植物细胞的悬浮培养技术

毕业论文(设计)

题 目 姓 名 专 业 指导教师

浅谈植物细胞的悬浮培养技术 姚虎 学号 014010210118 生物工程（070404） 王大红 职称 讲师 中国·武汉 二○一二年四月

目录

摘 要 ........................................................................ 3 关键词 ....................................................................... 3 Abstract ....................................................................... 3 Key words ..................................................................... 3 前言 ......................................................................... 4 1.细胞悬浮培养的定义 .......................................................... 4 2.单细胞制备的方法 ............................................................ 4

2.1 机械法 ................................................................ 4 2.2酶解法 ................................................................ 4 2.3 愈伤组织诱导法 ........................................................ 4 3.悬浮培养的条件 .............................................................. 5 4.细胞初始培养 ................................................................ 5 5.细胞悬浮培养的类型 .......................................................... 5

5.1分批培养 .............................................................. 5 5.2连续培养 .............................................................. 6 6.悬浮培养细胞的同步化 ........................................................ 6

6.1 物理方法 .............................................................. 6

6.1.1 体积选择法 ...................................................... 6

6.1.2低温处理法 ....................................................... 6

6.2 化学方法 .............................................................. 6 6.2.1 饥饿法 .......................................................... 6 6.2.2抑制法 ........................................................... 6

7.规模化培养 .................................................................. 7 8.存在问题与前景展望 .......................................................... 7

8.1植物细胞与动物细胞，微生物比较存在的优势 .............................. 7 8.2植物细胞培养过程中存在的困难 .......................................... 7 8.3前景展望 .............................................................. 7 参考文献 ..................................................................... 8 致谢 ......................................................................... 8

植物细胞的悬浮培养技术

摘 要

悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。但该技术目前在国内尚未得到广泛的应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低，生产成本高，劳动强度大的转瓶细胞培养方式。随着现在生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。

关键词

植物细胞；悬浮培养；细胞分裂；细胞学

Plant cell suspension culture technology

Abstract

Because plant cells are gathered together for the characteristic, therefore,

in postmitotic, often cannot be like bacterial cells as separate, but mostly with

cell clusters form, still cannot cultivate is completely single cell suspensions. To single cell culture or selection of cell clones to yarn, need for plate culture, micro chamber training and nursing culture. In this experiment, only the introduction of the most common suspension culture technology

Key words

. Plant cells；Suspension culture；Cell division；Cytology

前言

将游离的植物细胞或小的细胞团置于液体培养其中进行培养和生长的一种技术,称为植物细胞悬浮培养.它是从愈伤组织的液体培养基础上发展起来的一种新的培养技术.50年代起,米尔（Muir）等便对单细胞培养进行了探讨和研究,得到了万寿菊,烟草单细胞和细胞团的悬浮液.1958年斯图尔德等进行了胡萝卜愈伤组织的悬浮培养,并得到了完整的再生植株.

三十多年来,从试管的悬浮培养发展到太空量的发酵罐培养,从不连续培养发展到半连续和连续培养.80年代以来,作为生物技术中的一个组成部分,正在发展成为一门新兴的产业体系.悬浮培养技术为研究植物细胞的生理、生化、遗传和分化的机理提供实验材料,也为利用植物细胞进行次和代谢物的工业生产提供技术基础外,还在育种、快速繁殖、原生质体培养,体细胞杂交以及作为基因转化的受体等方面均得到了广泛地应用.

由于植物细胞具有聚集在一起的特性,因此,在分裂后,往往不能像细菌细胞那样各自分开,而是大多以细胞团的形式存在,至今还不能培养完全是单细胞的悬浮液.要进行单细胞培养或选择细胞无性纱,需要进行平板培养,微室培养和看护培养.

1 细胞悬浮培养的定义

定义1：细胞悬浮培养是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。

应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科）

定义2：在流动的液体培养基中培养非贴壁的悬浮细胞或小细胞团的细胞或组织的培养方法。细胞附着在微运载体上的培养也是一种悬浮培养。

应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）

2 单细胞制备的方法

2.1 机械法

早期用机械法分离叶组织单细胞。Ball,joshi和noggle曾先后用小解剖刀从花生成熟叶片中刮离体细胞，这些离体细胞可直接在液体培养基中培养，很多游离细胞都能成活，并持续的进行分裂。随后，人们用机械法相继从菠菜，大豆等多种植物中分离得到叶肉细胞，并能够分裂和形成愈伤组织。Rossini指出，只有在薄壁组织排列松散，细胞间接触电很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。

2.2 酶解法

酶解法分离单细胞主要是利用果胶酶将细胞中间的中胶层解离，获得分散的细胞。人们最早用果胶酶处理烟草叶片，分离到大量有代谢活性的叶肉细胞，将这种方法用到了18中其他草木之物上也获得成功。由于果胶酶不仅能降解细胞之间的中胶层，而且还能软化细胞壁，因此在用酶解法分离细胞的时候必须对细胞给予渗透压保护，即在酶液中加入一定浓度的渗透压稳定剂。

酶解法一般利用叶片作为分离细胞的材料，但此法不能分离单子叶作物如小麦，玉米等叶肉细胞。

2.3 愈伤组织诱导法

以愈伤组织作为细胞悬浮培养的细胞来源，首先必须诱导出适宜的愈伤组织。用于建立

悬浮系的愈伤组织必须有较好的松散剂，使之在悬浮培养的起始阶段细胞容易打散。同时，愈伤组织还必须具备较强的增殖和再生能力。诱导符合这些要求的愈伤组织，首先必须选择适宜的植物外植体材料。其次，培养基的附加成分对建立疏松易散的愈伤组织具有较大的影响。

由于一般愈伤组织的细胞并不是均匀一致的，直接由外植体诱导的愈伤组织，若不经过继代则很难获得均匀一致的疏松性。只有在继代培养中不断选择那些疏松性好，细胞状态好的细胞不断继代培养，才能获得大量均匀一致，疏松易碎。适合于建立悬浮细胞系的愈伤组织。

由愈伤组织建立悬浮培养细胞系是目前细胞培养多中广泛采用的一种方法。

3 悬浮培养的条件

一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个基本条件：一是悬浮培养物分散性良好，细胞团较小；二是均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同；三是生长迅速。要建立良好悬浮细胞系需注意以下事项：

不同的培养基可以使愈伤组织具有不同的生长速度，结构也可松可紧，利用这些特征可使愈伤组织分散成为单细胞或很小的细胞团。诱导出疏松易碎的愈伤组织对以后建立悬浮细胞系可以起到事半功倍的效果。

一般用颗粒细小，疏松易碎，外观湿润，鲜艳的白色或淡黄色的愈伤组织，比较疏松易碎，经过几次筛选，继代稳定后，可以用于诱导悬浮细胞系。

用于培养愈伤组织的培养基，可以继续用于悬浮培养，这种培养基就称为条件培养基，但遇到悬浮细胞变褐，生长很慢或停止等，就要用心得培养基。

悬浮细胞进行继代与选择的方法有：将培养基摇匀，静止片刻，用吸管吸取培养基中部的培养物（此处细胞团小而均一，胞质浓厚），也可通过过滤收集到小细胞团进行继代培养。

4 细胞初始培养

细胞初始悬浮培养的做法是，把适宜的愈伤组织转移到三角瓶或其他容器里的液体培养基中，将容器置于摇床上震荡培养。震荡培养作用是：1可对细胞团施加一种缓和的压力，使它们分散成小细胞团和单细胞；2震荡可以使细胞和小细胞团早培养基中保持均匀的分布；3液体培养基的运动促进培养基和容器内空气之间的气体交换，避免细胞缺氧而抑制生长。

根据培养基在容器中的运动方式来区分，有4中振荡培养方法：即①旋转培养：培养瓶呈360o的缓慢旋转移动，使细胞培养物保持均匀分布和保证空气供应。②往返振荡培养：机器带动培养瓶在一直线方向往返振荡。③旋转振荡培养：机器带动培养瓶在平行面上作旋转振动。④搅动培养：利用搅拌棒不断转动，使培养基被搅动。

5 细胞悬浮培养的类型

5.1 分批培养

分批培养是指细胞在一定容积的培养中进行培养，目的是建立单细胞培养物。培养初期悬浮细胞处于滞后期，细胞很少分裂；进入对数生长期后，细胞分裂活跃数目迅速增加；经过3~4个细胞世代之后，培养基中某些营养物质已经耗尽，或是有毒代谢产物的积累，增长逐渐缓慢，进入静止期后，增长完全停止 。

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