发酵过程优化原理复习

发酵过程优化原理复习

1、 发酵过程优化的目标

答：①建立生物反应过程的数量化处理和动力学模型。 ②实现发酵过程优化，以更好地控制发酵过程；

③规避生物技术产业化过程的技术风险，追求其经济效益；

2、发酵过程优化主要涉及的研究内容

答：①细胞生长过程研究，了解微生物从非生物培养基中摄取营养物质的情况和营养物质通过代谢途径转化后的去向，确定不同环境条件下微生物的代谢产物分布；

②根据微生物代谢反应符合质量守恒定律，对微生物反应的化学计量进行研究，简化对发酵过程的质量衡算；

③研究生物反应速率及其影响因素，建立生物反应动力学，这也是是发酵过程优化研究的核心内容。 ④生物反应器工程，包括生物反应器及参数的检测与控制，它们是发酵过程优化最基本的手段。

3、Hasting（1954年）指出生化工程要解决的十大问题是哪些？

答：深层培养、通气、空气除菌、搅拌、结构材料、容器、冷却方式、设备及培养基除菌、过滤、公害。其中通气搅拌与放大是生化工程学科的核心，其中放大是生化工程的焦点。 4、Cooney指出，要实现发酵过程的优化与控制，必须解决好哪些问题？

答：必须解决好5个问题：①生物模型；②传感器技术；③适用于生物过程的最优化技术；④系统动力学；⑤计算机-监测系统-发酵罐之间的接口技术

5、流加发酵、分批发酵、连续发酵方式的优缺点比较

答：①与传统的分批发酵相比，流加发酵可以解除底物抑制、葡萄糖效应和代谢阻遏等；与连续发酵相比，流加发酵则具有染菌可能性更小，菌种不易老化变异等优点。

②与流加发酵和连续发酵相比，分批发酵工艺操作简单， 比较容易解决杂菌污染和菌种退化等

问题， 对营养物的利用效率较高，产物浓度也比连续发酵要高。但其 人力、物力、动力消耗较大，生产周期较长，生产效率低。

③连续发酵最大的优点是，微生物细胞的生长速度、代谢活性处于恒定状态，可达到稳定高速培养微生物或产生大量代谢产物的目的，且便于进行微生物代谢、生理生化和遗传特性的研究，在工业上可减少分批培养中每次清洗、装料、消毒、接种、放罐等操作时间，提高了生产效率和自动化程度。 6、重组生物药物生产过程的优化包括哪6个方面

答：①适宜宿主的选择；②重组蛋白积累位点（如可溶的胞内积累、胞内聚合积累、周质积累或胞外积累）的确定；③重组基因最大表达的分子策略；④细胞生长和生产环境的优化；⑤发酵条件的优化；⑥后处理过程的优化。

7、操作细胞循环生物反应器时必须考虑哪两个因素？为什么？

答：①稀释率（流速/体积），因为稀释率的大小影响细胞的生长速率，不同的实验目的对稀释率的要求也不同；

②循环速率（指通过过滤系统的培养基速率），因为高的循环速率可使组分混合均匀，但循环速率过高会使作用在细胞上的剪切力过高，也会导致过滤单元膜的迅速损坏。 因此，很难同时确定合适的稀释率与循环速率，这也是限制细胞循环技术应用的一个重要因素。

8、细胞生长过程可以分为哪3个步骤，运输过程包括其中的两个步骤，在细胞膜上的运输过程是研究者普遍关心的内容，在细胞膜上可能存在哪些运输机制？各有何特点？

答：（1）细胞生长过程的3个步骤：①底物传递进入细胞；②通过胞内反应，将底物转变为细胞质和代谢产物；③代谢产物排泄进入非生物相；

（2）研究表明在膜上存在3种不同的运输机制：①自由扩散；②协助扩散；③主动运输。

特点：①自由扩散和协助扩散只有存在浓度梯度时，由高浓度向低浓度的运输才可能发生，统称被动运输，在运输过程中不需要提供外部能量；

自由扩散分子扩散的质量通量遵守Fick第一定律，通过自由扩散进行运输的化学物质主要有

氧气、二氧化碳、水、有机酸和乙醇等；协助扩散是通过膜上的转运蛋白来进行物质运输的，具有选择性，其运输速率比自由扩散又快又多，运输速率遵循典型的饱和型动力学。

③主动运输是逆着浓度梯度进行运输，需要输入一定的吉布斯自由能，以特定的膜内蛋白作为

运输过程的媒介，可以逆着浓度梯度的方向进行运输，因此是一个耗能的过程，根据运输动力来源可以分为一级主动运输和次级主动运输两大类，还有一种特别的主动运输过程为基团转移。

9、发酵过程数量化处理包括哪些方面的内容？常规的参数一般包括哪些？通常如何测量这些参数？

发酵过程的数量化处理包括：①发酵过程的速度；②化学计量学和热力学；③生产率、转化率和产率；

10、比速率和速率有什么区别？

答：比速率是一个相对速度，表示细胞的个体行为，反应了细胞的生长和代谢能力，它与生物量（以细

-1

胞干重表示）或有催化活性物质的量（如酶量）有密切的关系，各种比速率的单位均为h，定义类似于化

*

学反应动力学中比速率ri的定义

速率：是绝对速率，所表示的是细胞的整体行为，不能代表系统的特征。 11、生物反应过程中有关的宏观产率系数及定义

答：宏观产率系数（或称得率系数）Yi/j（i表示菌体或产物，j表示底物）是常用于对C源等底物形成菌体或产物的潜力进行评价，将消耗的量同形成的量关联起来，定量表示细胞或产物甚至热量的产率，也能用于定量的表示不同消耗量之间或形成量之间的相互关系，最初是由Monod以质量单位和商的形式定义的：

Y???x?xt?x0?dx/dt??rx?dx?细胞形成的质量x/s?ss0?stds/dtrs ds底物消耗的质量12、YATP与其它产率系数相比有何特点？?x?YMx/ssY ATP答： ? ? A TP ? Y ATP/s ，是Bauchop以异化代谢中ATP的生长量作为菌体产率的基准而定义的。YATP与

微生物及底物种类无关，基本为一常数。

在复合培养基的厌氧培养中，不管微生物和环境的性质如何，YATP总是约为10.5g/mol。但该值对微生物生长具有普遍性。在基本培养基中无论是厌氧还是需氧培养，单一碳源中一部分作为能源通过异化代谢分解，其余部分用于同化构成菌体。假设用于同化的这部分碳源与ATP生成无关，则对于异化代谢的碳源亦服从YATP≈10g/mol。

13、复合培养基厌氧培养过程中细胞的生物合成步骤及ATP的生成和利用途径 P26

14、代谢产物理论产率系数和实际过程产率系数有何区别？影响实际过程产率系数的因素有哪些？

答：假设发酵过程中完全没有菌体生成，则YP/S可以达到最高值，即为理论代谢产物产率，可以根据化学计量关系、生物化学计量关系计算。

而在实际发酵过程中的实际产率是变化的，所以需对产率系数的概念进行修正。实际产率值取决于各种生物和物理参数。，式中μ为比生长速率；m为混合度；s为底物浓度；t为平均停留时间；tm为混合时间；OTR为氧传递速度

15、微生物反应动力学模型的类型及着眼点。Monod模型属于什么模型？其使用的条件包括哪些?

答：（1）①类型：可分为概率论模型和决定论模型两大类，其中决定论模型又可分为均相模型和生物相

分离模型，或结构模型与非结构模型。

②着眼点：对底物、菌体和产物3个状态变量进行数学描述 （2）非结构动力学模型

（3）满足的条件为：①菌体生长为均衡性非结构生长；②培养基中只有一种底物是生长限制性底物；

③菌体产率系数恒定

16、对于一个具体的发酵产品，需要使用哪些模型才能完整地对其进行描述？为什么？

答：（1）温度和pH恒定时，μ随培养基组分浓度变化而变化。若着眼于某一特定培养基组分的浓度s，

sμ?μmax并假设其它培养基组分浓度不变，则得到Monod模型为：

sKs?sμ(s,t)?μmax(1?e?t/t，) （2）延迟期动力学模型 Ks?s （3）生长稳定期动力学模型：rX=α.x（1 – x/β）α和β是经验常数，取α=μmax和β=xmax ，在微生物生长停止时才出现产物形成的情况下，它具有较好的适用性。

细胞的生长、繁殖代谢是一个复杂的生物化学过程，该过程既包括细胞内的生化反应，也包括胞内与胞外的物质交换，还包括胞外物质的传递及反应。该体系具有多相、多组分、非线性的特点。同时，细胞的培养和代谢还是一个复杂的群体的生命活动，每个细胞都经历着生长、成熟直至衰老的过程，同时还伴有退化和变异。要对这样一个复杂的体系进行精确的描述，在各个发酵阶段必须合适的发酵动力模型。为了优化反应过程，首先要进行合理的简化，就必须在简化的基础上建立过程的物理模型，再据此推导得出数学模型，对发酵过程进行合理优化。

17、Gaden根据产物生成速率和细胞生长速率之间的关系，将产物形成分成了哪几种类型？除此之外，还有哪两种模型？

L

答：类型Ⅰ：也称偶联模型，即产物的形成与细胞的生长相偶联；或代谢产物的生成与微生物生长完全同步。

类型Ⅱ：也称部分偶联模型，即产物的形成与底物的消耗存在部分偶联。这类代谢产物通常是在能

源代谢中间接生成的，代谢途径较为复杂。

类型Ⅲ：也称非偶联模型，即产物的形成与细胞的生长没有直接关系，当细胞处于生长阶段时，没

有产物积累，当细胞生长停止以后，产物大量形成。

还有两种模型：一种是qp与μ负偶联的模型，例如黑曲霉生产黑色素，其qp与μ的关系可表示为： qp=qp，

max-YP/Xμ ；另外一种是qp与μ没有关系的模型，一般只适用于休眠细胞中，此时细胞本身代谢仅利用少量底物，只起到酶载体的作用，有：rp=α.rx+β.x-kd.p 18、发酵过程优化一般包括哪些步骤？具体陈述

答：简化、定量化、分离、建模型，最后把分离开的现象重新组合起来。

①反应过程的简化：微生物反应是一个复杂的过程，简化必须保证不损失基本信息，例如将微生物

细胞当作黑匣子，其简化的结果是从宏观上通过分析、计算液相中各种浓度变化来间接地反应细胞中发生的代谢反应；

②定量化：分析方法的选择必须要求可以保证测定结果的可用性和代表性能够满足优化的要求。 ③分离：指在生物过程和物理过程的各种速度相互不影响的情况下，精心设计实验以获得关于生物和物理现象的数据，只能通过计算机模拟的方式，通过检测液体培养基中的外部变化，才能来反应代谢反应的内部变化。

④数学建模：是能以简化的形式表征过程行为，并实现特定目的的数学公式。数学模型可将特定结果通用化，并为推论系统的其它性质提供基础。 19、系统优化方法的基本原则，具体陈述

答：（1）整体性原则：①不能从系统的局部得出有关系统整体的结论；②分系统的目标必须服从于系统整体的目标。

（2）有序相关原则：凡是系统都是有序的，为获得预期的整体功能，从方法论上应把注意力集中于系统内部各要素（分系统）之间的相互关联上。

（3）目标优化原则：是系统优化技术的指导思想和优化目标，优化问题是在不可控参数发生变化的情况下，根据系统的目标，经常、有效地确定可控参数的数值，使系统经常处于最优状态。系统最优化离不开系统模型化，先有模型化而后才有系统最优化。

（4）动态性原则： 应把实施对象看作一个动态过程，分析系统内外的各种变化，掌握变化的性质、方向和趋势，采取相应的手段，改进研究方法，在动态变化中对系统整体进行优化。

（5）分解综合原则：分解对系统来说就是归纳出相对独立、层次不同的分系统。综合则是完成新系统的筹建过程，即选择具有性能好、适用性强的分系统，设计出它们的相互关系，形成具有更广泛价值的系统，以达到预定的目标。分解的原则是既要满足系统的结构要求，又要便于进行研究。一般可按结构要素、时间要素、功能要素、空间状态等方法进行分解。

（6）系统创造思维原则：其基本原则有两条：第一、把陌生的事物看作熟悉的东西，用已有的知识加以辨识和解决。第二、把熟悉的对象看作陌生的东西，用新的方法、新的原则加以研究，从而创造出新的理论、新的技术。

总之，对生物系统进行优化，首先是要构建一个系统，然后使这一系统高效运行。

20、构建ATP再生系统必须满足那些条件？ 目前报道的ATP再生系统按底物不同可以分为哪几类？根据酶源的不同，可分为哪几类？各有何特点?

答：（1）条件：①用于合成产物的酶的活性必须足够强且稳定；②能够大量提供廉价、稳定的前体物质；③再生ATP的活性足够强且稳定，能与生物合成酶反应成功耦合；④提供廉价的能量底物和磷酸基团供体以利于ATP再生；⑤若有类似于分解反应的有害副反应，则必须对其加以控制；⑥若底物或预定的产物不能透过细胞膜，则必须设法提高膜的通透性。

（2）按底物不同来分类，目前所报道的ATP再生系统可以分为转移高能磷酸基的反应系统和用碳水化合物作基质的反应系统。

（3）根据酶源不同分的类型：

①自耦合ATP再生系统：在该系统中，生物合成酶反应所消耗的ATP被具有ATP合成活性的同

种微生物菌株再生，以后再用于生物合成反应，故只需提供葡萄糖和目标产物的前体，生物合成反应便可以进行下去。

②种间耦合ATP再生系统：即一种微生物作为ATP合成活性的供体，另一种微生物作为于此相

偶联的生物合成酶活性的供体。该系统的优点在于：合成酶活性供体可以自如地从多种微生物中选择；采用重组DNA技术可显著促进特定酶的活性。

21、ATP再生系统存在的问题

答：第一、除了合成产物所需的关键酶以外，细胞内还有许多种酶，其中一些具有分解活性，能将反应的底物和预定的产物转化为副产物；

第二、微生物细胞具有很强的自我保护功能，作为渗透屏障的细胞膜可防止胞内物质渗出。当细胞

用作酶源时，这种屏障就会阻碍底物和产物进出细胞。因此，有必要寻求一种在不降低合成酶活性前提下提高细胞膜通透性的方法。

22、采用ATP再生系统来生产有用物质时，固定化微生物细胞进行这些有用物质的生产具有什么优点？

答：优势:①无需提取和纯化酶的过程；②细胞可重复利用； ③可实现连续操作；④反应器占地小；⑤反应控制容易；⑥处理的液体体积小；⑦可获得高纯度产品；⑧工厂污染减轻。

23、E.coliⅡ-1是一株合成GSH的重组微生物，请分析有机溶剂和前体氨基酸对其合成GSH的影响 答：细胞未经有机溶剂处理，几乎不能在胞外积累GSH，而经过一定浓度的甲苯（最好）、苯乙醇和甲醇处理后，胞外GSH浓度明显提高。主要是由于通过有机溶剂的处理，提高了细胞膜的通透性，使ATP、其它底物及产物能够自由出入细胞，从而促进了GSH合成反应的进行。

实验浓度范围内，随L-Glu的浓度的增加，GSH的合成量相应增加；随Gly浓度的增加，GSH的合成量很快增加至一高点，然后维持稳定；随L-Cys浓度的增加，GSH的合成量出现高点之后逐渐下降。上述结果表明，L-Glu很可能对GSH-Ⅰ的活性具有促进作用，而过高浓度的L-Cys很可能对GSH-Ⅰ的活性有抑制作用。

24、有机废水处理如何与PHAs的合成耦合？分析影响耦合的有关因素

答：该思路的具体实施包括5个方面：

①合成废水生产PHAs的初步条件；② R.eutrophus发酵生产PHAs最佳有机酸种类，包括以有机酸为底物生产PHAs的代谢机理、理论产率和PHAs发酵的实际产率；③高效厌氧酸化工艺，包括酸化率达100%时有机酸分布的工艺学条件等；④在小型发酵罐中，以不同浓度的酸化废水为碳源进行分批发酵实验，在对PHAs发酵过程动力学分析的基础上，建立较为合理的发酵过程动力学模型；⑤进行有机废水生产PHAs流加发酵的初步研究，比较分批和流加发酵过程中丁酸对PHAs产率的变化。

影响耦合的因素： ①不同初始酸浓度对PHAs发酵过程的影响：②产物分布影响因子的影响；③HRT对酸化产物分布的影响；④不同pH条件下UASB反应器出水产物分布的影响。 25、在有机废水酸化工艺中，HRT对酸化产物分布的影响？

答：进水葡萄糖浓度为30g/L，自然pH时， HRT对酸化产物的组成有明显影响。HRT=3h时，乳酸＞乙酸＞丁酸；随着HRT的增加，酸化产物的组成发生变化，丁酸浓度大幅度增加，乳酸浓度下降，乙酸和丙酸的浓度略有增加。因此，延长HRT有可能使产酸相中丁酸成为主要产物。

26、生物反应与产物分离的组合系统具有什么特征？ 应用该系统时，分离技术的选择是关键，分离技术的选择主要考虑哪些因素？ 内部随程溶剂萃取和外部随程溶剂萃取各有何特点？

答：（1）3个特征：①耦合过程是一种集成式单元操作，其生物反应器具有特殊的结构；

②实现产物及时分离的方法必须考虑产物的特性及具体的生物反应体系来合理选择和设计； ③耦合过程作为一种新的反应工程技术，可适用于各种生物反应过程 （2）分离技术的选择主要基于4个方面的因素：

①分离技术应当具备生物相容性，适宜的分离技术对生物反应不造成负面影响，不会造成生物催化剂或细胞的失活、变性和死亡，也不会改变生物反应的代谢和调节机制；

②应当考虑产物或副产物的物理化学性质和生物学特性；

③考虑系统的流体特性，因为流体力学性质决定并影响分离过程的传质，从而影响分离的容量和速度，如高粘度的非牛顿流体就不能用膜分离技术；

④考虑工程及经济因素，理想的分离技术应当是操作费用低、性能稳定、工程上易于实现的技术。

（3）内部随程萃取是指萃取剂在反应器中与培养基直接接触，以便将产物萃取到溶剂中去。内部随程萃取的特点是溶剂和液相混合均匀，因而有利于传质的进行。但溶剂也可能在培养液中形成稳定的乳化作用，这对溶剂和产物的分离不利。外部随程萃取是指萃取剂和培养液在反应器外的萃取装臵中逆流接触，从而萃取产物的过程。用这种方法可以减轻内部溶剂萃取中的乳化问题。 27、流加发酵的分类

答：（1）单一补料分批培养，特点是补料一直到培养液达到额定值为止，且在培养过程中不取出培养液。 （2）重复补料分批培养，特点是在培养过程中每隔一定时间， 取出一定体积的培养液，同时在同一时间间隔内加入相等体积的培养液，如此反复。

分五类：间歇补料操作流加发酵、连续补料操作流加发酵、循环补料操作流加发酵、循环连续补料操作流加发酵、循环间歇补料操作流加发酵。

28、赖氨酸的生产方法有哪些？酶法生产赖氨酸的工艺有哪些？ 答：水解法(已淘汰)、合成法、酶法和直接发酵法。 酶法（3种）：

①合成ε-苯甲酰-α-乙酰-DL-赖氨酸，采用消旋酶处理制成ε-苯甲酰-L-赖氨酸，经酸水解

得产品；

②合成DL-4-氨基丁基乙内酰脲，采用微生物酶使其转变为L-赖氨酸；

③由环己烯合成DL-氨基己内酰胺，采用水解酶和消旋酶共同作用使其变成L-赖氨酸。

29、目前通常采用哪些方法来保持高产菌株遗传性能的稳定，防止其回复突变？

答：①选育遗传性能稳定的菌株。经诱变处理后，在易出现回复突变的培养基中反复传代，选出不发生回复突变的菌株；

②定向赋加生产菌的遗传标记。如选育双缺菌株，增加抗回复突变性能；对于抗性株，尽量选育多重抗性突变株；

③在保藏过程中除选择合理的保藏方法外，对于营养缺陷型菌株要提供足够的营养物，抗性株可添加适量的抗性物质；

④必须定期进行分离、纯化工作，保持其遗传性能的稳定。

30、黄色短杆菌是我国赖氨酸发酵的常用菌株，请分析其产赖氨酸的合成途径及调控机制，根据其赖氨酸合成途径及代谢调控机制，可以采用哪些育种策略？这些问题与发酵过程优化有什么关系？

答：（1）如右图：

（2）①切断代谢支路：选育和应用营养缺陷型菌株，切断丙氨酸、苏氨酸和蛋氨酸的分支途径是积累赖氨酸的有效手段。

②解除反馈抑制：选育抗结构类似物的突变株，可以得到对AK反馈抑制脱敏的菌株，代谢调节被遗传性地解除，这是赖氨酸发酵育种的重要手段。特别是选育营养缺陷型兼具结构类似物抗性的突变株，极有希望获得高产菌株。

③增加前体的生物合成：关键酶AK的催化反应速度与底物天门冬氨酸浓度的之间的关系呈S型，随着底物浓度的增加，AK与天门冬氨酸的亲和协同性增大。根据变构酶的S型动力学特性，为了提高赖氨酸的产量，应设法增加前体物质天门冬氨酸的浓度，以抵消变构抑制剂的影响。因此选育丙氨酸缺陷型，抗天门冬氨酸结构类似物的突变株。

④解除代谢互锁：赖氨酸与亮氨酸的生物合成之间存在代谢互锁，因此可以考虑选育亮氨酸缺陷型，抗亮氨酸结构类似物的突变株。

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31、FB42（LeuThrAECrAHVrLysHxr）是一株能大量合成赖氨酸的黄色短杆菌，在分批发酵中，初糖浓度、溶氧、pH对其发酵过程有什么影响？Thr、Leu、生物素对其分泌赖氨酸有何影响？为什么其发酵动力学模型的建立需要首先进行发酵过程的动力学分析？ 应当如何评价所建立的动力学模型？

答：（1）①菌体浓度存在一个饱和值，只要满足一定的初糖浓度，菌体的生长都能达到这个饱和值。只是不同的初糖浓度时菌体达到饱和值的时间不一样。随着初糖浓度的逐渐升高，菌体浓度达到饱和值的时间将逐渐延长，表明初糖浓度对FB42的生长有抑制作用。

② 对于菌体生长来说，在满足一定的溶氧水平前提下，菌体在不同的溶氧水平时其生长量均能达到一个饱和值，但菌体的生长速度不同。结合图4-27和图4-26发现，当KLa=531.8h-1时，菌体的生长比速最大，过高的KLa反而对菌体的生长有抑制作用。 综合菌体生长和产物形成的结果表明，菌体生长和产物合成所需的合适溶氧水平不一致。

③pH对许多酶的催化过程有很大的影响，pH变化能改变体系酶的环境和营养物质的代谢流，

使得诱导物和生长因子在活性和非活性之间变化。pH的变化对赖氨酸的发酵影响很大：当pH7.0时产酸最高，pH偏高或偏低，产酸均降低。pH对菌体生长量总的来说影响不大，但进一步的研究却发现pH同时影响了菌体的生长比速和产物的形成比速，偏低的pH对菌体生长有利，实验范围内pH6.0时菌体的生长比速最 高，而产物形成比速在pH7.0时最高。

（2）当苏氨酸浓度＞150mg/L时，就能满足菌体生长的需求，且实验范围内未发现过高的苏氨酸浓度对菌体生长有抑制作用。对产酸而言，苏氨酸浓度有一合适范围（100~350mg/L之间），过高对FB42产赖氨酸有抑制作用；亮氨酸对菌体生长和产酸的影响相似，即存在合适的生长和产酸浓度（400~600mg/L），过高会抑制菌体生长和产酸；高生物素浓度将抑制谷氨酸的分泌而应该有利于赖氨酸分泌。通过合成培养基进行的发酵实验表明，生物素浓度必须大于150μg/L。发酵中，添加3%的玉米浆即可满足要求。

（3）建立和评价的一般规律：

①明确建模目的，主要从宏观角度出发，实现产物最大生长比速及最短生产周期，获得满意的经济效益，同时要求动力学模型尽量简单；

②对模型做出合理的假设，并确定模型应用范围；

③选择合理的模型参数，模型中的参数最好容易测定，才能使控制容易进行；

④建立模型来实施最佳工艺控制，建模才能够通过优化工艺和管理，将发酵控制在最佳工艺； ⑤模型的校验与修改，模型是否合理，需要进行试验和生产的检验，以及进行不要、合理的修改，

修改从第②步开始；

⑥对模型的评价主要考虑在实验范围内，模型是否符合实验结果、是否简单、是否具有一定

的通用性，参数是否恰当，这些因素以生产中容易应用为基本出发点。

32、以赖氨酸发酵生产为例，请你结合发酵过程优化的基本原理，谈谈你的优化思路。 33、以丙酮酸发酵生产为例，请你结合发酵过程优化的基本原理，谈谈你的优化思路。 34、利用WSH-IP12菌株发酵法生产丙酮酸时，氮源、碳氮比对其丙酮酸发酵有何影响？

答：①初始葡萄糖浓度为80g/L，当培养基中蛋白胨浓度为15g/L时，丙酮酸产量较高，低于15g/L时，葡萄糖消耗速度较慢，细胞干重和丙酮酸产量也较低；而高于15g/L时，丙酮酸产量明显下降。酵母粉是一种常用的氮源和生长因子的来源，但“随着发酵培养基中酵母粉浓度的增大，细胞干重不断增大而丙酮酸产量却迅速降低”实验结果表明酵母粉不适合研究菌株发酵生产丙酮酸。豆饼水解液浓度为5g/L时，发酵液中丙酮酸产量较高，但低于蛋白胨。不过，由于豆饼水解液来源广、价格低，因而仍是一种有潜力的氮源。

②小型发酵罐的实验结果表明:葡萄糖和蛋白胨的浓度按碳:氮=25：1的原则同时提高，丙酮酸的生

产会得到促进；若蛋白胨浓度保持不变，在此基础上再提高葡萄糖浓度（即C:N增大），发酵后期（40h后）细胞生长速度和葡萄糖消耗速度明显下降，丙酮酸产率也显著降低。

35、WSH-IP12与WSH-IP303相比主要有什么差异？维生素对WSH-IP303菌株过量合成丙酮酸中的影响 答：（1）WSH-IP303可以以无机氮化合物为唯一氮源并大量积累丙酮酸，且WSH-IP303对氮源的需求量也有所下降；而WSH-IP12虽可利用硫酸铵、氯化铵、磷酸氢铵和尿素为唯一氮源生长，但其丙酮酸产量均不及以蛋白胨和豆饼水解液为氮源的情况。

（2）①培养基中若缺乏烟酸、硫胺素、吡哆醇和生物素中的任何一种，细胞生长均很弱，丙酮酸产量也很低；

②细胞生长不需要核黄素，但添加适量的核黄素对丙酮酸的生产有一定的促进作用； ③细胞积累丙酮酸时，对不同维生素浓度变化的敏感程度不同。

正交实验的结果表明：

①硫胺素是影响细胞生长、葡萄糖消耗及丙酮酸合成的最重要因素；②增大吡哆醇、生物素和核黄

素的浓度，对细胞生长和葡萄糖消耗没有显著影响，但对丙酮酸合成有一定的促进作用；③增大烟酸浓度可促进葡萄糖的消耗，但不利于丙酮酸的合成。细胞以葡萄糖为碳源积累丙酮酸时，烟酸和硫胺素较优浓度的确定，对维持丙酮酸合成与降解的平衡非常重要。

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