生化实验

※ 实验一 糖的性质实验

糖的颜色反应

※ 实验一（1）

【实验目的及要求】

1. 掌握莫式（Molisch）试验鉴定糖的原理和方法。 2. 掌握塞式（Seliwanoff）试验鉴定酮糖的原理和方法。 【实验原理】

1．莫式试验：糖经无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与а-萘酚生成紫红色缩合物。

2．塞式试验：酮糖在浓酸的作用下，脱水生成5-羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色反应；有时亦同时产生棕红色沉淀，此沉淀溶于乙醇，成鲜红色溶液。 【实验仪器及用品】

仪器：水浴锅。 器皿：吸管、试管。

实验药品：蔗糖、葡萄糖、淀粉、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、а-萘酚、浓硫酸、95%乙醇、间苯二酚、盐酸、间苯三酚。 【实验试剂】

莫式试剂：а-萘酚5g,溶于95%乙醇并稀释至100ml。现用现配，并贮于棕色试剂瓶中。 塞式试剂：间苯二酚50mg，溶于100ml盐酸（VH2O：VHCl=2:1），现用现配。 【实验内容及步骤】

一、莫式实验

于4支试管中，分别加入1 ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少许纤维素（棉花或滤纸浸在1 ml水中），然后各加莫式试剂2滴，摇匀，将试管倾斜，沿管壁慢慢加入浓硫酸1.5 ml（切勿振摇！），硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫色环出现。

二、塞式试验

于4支试管中，分别加入0.5 ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%果糖溶液，然后各加塞式试剂2.5ml，摇匀，同时置沸水浴内，比较各管颜色及红色出现的先后顺序。 【实验现象观察并记录】

仔细观察实验中的颜色变化，对于塞式试验和杜式试验还需记录下颜色变化的时间。

※ 实验一（2）

【实验目的及要求】

掌握糖的还原反应来鉴定糖的原理和方法。 【实验原理】

费林(Fehling)试剂和本尼迪(Benedict)试剂均为含Cu2+的碱性溶液，能使具有自由醛基或酮基的糖氧化，其本身则被还原成红色或黄色的Cu2O，此法常用作还原糖的定性或定量测定。

【实验仪器及用品】

实验仪器：水浴锅 实验器皿：吸管、试管

实验药品：硫酸酮、氢氧化钠、酒石酸钾钠、柠檬酸钠、无水碳酸钠、淀粉、蔗糖、葡萄糖。 【实验试剂】

1. 费林试剂

试剂A：CuSO4·5H2O 34.5 g,溶于蒸馏水并稀释至500 ml。

试剂B：氢氧化钠125 g，酒石酸钾钠137 g，溶于蒸馏水并稀释至500 ml。 临用时将试剂A与试剂B等体积混合。

2. 本尼迪试剂：柠檬酸钠（Na3C6H3O7·11H2O）及50 g无水碳酸钠，溶于400 ml蒸馏水中。另溶解8.5 g硫酸铜于50 ml热水中。将硫酸铜溶液缓缓加入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅拌，如有沉淀可过滤。此混合液可长期使用。 【实验内容及步骤】

于3支试管中加入费林试剂A和B各1 ml，混匀，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1 ml，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，观察各管的变化。 另取3支试管，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1 ml，然后每支试管加本尼迪试剂2 ml，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，和上面结果比较。

糖的还原作用

※实验一（3） 总糖的测定——蒽酮比色法

【实验目的】

1、 学习蒽酮比色定糖法的原理和方法。 2、 学习721型分光光度计的原理和操作方法。 【实验原理】

总糖是指样品中的还原单糖及在本法测定条件下能水解成还原单糖的蔗糖、麦芽糖和可部分水解为葡萄糖的淀粉。

蒽酮比色法是测定样品中总糖量的一个灵敏、快速、简便的方法。其原理是糖类在较高温度下被硫酸作用脱水生成糠醛或糠醛衍生物后与蒽酮（C14H10O）缩合成蓝色化合物。溶液含糖量在每mL150μg以内，与蒽酮反应生成的颜色深浅与糖量成正比。蒽酮不仅能与单糖也能与双糖、糊精、淀粉等直接起作用，样品不必水解。

721型分光光度计为上海第三分析仪器厂产品。采用自准式光路，单光束方法。其波长范围为360～800nm，用钨丝白炽灯为光源。由灯泡发出的连续辐射光线，经过聚光透镜会聚后，再经过平面镜转90角。光线反射后，经入射狭缝而入射到单色器内。狭缝正好位于球面准直物镜的焦面上。当入射光线经过准直物镜反射后，就以一束平行光射向棱镜，并在其中色散。入射角在最小偏向角，入射光在铝面上依原路反射回来，再经过准直物镜反射，而会聚在出光狭缝上。由狭缝出来的光通过被测的溶液，再射到GD-7型光电管上。GD-7型光电管的锑、铯、钾、钠阴极面对整个可见光区都较敏感（光谱灵敏范围为350～850nm）。光电管受光后所产生的光电流，经过一组高值电阻（50M、500M、1KMΩ），在电阻两端形成一个电压降，通过电压降的测定来间接地测量光电流的变化。

【器材】

1、试管（或具塞试管）及试管架 2、吸量管（1mL、10mL） 3、沸水浴 4、冰浴 5、721型分光光度计 【试剂和材料】

1、蒽酮试剂（1000mL）:称取100mg蒽酮溶于100mL98%硫酸溶液（A.R）中，用时配制。 2、葡萄糖标准溶液（100μg/mL） ：精确称取100mg干燥葡萄糖，用蒸馏水定溶至1000mL。 3、样品溶液：可自选待测物制成样品溶液。

举例：称取500g市售白薯，洗净切碎后用多功能食品加工机磨成浆，4层沙布压虑，去滤液留渣，将渣放入烘箱内80～85C烘干后，再用植物粉碎机（微型）研细，过筛，取

0

0

100目筛下物为待测样品。取样品在烘箱内105C烘干，恒重后，精确称取1～5g，置于锥形瓶中，加入80mL沸蒸馏水，放入沸水浴。不时摇动，提取半小时。取出立即过滤，残渣用沸蒸馏水反复洗涤并过滤，合并滤液。冷却至室温，用蒸馏水定溶至100mL。

【实验操作】

1、制作标准曲线 取7支干燥洁净的试管，编号后按下表操作。

试剂（mL） 编号 葡萄糖标准溶液（100μg/mL） H2O 蒽酮试剂 1 0 2 3 4 5 6 7 0

0.10 0.20 0.30 0.40 0.60 0.80 1.0 0.90 0.80 0.70 0.60 0.40 0.20 10 10 10 10 10 10 10 每管加入葡萄糖标准溶液和水后立即混匀 ，迅速置于冰浴中，待各管都加入蒽酮试剂后，同时至于沸水浴中，准确加热7分钟，立即取出置冰浴中迅速冷却。待各管溶液达室温后，用1cm厚度的比色皿，以第一管为空白，迅速测其余各管的光吸收值。然后以第2管～7管溶液含糖量μg数为横坐标，吸光度（A620nm ）为纵坐标，画出含糖量与A620nm值的相关标准曲线。

2、测定样品的含糖量 取4支试管编号，按下表操作。

试剂（mL） 编号 样品溶液 H2O 蒽酮试剂 1 0 1.0 10.0 2 1.0 0 10.0 3 1.0 0 10.0 4 1.0 0 10.o 其它操作与制作标准曲线相同。将2～4管测出的A620nm平均值，根据A620nm平均值从标准曲线上查出相应的含糖μg数，在换算成100g样品中总糖含量。

【注意事项 】

1、所配制的样品溶液必需透明，样品中如有蛋白质，对实验有影响，须设法除去。 2、在操作中必须严格控制反应过程的温度和加热时间。

3、在使用浓硫酸时一定要格外小心，防止硫酸溅到身上而损坏衣服。

总糖=样品重量 样品水解后还原糖mg数×样品稀释倍数×100

※实验二 纸层析法分离鉴定氨基酸

【实验目的】

1、学习分配层析的原理；

2、掌握氨基酸纸上层析的操作技术。

【实验原理】

层析法也叫色谱法，是一种物理分离方法，它是利用混合物中各组分的物理、化学性质的差异，使各组分以不同的程度分布在两个相中，其中一个相为固定相，另一个相则流过此固定相（称流动相）并使各组分以不同的速度移动从而达到分离。

层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一，运用这种方法可以分离性质极为相似而用一般化学方法难以分离的各种化合物。如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。

层析法有许多种类，根据分离所依据的理化性质不同，可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析等。

纸层析是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗生素等物质的一中分离分析工具。纸层析属于分配层析法。分配层析法是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数的不同而得到分离。纸层析以滤纸作为惰性支持物，滤纸纤维素上的羟基具有亲水性，能吸附一层水，把吸附在滤纸上的水作为固定相，展层用的有机溶剂为流动相。层析时，将样品在距离滤纸2~3cm的某一处（原点），在密闭的容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向反复抽提，由于混合氨基酸在两相中的分配系数（当把一种物质在两种不相溶的溶剂中振荡时，它将在这两相中不均匀分配。达到平衡时，这种物质在两种溶剂中的浓度之比为一个常数，即所谓的分配常数）不同，使不同的氨基酸分布在滤纸的不同位置上而得到分离。

物质被分离后，层析点在图谱上的位置，即在纸上移动的速率用Rf表示。 Rf = 原点到层析点中心的距离（X）÷ 原点到溶剂前沿的距离（Y）。

在一定条件下某种物质的Rf值是一个常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度有关。

【器材与试剂】

1、器材：

层析缸、点样毛细管、小烧杯、培养皿、量筒、喷雾器、吹风机（或烘箱）层析滤纸（新华1号），直尺、铅笔、针线、一次性手套。

2、试剂：

（1）扩展剂（水饱和的正丁醇和乙酸的混合物。其中水为固定相，正丁醇为流动相 ，乙酸为层析提供酸性环境。）

具体配制方法：将20mL正丁醇和5mL乙酸（4：1）放入分液漏斗中，与15mL蒸馏水混合（即所得混合液再按体积比5：3与蒸馏水混合）,充分振荡，静止后分层，放出下层水层，取漏斗内的扩展剂约5mL置于小烧杯中做平衡剂，其余的倒入培养皿中备用。

（2）氨基酸溶液：0.5%的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液（各组分的浓度均为0.5%）。

（3）显色剂：0.1%水合印三酮正丁醇溶液。

【操作方法】

1、制备扩展剂并将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。 2、准备滤纸

取层析滤纸（长22cm，宽14cm）一张，在纸的一端距边缘2~3cm处用铅笔划一条直线，在直线上每间隔2cm作一记号，为点样位置。

3、点样：

用毛细管将各氨基酸样品分别点在点样处，干后再点一次。点样量以30~40μL为宜，点样时，用毛细管吸取氨基酸样品，与滤纸垂直方向轻轻碰点样处，每点在纸上扩散的直径不超过3mm。

4、扩展：用线将点好样品的滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触（避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动过快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值）。将盛有约20mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端朝下，扩展剂的液面需低于点样线1cm），待溶剂上升15~20cm时取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，用吹风机吹干（注意温度不宜过高，以免损坏氨基酸）。

5、定性鉴定：

用0.1%水合印三酮正丁醇溶液在纸的一面均匀喷雾，然后置烘箱中烘烤5分钟（100oC）即可显示出各层析斑点。用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，用一直尺测量每一显色斑点中心与原点的距离和原点到溶剂前沿的距离，求其比值，即得各种氨基酸的Rf值。

在层析图谱上，对比标准氨基酸的位置（Rf值）而确定氨基酸混合样品中氨基酸的种类位置

6、计算各种氨基酸的Rf值。

【注意事项】1、取滤纸之前

亮氨酸 要将手洗干净，防止手上的汗渍污

苯丙氨酸 缬氨酸 染滤纸，并尽可能少接触滤纸；在条件允许的情况下也可戴一次性手套拿滤纸。要将滤纸平放在干净的白纸上，千万不要放在实验台

脯氨酸 赖氨酸 上，以防止污染。

2、点样点的直径不能超过

0.5cm，否则分离效果不好，并且样品用量过大，会造成“托尾巴”现象。

【思考题】

1、纸层析法的原理是什么？

2、何谓Rf值？影响Rf值的主要因素是什么？ 3、怎样制备扩展剂？

4、层析缸中平衡剂的作用是什么？ 5、氨基酸极性与Rf值的关系？

附：影响Rf值的因素

1、物质结构的影响：极性物质易溶于极性溶剂（水）中，非极性物质易溶于非极性溶

剂（有机溶剂）中，所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。例如酸性和碱性氨基酸的极性大于中性氨基酸，所以前者在水（固定相）中分配较多，因此Rf值低于后者。氨基酸的极性愈大，Rf值愈小。

—CH2—基是疏水性基团，如果分子中极性基数不变，则—CH2—基增加，整个分子的极性降低，因此易溶于有机溶剂（流动相）中，Rf值也随之增加。例如氨基酸的Rf值 ：甘氨酸〈 丙氨酸 〈 亮氨酸 ；二羧基氨基酸中，天门冬氨酸〈 谷氨酸。

极性基团的位置不同也会引起Rf值变化。

2、溶剂的影响：同一种物质在不同溶剂中Rf值不同，选择溶剂系统时应该使被分离物质在适当Rf值范围内（0.05-0.85之间），并且不同物质的Rf值至少差别为0.05才能彼此分开。

溶剂的极性大小也影响物质的Rf值，在用与水互溶的脂肪醇作为溶剂时，氨基酸的Rf值随着溶剂碳原子数目的增加而降低。

3、pH的影响：溶剂系统地pH会影响物质极性基团的解离形式。对于酸性氨基酸则在酸性时所带净电荷比碱性时少。带电荷愈少亲水性愈小，因此在酸性溶剂中Rf值较碱性大。而碱性氨基酸则与此相反。借此性质用酸相和碱相溶剂进行双向层析，可使酸碱性不同的氨基酸达到分离的目的。

溶剂的pH还可以影响有机溶剂的含水量，溶剂酸碱度大，则含水量高。对于极性物质来说Rf值增加，非极性物质则减少。若pH值不适合，使同种物质有不同解离形式，其Rf值也略有不同，则此物质层析呈带状图谱。因此溶剂中的酸或碱的含量必须足够，并且层析缸中用酸或碱气体饱和才可以防止上述现象，使物质得到圆点状图谱。

4、滤纸的影响：层析滤纸必须质地均匀、紧密、有一定机械强度，并且杂质较少，如纸中有Ca、Mg、Cu等金属离子杂质，可与氨基酸形成络合物使层析图谱出现阴影，可用稀酸洗涤滤纸除去之。

5、温度和时间的影响：温度不仅影响物质在溶剂中的分配系数，而且影响溶剂相的组成及纤维素的水合作用。温度变化对Rf值影响很大，所以层析时最好在恒温室中进行，控制温度相差不超过±0.5C。当所有条件相同时，氨基酸层析时间短，Rf值则小。

除上述影响因素外，样品中含有盐份和其它杂质以及点样过多均会影响样品的有效分离。

o

2+

2+

2+

※实验三

【实验目的】

血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳

熟悉醋纤薄膜电泳方法及其在分离血清蛋白中的应用，了解电泳技术的一般原理。

【实验原理】

蛋白质是兼性离子。由于组成蛋白质分子的氨基酸种类和数目不同，各种血清蛋白质的分子量和等电点也不相同。在同一条件下(电场强度、电渗、温度、缓冲液pH和离子强度等)，它们电泳速度各不相同，因而可以分离。本实验以醋酸纤维薄膜为支持物，利用血清中蛋白质颗粒的等电点大部分低于7，在缓冲液pH8.6中带负电荷，在电场中向正极移动，电泳后根据血清蛋白移动快慢，可依次分为清蛋白、球蛋白的α1、α2、β、γ五个区带，染色后显出清晰色带。由于各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比，可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中，用分光光度法计算各种蛋白质的百分数，也可以将染色后的膜条直接用光密度计测定。

图1 正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图

1为清蛋白，2，3，4，5分别α1-，α2-，β-及γ-球蛋白，6为点样原点

醋酸纤维薄膜电泳（cellulose acetate membrane electrophoresis）具有微量、快速、简便及分辨率较高等优点，广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、同工酶的分离和测定。

醋酸纤维薄膜与滤纸相比较，有以下优点：

（1）醋酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了定量测量的精确性。

（2）快速省时。由于醋酸纤维素薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中所容纳的缓冲溶液也较少，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳45——60min即可，加上染色、脱色，整个电泳完成仅需90min左右。

（3）灵敏度高，样品用量少。血清蛋白电泳仅需2μL血清，甚至加样体积少至0.1μL，仅含5μg蛋白样品也可得到清晰的分离区带。临床医学检验利用这一特点，检测在病理情况下微量异常蛋白的改变。

（4）应用面广。某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素、组蛋白的等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离。

（5）醋酸纤维薄膜电泳染色后，经冰乙酸、乙醇混合液或其他溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。

【试剂】

1、巴比妥缓冲液(pH8.6，离子强度0.075)

称取巴比妥钠15.45g，巴比妥2.76g，用蒸馏水配成1000ml。 2、染色液

氨基黑10B0.25g，甲醇50ml，冰醋酸10ml，蒸馏水40ml混合配制（可重复使用）。 3、漂洗液：

95％乙醇45份，冰醋酸5份，蒸馏水50份。 4、0.4moL/LNaOH洗脱液： 取4克NaOH加蒸馏水至250ml。 5、透明液

冰醋酸25-30ml加95％乙醇70-75ml。

6、新鲜无溶血血清。 【器材】

电泳仪(包括整流器与电泳槽)与分光光度计或光密度计、染色缸、醋酸纤维薄膜（2×

8cm）、点样器、10ml吸管、大试管等、培养皿、滤纸、镊子、直尺、铅笔、剪刀等。

【操作】

1、准备：用镊子取2×8cm醋酸纤维薄膜1张（识别出光泽面与无光泽面，并在角上用笔作上记号），在膜的粗面一端1.5cm处用铅笔轻划一横线，表示点样位置，将膜浸入巴比妥缓冲液中充分浸透（约20分钟），取出，夹在两层粗滤纸内吸去水分，，然后平铺在玻璃板上，膜的粗面朝上。另在电泳槽两边盛入巴比妥缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，取两层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。作为滤纸桥。

2、点样：用1.5cm宽的玻片末端或点样器蘸上一层血清，紧印在膜粗面点样线上使血清全部渗入膜内。

图2 醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图

虚线处为点样位置

3、电泳：将膜点样面向下，两端拉紧贴于电泳槽架的滤纸桥上，点样端在阴极，盖上槽盖，静置平衡5-10分钟后通电。电压先90v，10分钟；120 v ，50分钟(约10v／cm／长)电流0.4-0.6mA／cm宽，约45-60分钟关闭电源。若连续数次电泳，每次正负电极应转换。

图3 电泳装置剖视示意图

1.滤纸桥 2.电泳槽 3.醋酸纤维素薄膜 4.电泳槽膜支架

5.电极室中央隔板

人血清蛋白质的等电点及迁移率

蛋白质名称 清蛋白 α1-球蛋白 α2-球蛋白 β-球蛋白 γ-球蛋白

等电点 4.88 5.06 5.06 5.12 6.85-7.50

4、染色与漂洗：电泳完毕，取出膜条，直接浸入氨基黑10B染色液中，染色3-5分钟取出薄膜，立即浸入漂洗液中，时时漂盈，漂洗3-4次至背景无色为止，用蒸馏水冲洗后放室温凉干或放100℃以下干燥箱烘干。

【实验说明】

1、醋纤薄膜电泳血清蛋白正常值：清蛋白(A)：55-74％，α1球蛋白2-5％，α2球蛋白4-9％，β球蛋白6.5一12％，γ球蛋白12-20％，肝硬化时清蛋白显著降低，γ球蛋白升高2-3倍，肾病综合征时清蛋白质降低，α2、β球蛋白升高。

2、1957年Kohn首先用醋酸纤维薄膜电泳后，因其有微量快速、操作简便，分离清晰、电渗小无拖尾等优点，可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、血红蛋白、结合球蛋白及同功酶的分离和测定，应用日渐广泛。但在实际应用过程中，因影响因素较多：电压电流、电泳时间、血清加量、醋纤膜质量、染料质量和浓度、染色时间和染料应用的次数，漂洗的次数及每次间隔的时间、缓冲液的离子强度、透明液的醋酸浓度等都可影响醋纤膜电泳分析的结果。所以要完成好的电泳图谱有一定的难度。因此在实验中要注意解决以下几个问题： （1） 电泳图谱不齐或分离不良

泳动脉/(cm·V·S)

-5.9×10 -5.1×10 -4.1×10 -2.8×10

-5

-1.0×10

-5-5-5-5

2-1-1

分子量 69000 200000 300000 9000-150000 156000-300000

这是电泳分析中最常见的问题，多数是由于血清滴加不均匀或滴加过多，也有因薄膜质量不合要求所致。点样这一步非常关键，一定要按操作步骤进行。首先选择质匀、孔细、染料吸附少的薄膜充分浸透缓冲液至湿度均匀无干白点。然后将滤纸吸去薄膜表面的多余水份，使薄膜含水量饱和均匀，这样才能防止薄膜表面液体含量不均，水份移动而引起标本移位。点样前注意关闭门窗和风扇，因空气流通快可使标本和水份蒸发而影响电泳图形。点样要力求做到均匀迅速，在实践中把点样器干沾血清，改为沾取标本前先浸入蒸馏水中沾湿用吸水纸吸干后再沾血清，这样点样器内均匀沾取血清的效果较干沾为佳。 （2）电泳图谱出现条痕

问题是由于点样后薄膜过干，或因电泳槽密闭性不良，或电流过大，温度升高，薄膜水份蒸发干燥而造成的。因此薄膜一定要充分浸透后才能点样，并注意检查电泳槽是否盖紧，电泳槽要放在远离光源热源的阴凉之处。在电泳过程中随时观察电压电流的变化，因通电后产生一定的热量，电流会有所增加。控制电压100～110V，电流0.5～0.6mA/cm，电泳时间一般冬长夏短，以区带展开3.5～4cm即可(另加一条溴酚蓝预染血清，同样操作，指示区带展开的距离)。

（3） 区带拖尾或区带过于紧密

缓冲液的离子强度低于0.05即出现区带拖尾现象，离子强度>0.075则区带过于紧密。此时需要检查更换缓冲液。常规操作一般使用连续电泳巴比妥盐缓冲液pH8.6，离子强度0.06。电泳槽中缓冲液经10次使用后，不应简单地采取交换电极的方法，而是将缓冲液取出重新混合过滤后，再进行使用，一般用4个周期后需更换新液。离子强度愈低，区带展开愈长，电泳速度愈快。电泳区带展开的距离也跟薄膜数量有关。在教学实验中，经常发现薄膜愈少，展开的距离愈短，区带愈清晰的现象。在仪器输出电压相同的情况下，薄膜愈少，加在薄膜两端的电压愈高，电压高会使展开的长度缩短。只要薄膜数量在5条以上，即可使图谱展开长度有较好的重现性。

（4）区带一边长一边短呈现扭曲现象

这是薄膜两边电阻不一样，电阻大的一边电流小，速度慢，区带展开短。造成这种现象的原因是薄膜未紧压在电泳槽的滤纸桥上，使薄膜接触不良而增大了电阻。在操作过程中，一定要注意使薄膜两端紧压在滤纸桥上。

（5） γ球蛋白区带倒退

这是电渗作用引起的。可升高点样端的缓冲液面高度或适当加大电流量克服之。 （6）染色后白蛋白中间色浅

有些同学在实验中往往急于求成，染色时间未到便匆忙取出薄膜漂洗，结果造成了白蛋白区带中间色浅的现象。造成这种现象的另一个原因是白蛋白含量过高。可增加染色时间或减少点样量解决之。

（7）染色后区带清晰度不良

陈旧标本可使区带分离清晰度大为降低。应尽量当日标本当日做，最多不超过2天。另外标本不可溶血，因溶血标本中血红蛋白与β球蛋白的电泳区带相重迭。可造成β球蛋白含量升高而蛋白质含量相对减少的结果。

（8） 白蛋白区带染色不均并有空泡

这是染色液陈旧所致，染色液存放和使用过久，会降低蛋白质结合染料的能力。发现正在使用的染液已陈旧时，应立即全部弃去，更换新液。

（9） 透明时膜发白不能完全透明

薄膜未干或透明液中醋酸含量不足可造成膜发白而不能达到透明的目的，应将薄膜晾干，适当增加透明液的醋酸浓度。

（10） 透明时膜溶解

室内温度过高或透明液醋酸浓度过高均可使膜溶解。可采用适当降低透明液醋酸浓度的办法来解决。

3、醋酸纤维薄膜电泳，点样为什么在粗糙面？

醋酸纤维素薄膜本身就像包装药片的铝塑纸一样，它是由一层薄薄的聚乙烯和压附在其上的醋酸纤维素酯构成的。光滑一面是聚乙烯一面，唯有粗糙面是醋酸纤维素酯的一侧。所以自然要点在粗糙面上了。

4、注意电泳时，点样面朝下，点样端在负极。

※实验四 甲醛滴定法测定氨基酸

【实验目的】

初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作方法。

【实验原理】

氨基酸虽然是一种两性电解质，既是酸又是碱，但是它却不能直接用酸、碱滴定来进行定量测定。这是因为氨基酸的酸、碱滴定的等电点pH或过高（12~13）或过低（1~2），没有适当的指示剂可被选用。然而向氨基酸中加入过量的中性甲醛，用标准氢氧化钠滴定时，由于甲醛与氨基酸中的氨基作用形成羟甲基衍生物而降低了氨基的碱性，相对的增加了—NH3+的酸性解离，游离出氢离子，用NaOH滴定，从消耗的碱量可以计算出氨基酸的含量。此法称为间接滴定法。

反应式：

氨基酸的甲醛滴定是测定

R—CH—COO-←―→R—CH—COO-+H+—→中和

+

∣ ∣ OH NH3+ NH2 ↑

→HCHO

- R-CH-COO ∣ 羟甲基氨基酸 NHCH2OH →HCHO

- R-CH-COO

∣二羟甲基氨基酸

N(HCH2OH)2

氨基酸的一种常用方法。当氨基酸溶液中存在1mol/L甲醛时，滴定终点由pH12左右移至9附近，也即酚酞指示剂的变色区域内（PH9.0左右）。。如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基酸的含量。如蛋白质是多种氨基酸的混合物，如蛋白质的水解液，则滴定结果不能作为氨基酸的

定量依据。但蛋白质在水解时，释放出游离的氨基，蛋白质合成时游离氨基减少，所以根据测定游离氨基的含量可来判断蛋白质水解或合成的程度。脯氨酸与甲醛作用生成不稳定的化合物，使滴定毫升数偏低。而酪氨酸的滴定毫升数结果偏高。

【器材与试剂】

1、器材：25mL锥形瓶、3mL微量滴定管 、吸管。

2、试剂：（1）0.1mol/L标准甘氨酸溶液（准确称取750mg甘氨酸，溶解后丁容至100mL）；

（2）0.1mol/L标准氢氧化钠溶液；（3）酚酞指示剂（0.5%酚酞的50%乙醇溶液）； （4）中性甲醛溶液：在50mL36~37%分析纯甲醛溶液中加入1mL0.1%酚酞乙醇水溶液，用0.1mol/L标准氢氧化钠溶液滴定至微红，贮于密闭的玻璃瓶中。

此试剂在临用前配制。如已放置一段时间，则使用前需重新中和。

【操作方法】

1、取3个25mL涮洗干净并干燥的锥形瓶，编号。向第1、2号锥形瓶内各加入2mL0.1mol/L标准甘氨酸溶液和5mL水，混匀。向第3号锥形瓶内加入7mL水。然后向3个锥形瓶中各加入5滴酚酞指示剂 ，混匀后各加2mL甲醛溶液，再混匀，分别用0.1mol/L标准氢氧化钠溶液滴定至溶液呈微红色。记录各自消耗的0.1mol/L标准氢氧化钠溶液的mL数。按照上述的实验操作再做一次滴定并做好记录。

取滴定中各锥形瓶消耗的0.1mol/L标准氢氧化钠溶液mL数的平均值，计算甘氨酸氨基氮的回收率。

实际测得量 甘氨酸氨基氮的回收率% = × 100 加入理论量 实际测得量为滴定第1和2号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液mL数的平均值与3号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液mL数之差乘以标准氢氧化钠的摩尔浓度，再乘以14.008 2mL乘以标准甘氨酸的摩尔浓度再乘以14.008，即为加入理论量的mg数。14.008为1ml 0.1mol/L 标准NaOH溶液相当的氮量（mg）。

2、取未知浓度的甘氨酸溶液2mL，以上述方法进行测定，平行做2份，取平均值。计算每mL甘氨酸溶液中含有甘氨酸的mg数。 （ V未 － V对）×mol/LNaOH ×14.008 氨基酸（mg/mL）= 2 式中： V 未 为滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均mL数。V对为滴定对照液（3 号瓶）耗用标准氢氧化钠溶液的平均mL数。mol/LNaOH为标准氢氧化钠溶液的真实摩尔浓度。 【注意事项】1、标准氢氧化钠溶液应在临用前标定，并在密闭瓶中保存。不可使用隔日贮存在微量滴定管中的剩余氢氧化钠溶液。 2、本实验为定量实验，甘氨酸和氢氧化钠的浓度要严格标定，加量要准确，全部操作要按分析化学的要求进行。 【思考题】运用酚酞指示剂，为什么滴定的是氨基？

※实验五 酪蛋白的制备

【实验目的】

学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。

【实验原理】

牛乳中的主要蛋白质是酪蛋白，含量约为35克/升。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白沉淀吸出。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白（酪蛋白不溶于乙醇）。

【实验器材与试剂】

器材：离心机，抽虑装置，精密pH试纸或酸度计，电炉，烧杯 ，温度计，分析天平。 材料与试剂：牛奶，95%乙醇，无水乙醚，0.2mol/LpH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液（配制方法：先配置液A液（0.2mol/L醋酸钠溶液）和B液（0.2mol/Lp醋酸溶液）。称取NaAc.3H2O54.44克，定容到2000mL即得A液，称取优级纯醋酸（含量大于99.8%）12.0克定容至1000mL即得B液。取A液1770mL,B液1230mL混合即得pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液3000mL，乙醇-乙醚混合液（乙醇：乙醚=1：1（V/V）。

【操作方法】 1、 酪蛋白粗品的制备

将100mL牛奶放到500mL的烧杯中，加热到40C，在搅拌下缓慢加入100mL加热到40C 左右的醋酸缓冲液，直至PH到4.7为止，用酸度计调节。将上述悬浮液冷却至室温，离心15分钟（3000转/分）。弃去上清液，得酪蛋白的粗制品。 2、酪蛋白纯品的制备

（1）用水洗涤沉淀三次，离心10分钟（3000转/分），弃去上清夜。其中前两次采用倾倒法清洗，第三次将蒸馏水分别倒入装有酪蛋白粗品的离心管内至刻度或等高，然后用细玻璃棒搅拌，离心10分钟，弃上清夜。

（2）用30mL的乙醇将各离心管内的沉淀搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽虑，除去乙醇溶液再倒入乙醇-乙醚混合液30mL洗涤沉淀两次，抽干后，再倒入乙醚30mL洗涤沉淀两次，抽干，将沉淀从布氏漏斗中移出，摊开在表面皿上风干；得到的便是酪蛋白的纯品。

3、称重，计算含量和得率。

O

O

含量：酪蛋白克/100mL牛乳 （克/%）

得率：测得含量/理论含量×100% 式中理论含量为3.5克/100mL。 【思考题】

1、为什么酪蛋白可在等电点时沉淀析出？ 2、蛋白质为什么可以用有机溶剂沉淀？

3、根据酪蛋白的制备方法，请设计一种从血液中提取血红蛋白的方法。 [附] 一、蛋白质分离提纯的一般原则

蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在的，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。把种类如此繁多的蛋白质从组织、细胞中分离出来是一项艰巨的任务。到目前为止还没有一套现成的或一个单独的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序已获得较高纯度的制品，为了使某一特定的蛋白质得到分离提纯，应遵循以下原则：

（一）、前处理：分离提纯某一蛋白质，首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。因此应根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。

1、细胞的破碎 （1）机械法

①组织捣碎法：一般是用高速组织捣碎器，它是一种较激烈的破碎器，虽只允许间断操作（每次几秒 – 30秒左右），但仍会使温度迅速升高，因此要注意保持试剂冷却。这种破碎方法对动植物组织有效。但当破碎酵母及细菌的细胞壁时，应在浓稠的悬浮液中加入适量小玻璃珠以利破壁。

②研磨法：通常使用的是手动或马达驱动的玻璃匀浆器和振动玻璃珠研磨机。有时也用研钵破碎细胞以制备一些细胞器（如线粒体、溶酶体、微粒体等）。对一些难破碎的细胞或微生物菌体，则可加一些研磨剂（如玻璃粉、石英砂、氧化铝、硅胶等）效果更佳。

“细菌磨”则可专用于微生物细胞的破碎，在实验室内使用简单，方便。 （2）物理法

①超声波破碎法：输入高能超声波可以破碎细胞，其机理可能与强声波作用溶液时，气泡产生、长大和破碎的空化现象有关。空化现象引起的冲击波和剪切力使细胞裂解。

用超声波破碎细胞时，样品浓度有一定限制，其蛋白质含量应低于30mg/mL。连续超声时间长，则样品温度升高，因此通常超声及间隔时间和总的超声次数取决于：在保持样品低

温的前提下，尽可能彻底的将细胞破碎。

②渗透压法 先将细胞置于高渗溶液（如蔗糖溶液获2%氯化钠溶液）中平衡一段时间后，突然将其转入到水溶液或缓冲液中，则细胞壁会因渗透压的突变而破碎，此法适用于处理细胞壁比较脆弱的细胞。

③冷冻干燥法 适于制定不稳定的酶。一般配成10% - 40%细胞悬浮液进行冷冻干燥。经冻干后细胞的渗透性大大变化。

（3） 化学方法

①溶剂处理：丙酮、氯仿、甲苯等脂溶性溶剂，可溶解细胞膜上的脂质化合物，从而使细胞壁结构破坏，一般将细胞制成丙酮干粉后再加提取液，提取细胞内容物。

②表面活性剂处理法：在适当的温度、pH及低离子强度下，表面活性剂能与脂但百姓称微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。此法对膜结合蛋白质的提取有效。但对其它蛋白质易使其变性，甚至切断肽键。

（4）酶解法

组织或细胞破碎后，选择适当的介质（一般用缓冲液）把所要的蛋白质提取出来。 （二）粗分级

当蛋白质混合物提取液获得后，选用一套适用的方法，将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。其常用的分级方法：盐析、等电点、沉淀和有机溶剂分级分离等。这些方法的特点简便，处理量大，既能清除大量杂质，又能浓缩蛋白质溶液。

（三）细分级 （样品的进一步提纯）

样品经粗分级之后，一般体积较小、杂蛋白大部分已被清除，进一步提纯一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层系、吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后的提纯步骤。用于细提纯的方法一般规模较小，但分辨率高。

（四）结晶

为蛋白质分离提纯的最后步骤。某种蛋白质的数量只有在溶液中占优势时才能形成结晶，而且结晶中从未发现变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是判断制品处于天然状态的有力指标。

※ 实验六

【实验目的】

植物DNA的提取

随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。 【实验目的】

细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。

关于植物总DNA 的提取主要有两种方法： 1． CTAB 法：

CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是 一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。 2． SDS 法：

利用高浓度的阴离子去垢剂 SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）使DNA 与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉 淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物体的基因组DNA 为107~109bp，在基因克隆工作中，通常要求制备的大分子DNA 的分子量为克隆片段长度的4 倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，

导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA 的方法必须考虑两个原则：（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质（如多酚、类黄酮等）、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNase 对DNA 的降解。（2）尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切破坏。

几乎所有的DNase 都需要Mg2+或Mn2+为辅因子，故实现（1）尽量去除蛋白质的要求，需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在较低温度下进 行（一般利用液氮或冰浴）。为实现（2）需要在DNA 处于溶解状态时，尽量减弱溶液的涡旋，而且动作要轻柔，在进行DNA 溶液转移时用大口（或剪口）吸管。提取的DNA 是否为纯净、双链、高分子的化合物，一般要通过紫外吸收、化学测定、“熔点”（melting temperature, Tm）测定、电镜观察及电泳分离等方法鉴定。本实验采用CTAB 法提取DNA 并通过紫外吸收法鉴定。

【实验材料、仪器与试剂】 1．实验材料

新鲜菠菜幼嫩组织、花椰菜花冠或小麦黄化苗等 2．主要仪器

（1）高速冷冻离心机 （2）751 型分光光度计 （3）恒温水浴 （3）冰浴设备 （4）磨口锥形瓶 （5）核酸电泳设备 3．试剂（CTAB 法）

（1）CTAB 提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl （pH8.0），20 mmol/L EDTA-Na2，1.4mol/LNaCl（如表1），2% CTAB，使用前加入0.1%（V/V）的β-巯基乙醇。用HCl 调pH 值。

表1 CTAB提取缓冲液配制

1%淀粉（0.3%氯化钠的） 2%蔗糖溶液 蒸馏水 Benedict试剂 记录观察结果 — — 3 2 3 — — 2 — 3 — 2 沸水浴煮沸2～3分钟 取三支试管，按下表操作：

注意：纯净的淀粉和蔗糖遇Benedict试剂不呈阳性反应。 （3）淀粉酶的专一性： 取6支试管，按下表操作：

管号 1%淀粉溶液（滴） 2%蔗糖溶液（滴） 稀释唾液（mL） 煮沸过的稀释唾液（mL） 蒸馏水（mL） 1 4 — — — 1 o2 — 4 — — 1 3 4 — 1 — — 4 — 4 1 — — 5 4 — — 1 — 6 — 4 — 1 — 37C恒温水浴15分钟 Benedict试剂（mL） 1 1 1 1 1 1 沸水浴煮沸2～3分钟 实验现象 实验总结： 淀粉酶的专一性

管 号 1 2 3 4 现 象 解释结果

5 6 二、 影响酶促反应的因素

（一）、温度对酶活力的影响

【实验目的】

了解温度对酶活力的影响素。 【实验原理】

温度对酶的活性有很大的影响。酶促反应开始时，反应速度随着温度的升高而加快，达到最大反应速度时的温度称为某种酶的最适温度。由于绝大多数酶是有活性的蛋白质，当达到最适温度后继续升高温度，可引起蛋白质变性，酶促反应速度下降，以致完全停止。低温能降低酶或抑制酶的活性，但不能使酶失活。酶的最适温度不是一个常数，它与作用时间长短有关。测定酶活性均在最适温度下进行。大多数动物酶的最适温度在37～40C范围，植物酶的最适温度在50～60C范围。

【实验器材】

(1) 试管与试管架 （2）恒温水浴 （3）冰浴 （4）沸水浴 （5）移液管（1、2mL）（6）烧杯（500、1000mL） （7）锥形瓶（100mL） （8）玻璃漏斗 （9）滤纸等。 【试剂与材料】

（1）0.2%淀粉的0.3%NaCL溶液（0.2g淀粉溶于100mL0.3%NaCL溶液中煮沸2～3分钟）。 （2）稀释200倍的新鲜唾液。

（3）碘化钾—碘溶液（将碘化钾20g溶于100mL水中，使用前稀释10倍）。 【实验操作】

淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子大小，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色。最简单的糊精遇碘不呈颜色，麦芽糖遇碘也不呈颜色。在不同的温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。

取3支试管，编号，按下表操作：

管号 0.2%淀粉的0.3%氯化钠溶液（mL） 稀释唾液（mL） 1 1.5 1 2 1.5 1 3 1.5 o

o

煮沸过的稀释唾液（mL） o 1 摇匀后，将1号、3号两试管放入37C恒温水浴中，2号试管放入冰浴中，10分钟后取出，（将2号试管内的液体分成两半）用碘化钾—碘溶液来检验，2号试管的另一半继续在37C恒温水浴中保温10分钟后，用碘化钾—碘溶液来检验。 碘化钾—碘溶液（滴） 记录观察结果 1 1 1 o（二）、pH对酶的活力的影响

【实验目的】 了解pH对酶的活力的影响 【实验原理】

酶活力受环境pH的影响，在一定pH下，酶表现最大活力，高于或低于此pH，酶活力降低，通常把表现出酶最大活力的pH称为该酶的最适pH。pH影响酶活力的主要原因有以下几个方面，首先，pH影响酶分子活性部位上有关基团的解离，另外，也影响底物的解离状态，从而影响酶活性中心与底物的结合或催化。其次，有关基团解离状态的改变影响酶的空间构象，甚至会使酶变性。尽管有一些酶能忍受较大的pH的变化，但大多数酶保持活性的pH值范围很窄。正因如此，生物体使用缓冲液调节体内的适宜pH值。本实验观察pH对唾液淀粉酶活性的影响，唾液淀粉酶最适pH为6.8。

【实验器材】 试管及试管架；滴管；恒温水浴锅；温度计；移液管 ；50mL的锥形瓶 【实验试剂】

（1） 新配置的溶于0.3%氯化钠溶液的0.5%淀粉 （2） 稀释200倍的新鲜唾液 （3）0.2mol/L磷酸氢二钠溶液 （4） 0.1mol/L 柠檬酸溶液 （5）碘化钾—碘溶液 （6）pH试纸 【实验操作】

（1）取4个标有号码的50mL锥形瓶, 按下表加入试剂：

锥形瓶号 1 2 3 4 0.2mol/L磷酸氢二钠（mL） 5.15 6.05 7.72 9.72 0.1mol/L 柠檬酸溶液（mL） 4.85 3.95 2.28 0.28 pH 5.0 5.8 6.8 8.0 （2）取4支试管编号，按下表加入试剂

试管号 各锥形瓶内的缓冲液（mL） 1号锥形瓶缓冲液3 2号锥形瓶缓冲液3 3号锥形瓶缓冲液3 4号锥形瓶缓冲液3 0.5%淀粉（mL） 稀释200倍的新鲜唾液（mL） 1 2 3 4 2 2 2 2 2 2 2 2 注意：向各试管中加入稀释唾液的时间间隔各为1分钟。 （3）将各管的内容物混匀，并依次置于37C恒温水浴中保温

（4）待向第4管加入唾液2分钟后，每隔1分钟由第3管取出一滴混合液，置于白瓷板上，加1小滴碘化钾—碘溶液，检验淀粉的水解程度。待混合液变为棕黄色时，向说有试管依次添加1～2滴碘化钾—碘溶液。添加碘化钾—碘溶液的时间间隔，从第1管起，亦为1分钟。观察各试管中物质呈现的颜色，分析pH对唾液淀粉酶活性的影响。

o

（三）、唾液淀粉酶的活化和抑制

【实验目的】 了解激活剂和抑制剂对酶活力的影响。

【实验原理】 酶的活性受活化剂或抑制剂的影响。氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为其抑制剂。

【实验器材】 (1)恒温水浴 (2)试管及试管架

【试剂和材料】 (1)0．1％淀粉溶液 (2)稀释200倍的新鲜唾液

(3)1％氯化钠溶液 (4)1％硫酸铜溶液 (5)1％硫酸钠溶液 (6)碘化钾―碘溶液

【实验操作】

管 号 0.1%淀粉溶液（mL） 稀释唾液 1%硫酸铜溶液 1%氯化钠溶液 1%硫酸钠溶液 蒸馏水 1 1.5 0.5 0.5 ― ― ― 2 1.5 0.5 ― 0.5 ― ― 3 1.5 0.5 ― ― 0.5 ― 4 1.5 0.5 ― ― ― 0.5 37℃恒温水浴、保温10分钟

碘化钾―碘溶液（滴） 现 象 2~3 2~3 2~3 2~3 解释结果，说明本实验第3管的意义。 【思考题】

1、什么是酶的最适温度及其应用意义?

2、什么是酶反应的最适pH?对酶活性有什么影响? 3、什么是酶的活化剂?

4、什么是酶的抑制剂？与变性剂有何区别？ 【实验总结】

（一）、温度对酶活力的影响

管 号 1 2 2号剩一半 3 （二）、PH对酶活性的影响

呈现的颜色 解释结果 管 号 1 2 3 4 呈现的颜色 解释结果 （三）、唾液淀粉酶活化和抑制

管 号 呈现的颜色 解释结果 第3管的意义

1 2 3 4

※实验九 维生素C的定量测定

【实验目的】

1．学习维生素C定量测定法的原理和方法。 2．进一步熟悉、掌握微量滴定法的基本操作技术。 【实验原理】

测定维生素C（抗坏血酸）的化学方法，一般是根据它的还原性。本实验即利用维生素C的这一性质，使其与2，6--二氯酚靛酚作用。2，6―二氯酚靛酚钠盐的水溶液呈蓝色，在酸性环境中为玫瑰色，当其被还原时，则脱色。根据上述反应，利用2，6―二氯酚靛酚在酸性环境中滴定含有维生素C的样品溶液。开始时，样品液中的维生素C立即将滴入的2，6―二氯酚靛酚被还原脱色，当样品液中维生素C全部被氧化时，再滴入的2，6一二氯酚靛酚就不再被还原脱色而呈玫瑰色。故当样品液用2，6―二氯酚靛酚标准液滴定时，溶液出现浅玫瑰色时表明样品液中的维生素C全部被氧化，达到了滴定终点。此时，记录滴定所消耗的2，6―二氯酚靛酚标准液量，按下述公式计算出样品液中还原型维生素C的含量。

计算公式：

式中：VA为滴定样品提取液所用的2，6―二氯酚靛酚的平均mL数； VB为滴空白对照所用的2，6―二氯酚靛酚的平均mL数； S为1mL2，6―二氯酚靛酚溶液相当于维生素C的mg数； W为10mL样品提取液中含样品的g数。 【器材】

1．研钵 2．吸量管（10mL） 3．容量瓶（50mL） 4．锥形瓶（50mL）

5．微量滴定管（5mL） 6．漏斗

7．纱布 8．滤纸 9．药物天平 【试剂和材料】

1．绿豆芽 800g 2．10%盐酸溶液 1500mL 3．2，6―二氯酚靛酚溶液 2000mL

称取0.21g碳酸氢钠，0.26g 2，6―二氯酚靛酚溶于250mL蒸馏水中，稀释至1000mL。过滤，装入棕色瓶内，置于冰箱内保存，不得超过3天。使用前用新配制的标准抗坏血酸溶液标定。取5mL标准抗坏血酸溶液加入5mL偏磷酸―醋酸溶液。然后用2，6―二氯酚靛酚溶液滴定，以生成为微玫瑰红色持续15秒钟不退为终点。计算2，6―二氯酚靛酚溶液的浓度，以每mL2，6―二氯酚靛酚溶液相当于抗坏血酸的mg数来表示。

4．标准抗坏血酸溶液：准确称取纯抗坏血酸结晶50mg溶于偏磷酸―醋酸溶液定容到250mL。装入棕色瓶，贮于冰箱内。

5．偏磷酸―醋酸溶液：称取偏磷酸15g，溶于40mL冰醋酸和450mL蒸馏水所配成的混合液中。过滤。贮于冰箱内，此液保存不得超过10天。 【实验操作】

1、

制备含维生素C的样品提取液：称取30g绿豆芽（37C发芽3～7天）置研钵中研磨，放置片刻（约10分钟），用2层纱布过滤，将滤液（如混浊可离心）滤入50mL容量瓶中。反复抽提2～3次，将滤液并入同一容量瓶中。最后，用酸化的蒸馏水定容，混匀，备用。

2、

量取样品提取液10mL于锥形瓶中，用微量滴定管，以2，6―二氯酚靛酚溶液滴定样品提取液，呈微弱的玫瑰色，持续5秒钟不退为终点，记录所用2，6―二氯酚靛酚的mL数。整个滴定过程不要超过2分钟。另取10mL用10%盐酸酸化的蒸馏水做空白对照滴定。

3、 4、

样品提取液和空白对照各做三份。 计算结果。

0

【注意事项】：本实验所用的方法简便，但不够准确，其原因如下：

1、生物组织提取液中维生素C还能以脱氢和结合的形式存在。这两种形式的维生素C都具有还原型维生素C的生物活性，却不能将2，6―二氯酚靛酚还原脱色。

2、生物组织提取液中含有天然色素，干扰对滴定终点的观察。

※ 实验十

【实验目的】

1、学习分光光度计的原理和使用方法。 2、学习测定淀粉酶活力的方法。 3、了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。 【实验原理】

几乎所有植物中都存在淀粉酶，尤其是萌发的禾谷类种子，淀粉酶活性最强。淀粉酶是水解淀粉糖苷键的一类酶的总称。包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化淀粉酶、异淀粉酶等。实验证明在小麦、黑麦的休眠种子中直含有α-淀粉酶和β-淀粉酶。种子萌发时，淀粉酶活性随萌发时间迅速增加，将淀粉分解成小分子糖类，供幼苗生长。α-淀粉酶随机水解淀粉的α-1,4-糖苷键，作为淀粉分解的起始酶而起主要作用；其水解产物为麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖；β-淀粉酶水解非还原端的第二个α-1,4-糖苷键，水解产物为麦芽糖，并能使一部分糊精糖化。本实验观察小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。

淀粉的水解产物麦芽糖及其它还原糖能与3,5-二硝基水杨酸试剂反应，使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖（或葡萄糖）浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。

【仪器与用具】

分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；具塞刻度试管（25ml×13）；刻度吸管（1ml，2ml，5ml各1支）；容量瓶（50ml×2）。

【试剂】 1、小麦种子

2、0.1%标准麦芽糖溶液：称取100mg麦芽糖，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中并定容至刻度。

小麦种子萌发时淀粉酶活力的测定

3、1%DNS试剂（3,5-二硝基水杨酸试剂）：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20ml 2mol/L 的NaOH溶液中，加入50ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100ml。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用。

4、pH6.9，0.02 mol/L磷酸缓冲液：

0.2 mol/L 磷酸二氢钾67.5mL与0.2 mol/L 磷酸氢二钾82.5mL混合稀释10倍。 5、1%淀粉溶液：称取1g可溶性淀粉溶于100ml 0.02 mol/L磷酸缓冲液，其中含有0.0067mol/L氯化钠。

6、1%氯化钠溶液 7、海砂 【实验操作】

1、种子发芽：小麦种子浸泡2.5小时后，放入250C恒温箱内或在室温下发芽。 2、酶液提取：

（1）幼苗酶的提取：取25℃下萌发3～4天的小麦幼芽（芽长1.0~1.5cm）15株，置研钵中，加少量石英砂（200mg），加1%氯化钠溶液10mL，用力研磨成匀浆，在室温下放置20分钟，搅拌几次，使其充分提取。然后将提取液转入离心管中，在3000r/min转速下离心10min，将上清液倒入量筒中，测定酶提取液的总体积。取酶液1mL用缓冲液将酶提取液稀释10倍，进行酶活力测定。

（2）种子酶的提取：将干燥的种子或浸泡2.5小时后的种子15粒作为对照（提取步骤同上）。

3.酶活力的测定：取25mL刻度试管4支,编号,按下表进行操作。

试管 试剂 标号 （mL） 酶提液 0.1%标准麦芽糖溶液 1%淀粉溶液 蒸馏水 1 干燥（或浸泡2.5小时）种子的酶提液 0.5 —— 1 —— 2 发芽3或4天幼苗的酶提液 0.5 —— 1 —— —— 0.5 1 —— 3 标准管 4 空白管 —— —— 1 0.5 将各管摇匀，放在25oC恒温水浴中保温3min水解后，立即向各管中加入1%DNS试剂（3,5-二硝基水杨酸试剂）2mL。

取出各试管，放入沸水浴中加热5min。冷却至室温，加水稀释至25mL。将各管充分混匀。用空白管作为对照，在A500nm处测定各管的光吸收值。将读数填入下表。

试管号 1、干燥（或浸泡2.5小时）种子的酶提液 发芽3或4天幼苗的酶提液 标准管 空白管 A500nm 【计算】

根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即：

A标准A未知=C标准C未知：则C（酶液管中麦芽糖的浓度）=A酶×C标准A标准

式中：C为浓度；A为光吸收值。

本实验规定：在25oC时3分钟内水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为一个酶活力单位。

则15粒种子或15株幼苗的总活力单位= C酶×n酶 × V酶 式中：C酶为酶液中麦芽糖的浓度； n酶为酶液稀释倍数； V酶为提取酶液的总体积。 【注意事项】

1、小麦种子萌发前须充分浸泡24小时，然后均匀的放在铺有滤纸的培养皿或解剖盘中，开始2～3天内须保证水分充足，根系发达后浇水不可过多。

2、萌发情况不同，酶活力也不同：刚萌发出胚根的小麦，酶活力增加迅速，之后，虽发芽天数的增加而增加，但幅度减慢，同一天发芽的幼苗高株比矮株的酶活力略高。

3、酶提取温度应控制在0～4oC，因为低温条件下易保持酶的活力。 4、酶液中麦芽糖含量的测定也可用标准曲线法。 【思考题】

1、为什么此酶的提纯整个过程须在0～4oC条件下进行？而测酶活力时要在25oC预保温？反应后又放入沸水浴中？

2、小麦萌发过程中淀粉酶活性升高的原因和意义是什么？

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