大豆异黄酮对乳腺癌细胞TGFβ表达的影响

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肿瘤防治研究 2 0 0 1年第 2 8卷第 2期

大豆异黄酮对乳腺癌细胞 TGF I￣表达的影响扬镇洲‘,糜漫天，朱俊东，张乾勇

摘要：目的

探讨大豆异黄酮作用后 B G a p一 3 7人乳腺癌细胞 T GF p和T GF p受体表达的改

变。方法班：羟异黄酮、三羟异黄酮处理 B C a p一 3 7细胞 .采用 TG邵拮抗试验、 We s t e r n b l o t分析

和原住杂交等实验方法，检测大豆异黄酮作用后 B C a p一 3 7人乳腺癌细胞 TGF、 TG F 及受体表达的变化。结果 3×1 0 mo l/ L三羟异黄酮作用后 B c a p一 3 7细胞 TG F/ 3 、 TG F陡及受体表迭增强， 三羟异黄酮可促进 B c a p一 3 7细而：羟异黄酮处理组在相同作用浓度下其表达无明显改变。结论胞 TGF[ 3 .、 T GF 及受体的表达。

美键词：大豆异黄酮；乳腺癌；持化生长因子口 中图分类号： R 7 3 7 . 9; R1 5 1 . 2文献标识码： A 文章编号； 1 0 0 0— 8 5 7 8 ( 2 0 0 1 ) 0 2— 0 0 8 6— 0 3

Ex p r e s s i o n o f T r a n s f o r mi n g Gr o wt h F a c t o r 1 3 i n Hu ma n B r e a s tCa n c e r Ce l l s I n du c e d b y S oy b e a n I s of l a v o ne sYANG Zh e n— z h o u, MI Ma n— t i a n, Z HU J u n— d o n g, a t a l

D d m曲f o f Nu￣i t l o n[ - I y g i e n e, T h i r d Mi l i t a r y Un i v e r s i t y, C h o n g q i n g 4 0 0 0 3 8 抽Ⅱ A b s t r a c t:Ob j e c t i v e T o i n v e s t i g a t e l h e c h a n g o f e x p r e s s i o n o f T GF— B a n d TG F— B r e c e p t o r i n t h e h u ma n b r e a s t c a n c e r c e i l s B Ca p一 3 7 i n d u c e d b y s o y

b e a n i s o l f a v o n e s . Me t h o d s TG F[ 3 l、 TG F[￣ R I mRN A a n dp r o t e i n o f . B e a p一 3 7 c e l l s we r e d e t e r mi n e d wi t h I n s i t u h y b r i d i z a t i o n a n d i mm u n o b l o t t i n g a f t e r c e i l s we r e

t r e a t e d wi t h d a i d e i n O r g e n i s t e i n f o r 1~2 d a y s . Th e e x p r e s s i o n o f TGF a n d TGF一 wa s d e t e r mi n e d wi t h

TG F一口r e s i s t a n c e t e s t . R e s u l t s t h e e x p r e s s i o n o f T GF一&、 T GF一 a n d T GF— B r e e e p o r i n c r e a s e d i n B e a p一 3 7c e l l s a f t e r t h e y we r e g i v e n 3×1 0 mo l t l o f g e n i t e i n . Co n c l u s i o n Ge n i s t e i n c a n i n c r e a s e t h e e x p r e s s i o n o f

TG F— B 1、 TGF一&a n d T GF— p r e e e p o r .Ke y wo r d s: S o y b e a n i s o f l a v o n e s; B r e a s t c a n c e r; TGF— B

近年来食物非营养成分的抗癌作用受到广泛关注，其中大豆异黄酮 ( s o y b e a n i s o f l a v o n e s )对乳腺癌的防治作用已成为研究热点，但其作用机制尚不清楚[ 。大豆异黄酮是大豆中一类重要的非营养成 I

实 TG邵是一类重要的生长负调节因子，其缺乏在乳腺癌的发展过程中起重要作用]。目前认为临床应用的抗雌激素药物他莫西芬其治疗乳腺癌的作用机理之一就是诱导乳腺癌细胞自分泌 TG F B,刺激 T GF[ 3受体表达，从而抑制乳腺癌细胞增殖[ 6]。提示同样具有抗雌激索性质的大豆异黄酮抑制乳腺

癌细胞增殖可能也与 TGF B系统有关。本研究选择国内建株的 B e a p一 3 7人乳腺癌细胞为实验对象，通过观察二羟和三羟异黄酮作用后 B c a p一 3 7细胞 T GF[ 3及

分，它主要包括以糖苷结合形式存在的染料术苷( g e n i s t i n )和黄豆苷 ( d a i d z e i n )。染料术苷和黄豆苷在肠道细菌的作用下糖苷部分脱离，释放出二羟异黄酮 ( d a i d z e i n )和三羟异黄酮( G e n i s t e i n )。。也已证

收稿日期： 2 0 0 0 - 0 5— 1 3;修回日期： 2 0 0 0— 0 7— 2 7 基金项目t田术自然科学基仝赍助项目( 3 9 7 7 0 6 4 9 )

受体表达的变化，对揭示大豆异黄酮抗癌的作用机制有重要意义。 1 . 1材料

作者单位： 1 . 4 0 0 0 3 8重庄，革三军医大学附属太坪盂晓血 1材料与方法液肿瘤科{ 2 .革三军医大学营养卫生学教研室

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1 . 1 . 1试剂

二羟异黄酮和三羟异黄酮 ( S i g ma公

液预杂交 4 5 C1 . 5 h,杂交液 (每片加古有 T GF 或T G F I 3 R I探针标记液 ) l O I, 4 5 C 2 2 h, 4×S S C 3 7 C l 5 mi n, 2×S S c 3 7℃l 5 mi n .依次转人 1×S S C、 0 . 5 ×S S C中各 3 7 r l 5 mi n, 0 . 1 m o l/ I P B S漂洗 3 7 Cl 5 mi n, Bu f f e r 1(三蒸水) 5 ai r n, Bu f f e rⅡ( 1阻断

司产品),兔抗 TG F p -和T GF B z、兔抗 T GF I 3 R I和T GF B R I( S a n t a C r u a公司产品 ), T GF B l探针(购

白北京医科大学病理学教研室),地高辛标记试剂盒( B o e h r i n g e r Ma n n h e i m公司产品) 1 . 1 . 2仪器1 . 2方法

Ol y mp u s B H一 2型显微摄影仪， T i g e r

液： 9双蒸水 ) 3 7 C l h, B u f f e r I 5 mi n,加 An t i— D i g— Ap抗体 ( 1:1 0 0 0稀释

) 3 7 C i . 5 h, B u f f e r I S ai t n,Bu f f e r1 1( 1 M Tr i s HCl 5 ml, 1 mo l/ L Na Cl 5 ml, 5

细胞图像分析仪。1 . 2 . 1 细胞培养 B c a p一 3 7人乳腺癌细胞株购白 中科院上海细胞所。细胞在古 l 0 热灭活小牛血清、每毫升培养基中古 5 u I胰岛素的 R P MI— l 6 4 0培养液中常规培养传代二羟异黄酮和三羟异黄酮分

mo l/ I M g C I 2 0 . 5 ml, d d H2 03 9 . 5 m1 ) 5 mi n,加 NB T/ B C I P显色液室温、暗处 3小时，以0 . 1 mo l t I P B S 冲洗终止反应 烘干、梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树腔封片。杂交前所需液体及器具均需 D E P C无RNAa s e处理。

别溶于二甲基亚砜 ( DMS O),处理细胞浓度为 3× 1 0一 mo l/ L,对照组培养液中仅古相应浓度的DM S O( O . 0 5 )

以杂交液中不加核酸探针作为阴性对照，杂交步骤同前染色后光镜下作定性观察，用图像分析系统作定量分析。在每帧图像上随机取 1 O个细胞的积分光密度值代表 TG F— B。和T GF I 3 R I mR NA的表达强度 1 . 2 . 5统计学处理所有数据均以 z士表示，采用 S P I M软件对实验结果进行方差分析处理。尸< 0 . 0 5为差异显著， P< 0 . 0 1为差异非常显著。2结果

1 . 2 . 2 TG F B。和T GF艮拮抗试验

以5×1 0‘/ m1

细胞密度接种于 9 6孔培养板中，设对照组、

G e n l s t e i n+抗 T GF— B l处理组、 G e n i s t e i n+TG F一艮处理组、 D a i d z e i n+抗 TGF— B l处理组、 Da i d z e i n+抗 T GF一&处理组 ( TG F— B。、 T GF一&抗体终浓度均为2 mg/ L),Ge n i s t e i n处理组、Da i d z e i n处理组

( Ge n i s t e i n和 D a i d z e i n剂量是 3 0￣ mo l/ I ),处理 2 4、 4 8、 7 2、 9 6 h,每一剂

量组设 6个平行孔，于每个时相收获细胞前 6 h加人 H— Td R( 1 . 8 5×1 0 B q/孔),

2 . 1 拮抗 TG F B对 B c a p一 3 7细胞。 H— T d R掺人的影响

常规收获细胞，测d p s值 (单位： B q )。1 . 2 . 3人乳腺窟细胞 TG耶和 T GF I 3 R I蛋白质检测用 W e s t e r n b l o t分析。 l×1 O个细胞，加 i 0 0/￣ i预冷至 0 C的 l NP一 4 0裂解液 (古 5 0 mm o l/L Tr i s、l 5 0 mmo l/ L Na Cl、1 NP一 4 0、2 5 mmo l/ L

T GF B拮抗实验结果表明， T GF p 和 T GF口拮抗组与处理组比较，用 TG F B抗体拮抗后，三羟异黄

酮+抗 T G即组 DNA合成能力显著增强 (尸<0 . 0 1 ),而二羟异黄酮+抗 T G耶组 D NA合成能力无明显改变 (尸> O . 0 5 )。 2 . 2二羟异黄酮和三羟异黄酮诱导 T GF限 I及

Na F、 5 mmo l/ I Na I P 2 O 7、 5 mmo l/ L Na 3 P Ol、 0 .1S DS、 i mmo l/ L PMS F、 1 0 mg/ L Le u p e p t i n、 l O mg/ I .

A p r o t i n a i n ),冰上放置 3 0 mi n, 4℃离心 l 2 0 0 0 r p m×

T GF I 3 R l蛋白表达的变化免疫印迹分析发现，二羟异黄酮或三羟异黄酮处理 l~3 d后， B e a p一 3 7细胞表达 T GF I 3 R I蛋白增多.并里时间依赖性，但 T GF限 l I蛋白无明显改变。

2 mi n,将上清液转移到另一微量离心管中，分装后保存于一2 OC备用。每 2 O l蛋白质提取液中加人2 0/￣ 1 2×S DS凝胶加样缓冲液， 1 0 0C煮沸 5 mi n,以聚丙烯酰胺电泳后， 8 0 mA电转移转膜 2 2 h, l B S A封两 3 7℃ l h,加 l: 8 0 0稀释的抗一 T GF一岛或抗一

2 . 3各组 T GF B -和T GF t 3 RI mR NA表达的比较光镜下可见主要的染色阳性细胞里多角形或梭

T GF一如抗体 3 7 C孵育 1 h,按S P试剂盒操作反应

状，杂交的阳性产物为蓝色或紫蓝色颗粒，分布于细胞浆。对照组、二羟异黄酮和三羟异黄酮处理组的

后用 DAB显色。

1 . 2 . 4人乳腺癌细胞 TGF一岛和 TG F p RI mR NA检测用原位杂交方法。对照组、二羟异黄酮和三羟异黄酮处理组 B e a p一 3 7细胞处理 l~ 2天后，用 0 .

B e a p一 3 7细胞胞浆内均可见到 T GF口和 TGF B R I mR NA的表达，此信号在三羟异黄酮处理组显著增强，其中尤以处理 2天后的更为明显。图像分析结果同样证明，二羟异黄酮处理组与对照组相比， TGF口 和T GF I 3 R I mRNA表达无显著差异，而二羟异黄酮处理组与对照组有明显变化 (尸<0 . 0 1 )。见表 1,2。

1 mo l/ L P B S漂洗 3次，每次 5 mi n, 2×S S c 5 mi n,蛋白酶 K( 2￣ g/ m1 ) 3 7℃ 5 ai r n, 0 . I mo l/ I P B S/ 0 . 1

mo l/ l 甘氨酸 5 mi n, 0 . I mo l/ I P B S 1 0 ai r n, 4 多聚甲醛固定 5 mi n, 0 . 1 mo l/ L P B S漂洗 5 mi n,加杂交

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表 1各组 T GF# 1 mR NA表达的比较 h一8 )

发展过程中起重要作用。雌激素是公认的乳腺癌危险因子，目前认为临床应用的抗雌激素药物他莫西芬( Ta mo x i f e n)其治疗乳腺癌的作用机理之一就是

诱导乳腺癌细胞自分泌 TGF— B .刺激 TG F— B受体表* P< O .01 v s c o r nt r ol gr o up

达，从而抑制乳腺癌细胞增殖 .阻止乳腺癌进一步发展。这提示同样具有抗雌索性质的大豆异黄酮抑制乳腺癌细胞增殖可能也与 T GF— B系统作用有关。本研究结果表明，三羟异黄酮在相同的作用剂量 ( 3×

表 2各蛆 T GF# R I mR NA表达的比较“一8 )

*尸< O . 0 1 v s e o r n t r o l g r o u p

1 0一mo l/ I )下可使 B c a p一 3 7细胞 TG即 l、 TG

F 及受体表达增强，揭示大豆异黄酮通过诱导 T GF— B和 T GF 3受体表达的增加而抑制人乳腺癌细胞 B I c a p一

3讨论流行病学研究已显示 .东亚地区人群的乳腺癌、

前列腺癌和结肠癌的发病率远低于西方工业化国 家，近年来有研究者提出，这种差异与东亚地区食用较多的含植物雌激素的豆制品有一定关系”]。豆制品的抗癌性质一般认为是由于其含有低甲硫氨酸、 高肌酵六磷酸、皂苷、固醇和异黄酮，其中大豆异黄酮的抗癌效应是主要的]。大豆的异黄酮类主要是糖苷结台形式的染料木苷和黄豆苷两种，机体摄入豆制品后 .染料木苷和黄豆苷在肠道细胞作用下脱去糖苷基部分，释放出有生物活性的三羟异黄酮和二羟异黄酮，然后被机体肠道有效吸收，有关大豆异黄酮的抗癌作用研究主要是围绕三羟异黄酮进行

3 7增殖是一可能的重要分子机制。参考文献r 1] Ak i y a ma T. I s h i d a J, Na k a g a ma S . e t【 _ Ge n i s t e i n.Ⅱs p e df l c i a h i b l t o r o l t y r o s i n e— s p e c i f i c p r o t e i n k i n a s e[】] . J t ! i o l C h e m,1 9 8 7 . 2 6 2: 5 59 2— 55 9 5 .

[ 2] J o a n n e N D. B r a h mc h e t呻 S . Ma h b u h u r B, e t a【 _ G e n i s t e i n—i n du c d u p r e g ul a t i o n o l p2 1 ’ do wn r e gu l a t i o n o f e y c l i n B.

a n d i n d u c t i o n L f a p o p t o s L￣i n p r o s t a t e C￣ l n c e r c e l t s c J] . N u t rCa n c e r, 1 9 9 8, 3 2 ( 3) l 2 3— 1 31 .

[ 3]

S Wi l l i s(, M. F r a n k GR .e【a 1 . S o y b e a n￣ s o l l a v o n e s .ge n i s t e i n a n d g e n l s t i n,i n h i b i t r a t m

y n bl a s t p r o] i f e r a t l o n、

f u s i o n a n d my o t u b e p r o t e i n s y n t h e s i s[ J] . J N u t r、 1 9 9 9、 1 2 9( 7 ): 1 29卜1 2 9 7 .

的。三羟异黄酮受到广泛关注始于 1 9 8 7年， Ak i y o ma等口 研究发现三羟异黄酮是表皮生长因子

C 4 3 J o a n n o u GE . K e l l y G E、 R e e d e r A Y, e t a 1 . A u r i n a r y p r o f i l es t u dy of d i e t a r y p h yt o e s t r o g e n s The Me n t i f i c a t i o n a d a o nd

受体( E GF— R)酪氨酸激酶抑制剂。我们前面的实验已证实 3× 1 0一 mo l/ l 、 9×1 0一 mo l/ I的三羟异黄酮对 B c a p一 3 7人乳腺癌细胞具有明显的增殖抑制作用。本文通过 TG即拮抗试验、免疫细胞化学和逆转录聚合酶链式反应等方法研究了二羟和三羟异黄酮对国内建株的 B c a p一 3 7人乳腺癌细胞表达 T G即及

m o d e o l m e t a b o l i s m o l

i s o f l a v o n o l d s[¨

】S e r o i d

Bt o c h e m Mo l Bi ol、 1 9 9 5、 5 4【 3 _ 4 )l l 6 7 _ 1 84

[ 5] Wa k e f i e l d L M. C o l l e t t a AA、 Me n H n e B K、 e t a l R o l e s I n rt r a B s f o r mi n g g o wt r h l a c t o r￣b e t a i n t h e g e n e s i s- pr e v e nt i o n.

a n d【 mm e i r t I 1『 b r e a s t e a n c e r C j]、 C a n c e r T r e a t R e s . . 1 9 9 2,6 1: 9 7 - 1 3 6 .

[ 6] B u t t a A、 Ma c l e n n a n K. F l a n d e r s KC. e t a 1 .I n d u c t i o n o ft r a n s f o r mi ng g r o wt h f a c t o r i n h uma n b r e a s

t c a n c e r i n Vi v o

其受体的影响 .目的在于揭示大豆异黄酮抗癌作用的分子机制。 近年来关于大豆异黄酮抗癌的动物和体外实验

f o l l o w i n g t a m n x i l e n t r e a t m e n t[ J]C, e n c e r R e s . 1 9 9 2 . 5 2( 1 5 ): 42 6 1 42 6 4

资料激增殖 .但是迄今为止其作用机制尚未完全阐明。转化生长因子一口 ( TGF一 1 3 )是一类具有多种生物学功能的细胞因子，它参与调节许多生物学反应过程。TG F— B受体是组成型具有丝氨酸蛋白激酶( S P K)活性的受体，在调控细胞增殖过程中有重要作用。T GF— B的重要生物功能之一就是抑制肿瘤细胞增殖， Wa k e f i e l d等口 报道 T GF B缺乏在乳腺癌的

[ 7]

H o n r - R o s s P L -B a r n e s S .L e e M.e t a 1 .A s s e s s i n gph y t o￣t r o ge n e x p o s u r e i n e p i d e mi ol og i e s t u d i e s}

d e v e l o p me r u o f a d a t a b a s e[ J] . C a n c e r C a u s e s C o n t r o l、20 00 t 11 ( 4)} 2 8 9— 2 9 8 .

C 8] S a k a m o t o K . S y n e r g i s t l e c l i e n t+ o f t h e a r h h i g l n a n d g e n i s t e l n O nhu ma n p r￣ q t a t e t u l * l￣ o r c e I l M ( Pr,3) g r o wt h vi a c e l l c y c l e

￣ r r e s 1[ J] . C a n c e r L e t【 - 2 0 0 0, 1 5 1 ( 1 ) I 1 0 3— 1 0 9

(熊

静校时 )

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