胶体金快速诊断技术在兽医临床诊断中的应用

胶体金快速诊断技术在兽医临床诊断中的应用

胶体金快速诊断技术在兽医临床诊断中的应用

杨雪林*1 张福官1 杨卫华2 周海南3 沈政会1

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（1江苏省吴江市震泽动物防疫站，江苏吴江215231；江苏省吴江市平望动物防疫站；江苏省吴江市横扇动物防疫站）

摘 要：胶体金快速诊断技术不需要特殊设备，结果判断直观，越来越受到人们的重视，在生物医学领域特别是检验中得到广泛的应用。关键词：胶体金；快速诊断；免疫层析

中图分类号S851.32 文献标识码B 文章编号1007-7731（2010）02-036-002以膜为固相载体的胶体金快速诊断技术是20世纪80年代在酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验、单克隆抗体技术、胶体金免疫技术和新材料技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术。由于其快速、便捷、不需特殊设备、结果判断直观，近年来越来越受到人们的重视，其技术发展迅速，在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用。目前在兽医临床诊断中也研制了许多种检测试剂盒，其基本原理是：以微孔膜为固相载体，包被已知抗原或抗体，加入待测样本后，经微孔膜的渗滤作用或毛细管虹吸作用使标本中的抗体或抗原与膜上包被的抗原或抗体结合，再通过胶体金标记物与之反应形成红色的可见结果。目前最为广泛使用的有2种特定的模式：穿流形式（Flow through），又称为斑点免疫金渗滤试验（Dot immuno-gold filtration assay，DIGFA）或免疫渗滤试验（Immunofiltration assay，IFA ）；另一种为侧向横流形式（Lateral flow），又称为胶体金免疫层析试验（Gold Immunochromatographic assay，GICA）[2]。本文将重点介绍胶体免疫层析试验。

[1]

电的氨基反应；其次蛋白质通过疏水作用吸附于金颗粒表面；配位键是通过蛋白质中半胱氨酸的硫残基与金颗粒的电子层发生配位结合。

在特定条件下，使胶体金溶液与某种蛋白质溶液相混合，胶体金颗粒便可把该蛋白质分子吸附在其表面上，形成一种包被了该种蛋白质的示踪物或探针。若包被的蛋白质为抗体，则胶体金颗粒便是一个表面布满了抗体的球形粒子。用此胶体金粒子可以检测其包被抗体对应的抗原；反之，若以抗原包被胶体金颗粒，则可用其检测该抗原对应的抗体。上述两类包被胶体金称之为免疫胶体金。1.3 胶体金快速诊断试纸

胶体金快速诊断试纸通常包括加样区、反应区和吸附区三部分组成。

通常由玻璃纤维将免1.3.1 加样区 含有免疫胶体金颗粒，疫胶体金颗粒吸附在该区。

一条为检测线，一1.3.2 反应区 喷涂或点加两条反应线，

条为质控线。检测线用以检测此处的抗体（或抗原）物质与免疫胶体金颗粒的包被抗原（抗体或抗体携带的抗原）的反应性；质控线则用以检测免疫胶体金颗粒上的包被蛋白质的活性及程度，反应区的材料主要是硝酸纤维素膜。将由1.3.3 吸附区 由较厚的滤纸或类似的吸水材料制成，加样区经反应区层析上来的剩余免疫胶体金颗粒等吸附于其中，该区提供层析的动力。免疫胶体金颗粒由加样区释放后，经反应区，部分继续到吸附该区，完成层析。1.3.4 试纸条的检测 以犬瘟热诊断试纸条为例说明试纸条检测的应用：犬瘟热诊断试纸条是利用纯化的犬瘟热单克隆抗体、纯化的犬瘟热多克隆抗体、兔抗鼠抗体以及胶体金免疫层析技术而成的诊断方法。将胶体金标记的犬瘟热单克隆抗体吸附于玻璃纤维，将犬瘟热多克隆抗体和兔抗鼠抗体分别喷涂于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线。

拭子采集病犬的鼻液、唾液、眼分泌物，专用稀释液稀释，滴加到试纸的加样区，若检样品中含有犬瘟热病毒抗原时，抗原在渗滤作用或毛细虹吸作用下向上泳动，首先

1 胶体金快速诊断试纸的诊断原理

1.1 胶体金

胶体金（Colloidal gold）是由金离子还原而成的许多单个金颗粒组成的悬浮液，胶体金颗粒是由一个基础的晶核及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuCl2-），外层离子H+则分散在胶体间溶液。金颗粒表面所包围的阴性电荷层，叫做zeta电位，可以使胶体金颗粒之间相互排斥而使悬浮液保持稳定。

胶体金颗粒可以从5～150nm不等，制备胶体金仍基于还原法，常用的有鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等各种有机或无机化合物。还原剂的浓度和还原力越高，所合成的胶体金颗粒就越小。胶体金2～5nm是桔黄色，10～20nm是酒红色，大颗粒30～64nm是深红色。1.2 免疫胶体金

胶体金标记，实质上就是蛋白质等高分子物质被吸附到胶体金颗粒表面的过程。蛋白质与金颗粒的结合机制大概有以下几个方面：带负电荷的金颗粒与蛋白质上的带正

杨雪林（1967-），男，江苏吴江人，大专，兽医师，从事动物防疫研究工作。作者简介：

2010-01-07*通讯作者 收稿日期：

胶体金快速诊断技术在兽医临床诊断中的应用

与金标单克隆抗体结合，形成二元复合物，然后继续上升，当到达硝酸纤维素膜上的检测区时，该复合物被膜上包被的犬瘟热多克隆抗体捕获，形成“金标犬瘟热单克隆抗体/犬瘟热病毒抗原/犬瘟热多克隆抗体”三元复合物，使该区带显红色，未与犬瘟热多克隆抗体结合的二元复合物继续向上层析，当到达质控线位置时，与包被的兔抗鼠抗体结合，形成“兔抗鼠抗体/金标犬瘟热单克隆抗体/犬瘟热病毒抗原”三元复合物，使该区带同样显红色。若被检样品中不含有犬瘟热病毒抗原时，则检测线所在区没有反应发生，不会出现红色带，质控线形成“兔抗鼠抗体/金标犬瘟热单克隆抗体”二元复合物，仍出现红色。若质控线不出现红色说明该试纸条失效。

抗原，免疫动物后产生高效价的特异性抗体，纯化抗体与胶体金结合成免疫金，制备成简易的检测试纸条。免疫金试纸法对盐酸克伦特罗的最小检测量为40ng/ml，试纸条在室温保存150d不影响检测结果。实验检测86份ELISA试剂盒阴性样品和42份阳性样品，其符合率分别为100%和95.2%。

李蓓蓓[8]等采用胶体金同时标记新城疫单克隆抗体和禽流感单克隆抗体制备复合型胶体金免疫试纸条可同时检测两种病毒。试纸条检测NDV的灵敏度比HA试验结果高8倍。

3 胶体金快速诊断技术应用展望

3.1 进一步提高检测灵敏度

灵敏度的提高无疑会拓宽胶体金诊断的检测范围，而采用信号放大系统如生物素－亲和素系统或免疫金银染色法进行银加强，并结合一些相应的简单检测仪器可能是最有希望的途径之一。3.2 实现检测多元化

可采用在同一膜上作多种项目测定和多项目的组合测定2种方式。一次检测可同时得到一组结果，这对于检测某些具有联检意义的物质具有很大的应用价值。3.3 实现定量或半定量检测3.4 通用试剂的应用

在间接法检测中用胶体金标记葡萄球菌蛋白A用于各种抗体的检测，有利于减少非特异性反应，稳定检测试剂的质量。链霉亲和素固定滤膜检测带可作为通用固定受体，与各种生物素化抗体结合用于检测相应的抗原性物质。由于链霉亲和素的四价性使其固定于膜材料后，仍能对生物素化抗体保持较高的反应活性，而且两者的结合具有高度的稳定性。参考文献

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（徐爱民编，张宏民校）

2 胶体金快速诊断技术在兽医临床诊断中的应用

曹春梅[3]利用针对O9抗原的2株单克隆抗体的夹心和胶体金免疫层析试纸条巧妙的设计优势，成功建立了快速检测沙门氏菌O9抗原的新方法。测定沙门氏菌O9抗原的胶体金免疫层析条，作为一种初筛试验，其实用性在人工污染样品试验和现场检测试验中得到验证，该方法简单、快速、特异、可单份测定，除试剂外无需任何仪器设备和专门的技术人员，且试剂稳定适合大规模推广应用。

张改平[4]等以高亲和力和高特异性传染性法氏囊病毒（IBDV）单克隆抗体为基础，成功的研制出鸡传染性法氏囊病（IBD）快速诊断试纸条。试验结果表明IBD试纸与鸡的NDV、ALV、IBV、ILTV、MDV无交叉反应。IBD试纸条具有良好的特异性和敏感性，其敏感性与琼扩试验相比，则提高了32～64倍，能够识别不同的IBDV毒株包括强毒和弱毒，与ELISA的阳性符合率为100%。对于人工感染IBDV鸡，感染后36h在感染鸡的法氏囊即可检出IBDV，从检测到获得结果仅需要12min，IBD试纸具有特异、敏感、快速、简单等特点，不需要任何专业技能和其它试剂，实现了鸡病诊断的一步法。

戴荣四[5]研制的鸡新城疫胶体金免疫层析试纸条对大量鸡新城疫病例进行了测试，并与鸡新城疫的常规检验方法HA和HI试验的试验结果进行了比较，阴性符合率和阳性符合率均为100%，检测证明其既敏感又稳定，且具有特异性，保存较长时间，特性不发生改变。

王中力[6]等建立一种简便、快速、准确检测犬细小病毒（CPV）的胶体金免疫层析法。采用柠檬酸三钠法制备胶体金颗粒，标记纯化的CPV单克隆抗体，在玻璃纤维素膜上喷加纯化的CPV多克隆抗体，制成诊断CPV抗原的快速诊断试纸条。用本试验研制的CPV试纸条检测收集到的120份犬粪便样品，其结果与HA结果相比对，HA效价在1:40以上，试纸条均能检测到为阳性。CPV试纸条与犬瘟热病毒及犬传染性肝炎病毒无交叉反应。且试纸条保存6个月后，其检测结果重复性为100%。试验证明该方法是一种快速、灵敏、特异的抗原检测方法，可在临床上广泛应用，也可用于CPV的流行病学调查。

刘见[7]采用自身兔蛋白制备制备盐酸克伦特罗载体

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