交不同，不需要加鱼精DNA封闭，只要用1%BSA，0.02%Ficoll和0.02PVP就行了，也就是分子克隆上写的Denhardt's液，但是三样东西单买都蛮贵的-。- 我用牛奶封闭效果不太好，毕竟内源生物素太多了，看上去膜很脏。EMSA非放射性法贵的就两样东西，poly dI:dC和封闭液，其他的便宜地一塌糊涂。做纯化的蛋白，如果不要求背景特别干净，就用1%BSA+0.3% Tween-20封闭就行了，而且不用poly dI:dC，那比做Western还便宜。帮忙分析下我的结果

谢谢啊 啊啊请问下BLOCK BUFFER 能重复利用吗？好几天没来了，呵呵 你得问题好多啊！！！

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在坛子里面看看，基本都有答案，回头我PM你，给你回答，呵呵！呵呵，这话我不敢说！当然可以，不过page那个胶貌似很容易就碎掉了，呵呵，而且交面光滑容易反光，

转在膜上容易保存和成像，呵呵LWP1981,你好，我想问问你们有没有自己配过Loading buffer做过EMSA，我自己配了觉得拖尾很严重，我用过两个配方一个是10ml 100%甘油+2ml 0.5M EDTA(PH8.0)+微量的溴芬兰，还有一个是250mM Tris-HCl(pH7.5) 0.2%溴芬兰，40%甘油，还有用过跑DNA的6*Loading buffer也试过，都觉得拖尾比较严重，不知道你们平常做这个实验的时候，有没有碰到拖尾的情况，你们是怎么优化条件的？谢谢一班你买的kit中都有 loading buffer 啊， 为什么要自己陪啊， 另外做WB， DNA电永等的loading 不能用来做EMSA， 不同的东西！感谢分享经验。 我遇到的问题是：

1.shift 条带很好，却做不出好的supershift 条带。抗体是文献中常用的抗体。哪位高人有抗体孵育的优化经验？是先与probe孵育好，还是先与核提取物孵育，宜或三者共同孵育？有时间要求么？

2.mutant probe设计有原则么？我当时不懂原则，按照文献葫芦画瓢，识别位点（8nt）CC变为TT，结合的也很好，信号仅轻度减弱。 谢谢！感谢分享经验。 我遇到的问题是：

1.shift 条带很好，却做不出好的supershift 条带。抗体是文献中常用的抗体。哪位高人有抗体孵育的优化经验？是先与probe孵育好，还是先与核提取物孵育，宜或三者共同孵育？有时间要求么？

2.mutant probe设计有原则么？我当时不懂原则，按照文献葫芦画瓢，识别位点（8nt）CC变为TT，结合的也很好，信号仅轻度减弱。

谢谢！你好，请问一下做EMSA，加入抗体后，shift条带消失了，但supershif 条带并未出线，胶孔里面有条带.shift条带就很大了，是不是supershif 太大跑不下来啊。如果延长跑胶时间，free probe 跑没了是不是没有关系啊，谢谢。LWP1981 有机会帮我看看做的EMSA结果

骨骼肌的NFkB新手做我觉得还是用试剂盒比较好

Pierce的不错呵呵，盒子，做出来就好，做不出来就没得好！ 呵呵，做了两次预实验，显影都是白板一片，很郁闷：（

生物素标记的探针是上海博尚合成的，双链都标记了，但是都是只标记5·端，自己退火合成的双链，跑过琼脂糖胶条带很清晰。KIT是碧云天的，探针浓度是200fmol,蛋白20ug，探针用的是sp1的通用序列。4%和6.5%的胶都做过，电泳是100V1h（BIORAD的装置）,冰上转膜380mA40分钟，转膜后溴芬兰非常清晰的转上了。紫外交联是用超净工作台10cm10min，因为时间长，不能保证膜不干，我中间还滴了几滴0.5xTBE上去。后面的步骤严格按KIT了，显影的时候整个盒子里面都有荧光，但是膜拿出来就没见荧光了，显影连游离探针都没有。

我想转膜应该没什么问题吧，溴芬兰很好的，紫外交联是按楼主说的做的，是不是不能中途滴水上去？怎么检验探针的生物素标得怎样？请知道的站友指导下罗！是不是我只标记了一端需要加大探针浓度啊？***！国外现在验证某种核酸和某一蛋白相结合的常用方法是原位杂交和免疫染色。原位杂交显示核酸的定位，免疫染色显示蛋白的定位。如果两者的定位一致，那基本能肯定两者相互作用。

有没有这样的文献报道，能否提供参考一下。这个精度要求很高啊。要对一个转录因子在核内进行精确定位。请LWP1981帮忙看看

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谢谢谢谢fangweibin119！好像电泳时间比较短？？？探针比较重要，要是合成的质量不好，怎么也做不出来！

交联的时候膜干了没事，封闭后不能干！！电泳一个半小时左右做了6、7次才发现有这么精华的文章，真是相见恨晚，

已经订了PIERCE的kits，不甘心换另外一家再试了， 目前主要有两个问题，

1、一个是要做supershift，我做的也是NF-kappaB，不知道到底用哪个抗体好？ 我试过santa 的其中一个anit-P50，好像看到条带消失了，但是没有看到supershift的条带，这样也对吗？p65呢？哪个抗体比较适合EMSA？

2、我用了两个探针，一个是NF-kappaB consensus，一个是参考别人文献的序列，然后自己用biotin标记，神奇的是，NF-kappaB consensus的那个，竟然没有游离条带，但距离加样孔0.5cm和2cm处可以看到有两个条带，因为我是同时跑两块胶全部条件都一样，只是探针不同，可以确定另外一个可以看到游离条带，没有跑过头，所以百思不得其解，consensus 探针的游离条带去哪里了？顺便问一下，大家是不是都在这两个位置左右得到条带？ 非常感谢。1.抗体不好作，原因就是很多抗体不工作，所以选好抗体是做出supershift的首要要做的，我们原来也是用三他的。很久了

2。呵呵，探真一般都很重要，也是比较容易出问题的地方，尤其是自己标记的，农不好就麻烦！至于位置，取决于电泳时间等试验条件1LWP1981你好，准备做EMSA实验，问了试剂公司，Invitrogen有个荧光素标记的盒子，与罗氏以及Pierce的盒子相比，价钱要便宜70%左右，由于经费问题非常想省钱，请问你听说过这种盒子吗？谢谢看你做什么转录因子了，我还是倾向于化学发光的！想请教同仁们几个问题 我点样检测标记探针有很好的荧光

在跑了两次胶转膜后都没看到 请问带正电荷的尼龙膜分正反面吗？

还有我在想居然是双链可以在胶里加核酸染料吗？这样跑胶后就可以直接去拍照了，都可以不标记探针 ，因为我们关心的是两部分核酸的位置和浓度。是不是探针结合蛋白后会影响和染料的结合呢？没有正反面，要是加ＥＢ可以使用的话那ＥＭＳＡ就没什么难度而言了，旧不存在什么生物素标记探镇，成象系统只类的问题了，呵呵，你可以试试侃侃什么结果啊，呵呵！尊敬的LWP1981：

您好！在**和一些网站上看到了您的贴子，很感谢！最近我开始在做NF-kB和AP-1的EMSA，NF-kB还行，虽然竞争抑制的孔要加到500fmol才基本能抑制，有非特，但好歹做出来了。AP-1就让我绝望了（找人要的探针是1年半前生工合的，最近退的火；后来又觉得信号不强重新找英骏合成）买的3800元pierce的盒子已经用了一大半了，急的要死！！！有没有时间帮忙分析下结果，我的QQ是272396387 谢谢了！呵呵，此贴非常精华啊。看了一下午受益匪浅啊。楼主LWP1981以及各位前辈都是高人啊，等我正是做实验了向你们请教。还好发现的找，试剂盒还没定呢。楼主很推荐viagene的KIT，我还打算买PIERCE的呢 ，现在要重新考虑了。着几天忙点，没在线，回头我加你Ｑ ， ＫＩＴ 各有优缺点，作到最好优化就好＼ ｀恩哈 谢谢 前面十多页的帖子我都看了，大概知道两种试剂盒的优缺点了，所以我再查些相关资料再说。谢谢楼主咯做了6、7次才发现有这么精华的文章，真是相见恨晚， 已经订了PIERCE的kits，不甘心换另外一家再试了， 目前主要有两个问题，

1、一个是要做supershift，我做的也是NF-kappaB，不知道到底用哪个抗体好？ 我试过santa 的其中一个anit-P50，好像看到条带消失了，但是没有看到supershift的条带，这样也对吗？p65呢？哪个抗体比较适合EMSA？

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2、我用了两个探针，一个是NF-kappaB consensus，一个是参考别人文献的序列，然后自己用biotin标记，神奇的是，NF-kappaB consensus的那个，竟然没有游离条带，但距离加样孔0.5cm和2cm处可以看到有两个条带，因为我是同时跑两块胶全部条件都一样，只是探针不同，可以确定另外一个可以看到游离条带，没有跑过头，所以百思不得其解，consensus 探针的游离条带去哪里了？顺便问一下，大家是不是都在这两个位置左右得到条带？ 非常感谢。

虽然我是做放射性P32标记的EMSA ，但是对于SUPER SHIFT ASSAY 我感觉还是大同小异的。因为我是用的santa cruz的专用supper shift assay抗体.针对P50 P65 REL-B这些亚基都有专用的做超迟滞分析的抗体。在抗体的编号后面都加了个小X。也不是太贵。 我抗体都是在加探针之前加的。孵育的时间大约10分钟左右。关键是操作的细节问题。加了抗体后有没有离心震荡混匀呢？这是个很好的TIPS

你们跑的时候不加微量的溴芬兰标记么？这样就不怕FREE probe跑走了。

在国际上的文章你仔细看下，因为这是比较成熟的技术了，所以很多人都不在片子上加free probe了 ，而是把这块裁掉99649827 wrote:

LWP1981,你好，我想问问你们有没有自己配过Loading buf ...

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