大曲培养过程中微生物数量的变化

大曲培养过程中微生物数量的变化

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聂凌鸿，樊璐，季方

（1．淮阴工学院生命科学与化学工程学院，江苏淮安223003；2．江苏今世缘酒业股份有限公司，江苏涟水223411）

摘要［目的］了解大曲中微生物的数量以及在发酵过程中的变化规律。［方法］通过跟踪单粮型大曲制作流程，测定大曲各指标研究

5～20d后，了制曲过程中微生物的相互消长关系。［结果］发酵开始约5d后，细菌的数量为最多，是大曲发酵阶段中的高峰值，细菌的

20～31d内细菌数量又有所上升，在20d左右出现低谷，但是未达到前期出现的高峰值。原料中的酵母数量比细菌数量数量急速下降，

9d左右出现高峰，9～25d内酵母菌数量迅速降低，25相对较少，但发酵开始后，酵母菌数量有所增加，在培养后的25d左右出现低谷，

～31d内，15～25d内，25～31酵母菌的数量有所增加。霉菌数在前9d左右呈上升趋势，在9～13d内达到高峰，霉菌的数量持续下降，d内，霉菌的数量有所回升。［结论］该试验为研究微生物区系对酒品质的影响和提高酒的品质奠定了基础。关键词大曲；微生物；消长规律中图分类号S37文献标识码A文章编号0517－6611（2011）35－21757－03QuantityChangesofMicrobesduringCultureProcessofDaquNIELing-hongetal（CollegeofLifeScienceandChemicalEngineering，HuaiyinInstituteofTechnology，Huaian，Jiangsu223003）

Abstract［Objective］TheaimwastolearnaboutthemicrobialquantityinDaquanditschangingregularityduringfermentation．［Method］Throughtracingtheproductionflowsheetofsingle-foodDaquanddeterminingitsvariousindexes，themicrobialgrowthanddeclinerelationship

Result］Thebacterialquantityreacheditspeakofthewholefermentationprocessafterabout5danditwasduringDaquproductionwasstudied．［

morethanothermicrobicalquantities．Itwasdescendingfastafter5－20danditslowestvalueappearedaroudthe20thday．Itgotsomeincreaseagainfromthe20thdaytothe31stday，butnotreachedtheformerpeak．Theyeastquantitywaslessthanbacterialquantityrelatively．Sincestart-theyeastquantitygotsomeincreaseandappeareditspeakaroudthe9thday．Itwasdescendingfastfromthe9thdaytothe25stingfermentation，

dayanditslowestvalueappearedaroudthe25thday．Itgotsomeincreaseagainfromthe25thdaytothe31stday．Themycetesquantityshowedascendingtrendin9dandreacheditspeakintheperiodfromthe9thdaytothe13stday．Itwasdescendingcontinuouslyfromthe15thdaytothe

Conclusion］Thisexperimentlayedafoundationforresearchingtheinfluence25thdayandgotsomeincreasefromthe25thdaytothe31stday．［

ofmicrofloraonwinequalityandenhancingwinequanlity．KeywordsDaqu；Microbes；Growthanddeclinerule

大曲微生物是通过自然接种、富集而构成的复杂的微生物菌系。微生物来源主要依靠原料本身、空气、场地及覆盖也有的在拌料时接种了少量优质曲母，强化了有益菌稻草，

株。大曲中微生物种类非常复杂，生栖方式各不相同，根据大体可分为细菌、酵母菌、霉菌三大类。大形态和生理性状，

曲中的细菌主要有醋酸菌、乳酸菌、芽孢杆菌等，细菌菌落一分布广，繁殖快，大曲酒中很多的香味成分来源于细般较小，

其菌的代谢。大曲中酵母菌主要有酒精酵母和产酯酵母等，中酒精酵母是大曲中的主要产酒功能菌，产酯酵母可产酸或产酯。大曲中霉菌可分为曲霉、根霉、毛霉、犁头霉、青霉等，其菌落较大，开始时往往为白色或灰白色，后来长成孢子时形成各种颜色

［1－2］

培养基。主要仪器与设备：电子天平（CP512，奥豪斯仪器有9075A，限公司），电热恒温鼓风干燥箱（DHG-上海一恒科学LAB，仪器有限公司），超净工作台（DS-南通东查实验室装备LS-50S11，有限公司），立式压力蒸汽灭菌锅（YXQ-上海博讯9160，实业有限公司医疗设备厂），隔水式恒温培养箱（GHP-上海一恒科技有限公司），成像显微镜（BX41，奥林巴斯株式会社）。1．21．2．11．2．21．2．2．11．2．2．21．2．2．3

方法

操作流程。培养基配制→灭菌→取样→样品悬

浮液配制→分离→计数。

操作要点。

培养基的配制。根据培养基配制的要求进行。灭菌。在试验过程中所有的器皿和相关设备要进取样。根据大曲制作的发酵周期，跟踪取样8次，

。

大曲是白酒生产过程中的糖化剂、发酵剂，是白酒发酵大曲的质量直接关系到酒的生产中微生物及酶的主要来源，

出酒率及基酒的质量。从宏观上看，大曲品质主要受环境条件影响；从微观角度看，本质是受大曲中微生物种群产生的了解大曲中微生物复合酶体系组分配比差异的影响。因此，

的数量以及在发酵过程中的变化规律，对提高酒的品质有重要意义，可为进一步研究微生物区系对酒品质的影响打下基础11．1

［3－6］

行高温杀菌，同时试验要在无菌状态下进行。

每次取大曲表层和曲心的混合样，每次取2个样品（不同库房内取1次），成型入库前取未湿润的原料1次和湿润的原料1次。1．2．2．4

悬浮液配制。无菌条件下，取10g样品，加入90

ml无菌水，充分摇匀，自然沉淀后取上清液1ml加入装有9

－1－2

ml无菌水的试管中，得到10稀释样。然后依次制成10

。

原料：某酒厂的单粮型大曲。微生物培养及分

材料与方法材料

～10－7的稀释样。1．2．2．5

分离。细菌的分离：采用牛肉膏蛋白胨培养基对

细菌进行培养，选择合适的梯度菌悬液稀释液，分别吸取1

离的培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基、孟加拉红

聂凌鸿（1969－），男，江西武宁人，副教授，博士，从事农产

E-mail：haitaonie@163．com。品加工研究，

09-02收稿日期2011-作者简介

ml置于培养基中，置于35℃培养箱中培养1～2d的时间；根据菌落形态的差异，挑取单菌落，用平板划线法纯化，通过成像显微镜观察为细菌，挑取单菌落，平板划线法纯化，将纯

菌株移入斜面，备用。

酵母菌的分离：采用麦芽汁培养基对酵母菌进行培养，选择合适梯度的菌悬液稀释样，分别吸取1ml置培养基中，置30℃培养48h，根据菌落特征及成像显微系统初步确认挑取单菌落，平板划线法纯化，纯菌株移入斜为酵母菌后，备用。面，

霉菌的分离：采用孟加拉红培养基对霉菌进行培养，选分别吸取1ml置于培养基中，择合适梯度的菌悬液稀释样，

置于30℃培养48h，根据菌落特征及成像显微系统初步确挑取单菌落，平板划线法纯化，纯菌株移入斜认为霉菌后，备用。面，1．2．2．6

计数。采用平板菌落计数法。将待测样品经适当

使其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量稀释之后，

培养一定时间后，由每个单细胞的稀释样液接种到平板上，

生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样取出培养平板，算出品中的一个单细胞。培养一段时间后，同一稀释度上菌落平均数。1．2．3

水分的测定。采用烘箱干燥法，准确称取试样10g，

放入事先烘干、恒重的60～80mm培养皿中，在130℃烘箱中烘烤45min后在干燥器中冷却30min称重。计算公式如下：

水分（%）=（M1－M2）×100/（M1－M0）

M0，式中，空培养皿重（g）；M1，烘干前培养皿重（g）；M2，烘干恒重后试样加培养皿重（g）。1．2．4

酸度测定。称取10g大曲于250ml烧杯中，准确加

于室温浸泡30min，每隔10min搅拌1次，用脱脂水100ml，

2滴0．1%酚酞指示剂，吸取滤液10ml，加水10ml、棉过滤，

10s不变色为止。用0．1mol/LNaOH溶液滴定至微红色，

酸度定义：10g大曲消耗氢氧化钠溶液的毫克当量数，即消耗1mg当量数氢氧化钠溶液为1度。

酸度=C×V×（100/10）

C，NaOH溶液的摩尔浓度（mol/L）；V，式中，消耗氢氧化钠溶10ml大曲浸出液换算成100ml大曲液的体积（ml）；100/10，浸出液的倍数。2

结果与分析

2．1制曲过程中大曲温度动态变化过程制曲分为低温培养期（前缓）、高温转化期（中挺）、后火排潮生香期（后缓落）、打制曲过程中曲温和气温的动态变化见图1。拢4个时期，

低温培养期是让微生物大量生长繁殖，曲温要控制在30～40℃，在0～4d内曲温持续上升，为了达到所要求的温采取相关的措施（翻曲）来抑制曲温持续上升。由于气温度，

4～8d内曲温变化不明显，相对较低，则进入下一时期的时间相对延长，但是在这段时间内有利于微生物的生长。由于8～13d内温度上升还是很慢；13d后温度持气温相对很低，

受气温、曲内物质代谢等因素的影响，到22d时达到续上升，

高温转化期所要求的温度，该阶段是让已大量生成的菌代谢产物转化成香味物质，由于气温持续上升，曲温上升得很快，对曲中微生物生长不利，可采取开门窗排潮、翻曲的措施来使得22～28d内温度控制在55℃左右。由于水进行降温，

分的挥发，曲中物质的形成，曲温会开始下降，当水分达到一

指标时，则进入后火生香期，目的是以后火促进曲心少量多28d过余水分挥发和香味物质的呈现，温度要不低于45℃，要达到45℃左右，这一时期是很关键的。后曲温持续下降，

最后一步则打拢，要保持常温使其不受外界的影响

。

图1

Fig．1

制曲过程中曲温和气温的动态变化

ThedynamicchangesofDaqutemperatureandairtem-peratureduringDaqucultureprocess

2．2系

制曲过程中微生物的数量变化与大曲理化指标的关根据大曲采样时间的不同，将试验结果进行汇总。试验大曲培养过程一般为30d左右，自原料与水混合时，曲

取其平均值记录，数据结果详见表1。采用2次平行，

料内的微生物就发生了一定量的变化，在整个周期内，随着大曲各项指标的不断变化，各种微生物的数量起起落落，此消彼长，几种主要的生化指标一直在变动，直至曲块成熟，水分降到一定的范围内，才基本趋于平衡，根据取样时间的间综合分析微生物在大曲制作中的动态变化。隔，2．2．1

细菌的变化。由表1看出，原料加水后，微生物主要

来自于水、空气、原料、机械设备等。对曲的原料进行培养，大曲成块入房后，随着曲块内部的物理变化和生化变化，则曲温及酸度发生相应的变化，由于生理指标上大曲的水分、

的变化，细菌数量在不同时间段内发生的变化不同。曲块入房5d左右，细菌的数量为最多，是大曲发酵阶段中的高峰值，因为此时的水分含量、曲温、酸度对细菌来说是繁殖的最佳时期；5～20d，细菌的数量急速下降，在20d左右出现低谷，这是由于水分下降、曲温过高、酸度上升等综合因素的影淘汰部分不适宜生长的细菌，则适应该条件的细菌能继响，

续生长；20～31d，细菌数量又有所上升，但是未达到前期出现的高峰值，源于水分一直下降、曲温下降、酸度相对稳定，则又给细菌的生长提供了良好的条件，细菌数又增加。2．2．2

酵母的变化。由表1看出，原料中的酵母数量比细

9d但入房培养后，酵母菌数量有所增加，菌数量相对较少，

左右出现高峰，在这段时间内，曲温低，曲块相对疏松，则氧分多，水分含量对酵母的生长很适宜。酵母利用糖类等物质进行发酵，当产生一定营养与糖分时酸度下降到一定程度，则酵母的数量猛增。9～25d，酵母菌数量迅速降低，在培养后的25d左右出现低谷，这主要是由于曲温逐渐上升，淘汰了一些不耐高温的酵母菌，水分减少、酸度变大，这样的条件不适合酵母菌生长。25～31d，酵母菌的数量有所回升，由于曲温下降为低温酵母提供了良好的条件，水分的下降会影响酵母菌的生长，但曲温和酸度下降等因素创造了酵母菌生长繁殖的条件，总体而言出现了酵母菌数量略上升的趋势。

表1

Table1

制曲时间Time∥d591315202531

大曲制作过程中其微生物数量及理化指标的变化情况

MicrobesquantityinDaqucultureprocessandvariationofphysicalandchemicalindex

理化指标Physicalandchemicalindex

水分Moisture∥%酸度Acidity曲温Temperature∥℃

33．550．4542．834．280．8544．532．281．2542．029．950．7048．528．901．0557．019．721．1559．614．861．0043．5

6

微生物数量Microbequantity∥×10cfu/g大曲细菌Bacteria酵母菌Yeast霉菌Mould

415．0145．0160．0250．0250．0765．0126．0130．0750．097．0110．0140．028．095．092．042．542．517．567．947．030．0

2．2．3霉菌的变化。由表1看出，霉菌数在前9d呈上升趋微生物不能充分生长，酶系形成量也不足，而且由于发热低，

曲块水分排不干，将严重影响大曲的质量。量少，

（3）大曲酒发酵的实质是各种微生物“群微共酵”的混pH、微生物的培养主要根据养料、水分、温度、氧合生长过程，

分的不同来控制发酵进程。菌种通过相互协调、抑制而达到以代谢各种相同的、不同的酶系来产生曲酒生产所必平衡，须的催化物质。

（4）各类微生物数量出现高峰值的时间段不同，适宜它们生长的理化指标也不同。在大曲培养过程中，酵母菌和细霉菌数量较多，大曲的糖化力很高。各种微菌的数量较少，

主要受温度、水分、酸度等指标的影响。曲温是生物的数量，

在大曲制作培养过程中控影响微生物数量变化的主要因素，

制曲温相对重要，在生产中要采取相关的措施来控制曲温。参考文献

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在这段时间内主要目的是曲块表面挂衣，即在湿度大、温势，

尤其让在曲块上繁殖最快的度低的条件下使霉菌大量增长，

高峰过后，根霉充分生长。霉菌的数量在9～13d达到高峰，霉菌的数量急剧下降，这主要是因为温度的升高，曲中养分水分和酸度的变化等因素抑制了大多数霉菌的生长，不足、

但是在恶劣的环境条件下，一些耐高温的霉菌孢子仍能生前期霉菌在所有微生物中是优势群体，存。在制曲过程中，

15～25d时，霉菌的数量持续下降；25～31d时，霉菌的数量原因在于水分含量和酸度下降，曲温下降，适合该有所回升，

相对需水量少的霉菌数量呈现上升趋势。条件的霉菌生长，3

结论与讨论

（1）大曲在培养过程中，微生物的变化是有一定规律的。微生物数量在入房初期出现高峰，这是由于培养初期的曲水分、酸度等因素都适宜微生物的生长；到培养中期有所温、

下降，并且微生物的数量会出现低谷的现象，但是这段时期过后，微生物的数量又有所回升，源于大曲培养过程中采取使得一些微生物生存下来，其他适应该条件的的相关措施，

微生物出现，使得微生物的数量又有所增加。

（2）大曲培养过程中，“前火不可过大”，前期温度升得过快过高，微生物不能充分生长繁殖，短短的几天对后期培；“后火不可过小”，降温期是大曲中保留养会造成很大影响

微生物增长的重要时期，所以在实际的生产过程中，需要重视这一段时期的培养管理，如果温度降得太快或控制得太

檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪

（上接第21756页）

利用效率，快速有效地实现酶分子与产物的分离。3

结论

通过对固定化漆酶催化茶多酚合成茶黄素的初步研究表明，采用树脂载体D152可有效固定漆酶，固定化漆酶在反反应体系pH5，底物浓度2．0g/L，通氧量20应温度60℃，

L/min，反应时间1．5h。

与传统的酶促合成方法相比，固定化漆酶能有效提高漆反应结束后固定化漆酶容易与底物酶的稳定性和利用效率，

分开，可回收重复使用，同时反应产物也较容易纯化。参考文献

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173．

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