肌糖原的酵解作用实验报告

肌糖元的酵解作用

学号：200900140157 班级：09生科3班 姓名：俞华军 时间：2011/03/27

一．实验目的

1.学习鉴定糖酵解作用的原理和方法。

2.了解酵解作用在糖代谢过程中的地位及生理意义。 3.了解有关组织代谢实验应注意的一些问题。

二．实验原理

在动物、植物、微生物等许多生物机体内，糖的无氧分解几乎都按完全相同的过程进行。本实验以动物肌肉组织中肌糖元的酵解过程为例。肌糖元的酵解作用，即肌糖元在缺氧的条件下，经过一系列的酶促反应，最后转变成乳酸的过程。肌肉组织中的肌糖元首先磷酸化，经过己糖磷酸酯、丙糖磷酸酯、甘油磷酸酯、丙酮酸等一系列中间产物，最后生成乳酸。该过程可综合成下列反应式： （1/n）(C6H10O5)n+H2O 2CH3CHOHCOOH

肌糖元的酵解作用是糖类供给能量的一种方式。当机体突然需要大量的能量，而又供氧不足（如剧烈运动时），则糖元的酵解作用可暂时满足能量消耗的需要。在有氧条件下，组织内糖元的酵解作用受到抑制，而有氧氧化则为糖代谢的主要途径。

糖元酵解作用的实验，一般使用肌肉糜或肌肉提取液。在用肌肉糜时，必须在无氧条件下进行；而用肌肉提取液，则可在有氧条件下进行。因为催化酵解作用的酶系统全部存在于肌肉提取液中，而催化呼吸作用（即三羧酸循环和氧化呼吸链）的酶系统，则集中在线粒体中。

糖元或淀粉的酵解作用，可由乳酸的生成来观测。在除去蛋白质与糖后，乳酸可以与硫酸共热便成乙醛，后者再与对羟基联苯反应生成紫罗兰色物质，根据颜色的显现加以鉴定。该法比较灵敏，每毫升溶液含1——5ug乳酸即给出明显的颜色反应。若有大量糖类和蛋白质等杂质存在，则严重干扰测定，因此实验中应尽量除尽这些物质。另外，测定时所用的仪器应严格地洗干净。

三．实验器材

1.材料：鸡或兔的肌肉糜

2.试剂：1／15mol/L磷酸缓冲液(pH7．4)、淀粉溶液：0.5%、液体石蜡、CuSO4饱和溶液、Ca（OH）2粉末、 20%三氯乙酸、浓硫酸；

对羟基联苯试剂：称取对羟基联苯1．5g溶于100ml 0.5％NaOH中，配成1．5％的溶液。若对经基联苯颜色较深，应用丙酮或无水乙醇重结晶，放置时间较长后，会出现针状结晶，应摇匀后使用。

3.器材：8支试管及试管架；移液管：5m1、2m1、1ml、0.5ml；电子天平；滴管；

玻璃棒；恒温水浴；沸水浴； 漏斗；冰浴；滤纸；量筒；旋涡搅拌器

1 四．实验步骤

1.处死动物和制备肌肉糜 2.肌肉糜的糖酵解

（1）取4支试管，编号后各加入新鲜肌肉糜0.5克。1，2号管为样品管，3，4号管为空白管。向3，4号空白管内加入20%三氯乙酸3mL,用玻璃棒将肌肉糜充分打散，搅匀，以沉淀蛋白质和终止酶的反应。然后分别向4支试管内加入3mL磷酸缓冲液和1mL0.5%淀粉溶液。3，4管用玻璃棒充分搅匀，加液体石蜡以隔绝空气，并将4支试管同时放入37℃恒温水浴中保温。

（2）1h后，取出试管，立即向1，2号试管内各加入20%三氯乙酸4mL，充分混匀。然后向每管（一次性试管）内加入饱和硫酸铜溶液1mL，混匀，再加入0.4克氢氧化钙粉末，充分搅匀2min，放置10min，使还原糖沉淀完全，过滤，保留滤液。

3.乳酸的测定

（1）取4支洁净、干燥试管，编号，各加入浓硫酸2mL，将试管置于冰水浴中冷却，分别取每个样品的滤液2滴，直接加入到已冷却的上述浓硫酸溶液中，随加随摇动试管，避免试管内的溶液局部过热。

（2）将每个试管混合均匀后，放入沸水浴中煮5min，加入对羟联苯试剂2滴，混匀试管内容物，比较和记录各管溶液的颜色深浅，并加以解释。

表一 实验步骤示意图

试管编号 肌肉糜 三氯乙酸 淀粉溶液0.5% 磷酸盐缓冲液 三氯乙酸 饱和CuSO4 Ca(OH)2粉末 各加1mL 3mL 加液体石蜡封口，37℃水浴保温1h 3ml 吸出液体石蜡后，各加1.0ml 各加0.4克 充分搅拌，振荡10min，静置1min ，过滤 另取4支洁净干燥的10ml试管，各加2ml浓H2SO4置于冰浴中，分别加 入溶液2滴，边加边摇，混匀，放入沸水浴中5min，加入显色液2滴，取出冷却，比较颜色，分析结果 1 2 0.5g 3mL 3 4

2 五．实验结果记录与处理

1．1、2试管呈深紫色；3、4号试管呈微紫色，略带紫色，基本无色； 2.实验图示：

图一 四支试管的颜色图

从左往右依次为：3号、4号、1号、2号试管

六．实验分析及注意事项

1.在碾碎肌肉糜时，要注意玻璃棒不要硬捅试管底部，而是挤压试管壁。

2.空白组加完三氯乙酸后，不要急着加磷酸缓冲液，而是不断用玻璃棒搅动肌肉糜，使肌肉糜完全失去血色，变为白色为止，即熟肉的颜色一样，此步骤是本实验的关键所在，要是没有使空白组中的酶没有完全失活，则空白组中也会发生酵解作用，所以会使最后的空白组有颜色。 3.加入淀粉溶液的目的是增加第五浓度，使酵解左右明显，从而使实验结果明显。 4.实验中加入石蜡的目的是为了产生无氧环境，从而使酵解左右得以正常进行，否则在有氧条件下会进行有氧呼吸，不产生乳酸。

5.实验中加入饱和硫酸铜溶液的目的是为了除去糖，加氢氧化钙的目的是为了让蛋白质变质，原因是糖类和蛋白质会影响最乳酸的显色反应，此步骤也是实验的关键，加入这两样东西后，一定要充分振荡，除去糖类和蛋白质的影响。 6.用于检验乳酸产物的四只试管必须是干燥洁净的，否则可能会混入糖类或蛋白质对最后结果产生影响。

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