饲料添加剂酶制剂检测方法汇总

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饲料酶活性测定方法

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目录

附录A 木聚糖酶酶活力活力测定方法 ....................................................................................................... 1

附录B β-葡聚糖酶活力测定方法................................................................................................................5

附录C甘露聚糖酶酶活力测定方法...............................................................................................................9

附录D 纤维素酶酶活力测定方法...............................................................................................................13

附录E 果胶酶酶活力测定方法...................................................................................................................17

附录F α-淀粉酶酶活力测定方法..............................................................................................................20

附录G 蛋白酶酶活力测定方法...................................................................................................................30

附录H α-半乳糖苷酶酶活力测定方法......................................................................................................35

附录I 植酸酶酶活力测定方法....................................................................................................................38

附录J 糖化酶酶活力测定方法....................................................................................................................42

附录K 真菌α淀粉酶酶活力测定方法.......................................................................................................44

附录L 脂肪酶酶活力测定方法....................................................................................................................46

附录M 木瓜蛋白酶酶活力测定方法..........................................................................................................49

常用标准溶液的配制和标定........................................................................................................................52

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附录A

木聚糖酶活力的测定方法 （GB/T23874-2009）

A1 应用范围

本标准规定了用分光光度法测定饲料添加剂中木聚糖酶的活力。 本标准适用于饲料添加剂木聚糖酶产品，最低检出限为10.0U/g。 A2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注册日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注册日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 A3 木聚糖酶活力单位定义

在37℃，pH 为5.5 的条件下，每分钟从浓度为5mg/mL 的木聚糖溶液中降解释放1umol 还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。 A4 测定原理

木聚糖酶能将木聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂发生显色反应。反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中木聚糖酶的活力。 A5.试剂与溶液

除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682 中规定的三级水。 A5.1 乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L： 吸取冰乙酸0.60mL。加水溶解，定容至100mL。 A5.2 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L： 称取无水乙酸钠0.82g。加水溶解，定容至100mL。 A5.3 氢氧化钠溶液，c(NaOH)为200g/L： 称取氢氧化钠20.0g。加水溶解，定容至100mL。

A5.4 乙酸—乙酸钠缓冲溶液，c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L，pH 为5.50

称取无水乙酸钠14g，加入冰乙酸1.70mL。再加水溶解，定容至2000mL。测定溶液的pH。 如果pH 偏离5.50，再用乙酸溶液（5.1）或乙酸钠溶液（5.2）调节至5.50。 A5.5 木糖储备溶液，c(C5H10O5)为10.0mg/mL：

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称取无水木糖1.000g，加缓冲液（5.4）溶解，定容至100mL。 A5.6 木聚糖溶液，浓度为10mg/mL

称取木聚糖（Sigma X4252）1.00g，加入氢氧化钠0.32g(或0.5mol/LNaOH 溶液16mL)，再加入90mL 水（75mL）,加热，磁力搅拌至木聚糖完全溶解。再加入冰乙酸0.5mL，再用乙酸乙酸钠缓冲溶液（5.4）定容至100mL。如果pH 偏离5.50，再用乙酸溶液（5.1）或乙酸钠溶液（5.2）调节pH至5.50，然后再用乙酸乙酸钠缓冲溶液（5.4）定容至100mL。使用前，适当摇匀。4℃避光保存，有效期为12h。 A5.7DNS 试剂

称取3,5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500mL，搅拌5s，水浴至45℃。然后逐步加入100mL氢氧化钠溶液（5.3），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g 和无水亚硫酸钠2.50g。继续45℃水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。用烧结玻璃过滤器过滤(孔径为0.45μm)。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后可以使用，有效期为180d。 A6.仪器与设备

A6.1 分析天平：感量0.001g。 A6.2 pH 计：精确至0.01。

A6.3 恒温水浴锅：温度控制范围在30-60℃之间，精度为0.1℃。 A6.4 分光光度计：能检测350-800nm 的吸光度范围。 A6.5 移液器：精度为μL。 A7. 标准曲线的绘制

A7.1 吸取贮备液（5.5）按下表配制成木糖标准溶液

管号 1

2 3 4 5 6 7

取木糖储备液体积(m L)

1 2 3 4 5 6 7

取乙酸—乙酸钠缓冲液体积(mL)

99 98 97 96 95 94 93

木糖浓度(mg/mL) 0.10

0.20

0.30 0.40 0.50 0.60 0.70

A7.2 吸取乙酸-乙酸钠缓冲液（5.4）4.0mL，加入DNS 试剂（5.7）5.0mL，沸水浴加热5 分钟，用自来水冷却至室温，用水定容至25.0mL，制成标准空白样。

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A7.3 分别吸取上述浓度系列的木糖标准溶液各2.00mL（做两个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2mL 缓冲液（5.4）和5mLDNS 试剂（5.7）。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25mL。吸取缓冲液（5.4）4.0mL，加入DNS 试剂（5.7）5.0mL，沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，再用水定容至25mL，以标准空白样为对照调零，在540nm 处测定吸光度A 值。

A7.4 以木糖浓度为Y 轴、吸光度A 值为X 轴，绘制标准曲线。新配制或超时的DNS 试剂均需要重新绘制标准曲线。 A8 试样溶液的制备

A8.1 固体样品的反应用酶液制备

称样量称取试样两份，精确至0.0001g。加入40mL乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.4）。磁力搅拌30min，再用缓冲溶液（5.4）定容至100mL，在4℃条件下避光保存1-2h，然后以1000r/min 离心3-5min，取上清液，再用缓冲液（5.4）做适当稀释（稀释后的待测酶液中木聚糖浓度(mg/mL)酶的活力最好能控制在0.04—0.10U/mL 之间）。 A8.2 液体样品的反应用酶液制备

液体样品可以直接用缓冲溶液（5.4）进行稀释、定容（稀释后的酶液中木聚糖的活力最好能控制在0.04—0.10U/mL 之间）。如果稀释后酶液的pH 偏离5.50，需要用乙酸溶液（5.1）或乙酸钠溶液（5.2）调节至5.50，然后再用缓冲溶液（5.4）做适当稀释定容。 A9 测定步骤，按下表操作。

反应顺序

1．加入待测酶液于25mL 比色管中预热10 分钟 2．取10.00mL 底物37℃预热10 分钟 3．加入底物溶液 4．电磁振荡3-5s 5．37℃水解30min 6．加入DNS 终止液 7．电磁振荡3-5s 8．沸水浴5 分钟 9．自来水冷却至室温 10．加水定容至25mL 后摇匀 总体积

取反应液于540nm 波长下以空白为对照测定其吸光度。

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样品管 2.0 mL — 2.0 mL √ √ 5.0mL √ √ √ √ 25.0mL

空白管 2.0 mL — 2.0 mL(第二步)

√ √ 5.0mL(第一步)

√ √ √ √ 25.0mL

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A10. 试样酶活力的计算

XD??(AE?AB)?K?C0??1000?1.5 （1）

M?t式（1）中：

XD — 试样稀释液的木聚糖酶活力，U/mL； AE — 酶反应液的吸光度； AB — 酶空白样的吸光度； K — 标准曲线的斜率； CO — 标准曲线的截距；

M — 木糖摩尔质量，M(C5H10O5)=150.2g/mol； t — 酶解反应时间，min；

1000 — 转化因子，1mmol=1000umol。

1.5—是指底物Sigma(0672)与Sigma(4252)换算系数。

XD 值应在0.04—0.10U/mL 之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。

X?XD?DF (2) m式（2）中：

X — 试样木聚糖酶的活力，U/g或者U/mL； Df — 试样的总稀释倍数。 m— 称样量

酶活力的计算值保留三位有效数字。 A11. 重复性

同一样品两个平行测定值的相对误差不超过5.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值（保留三位有效数字）。

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附录B

β-葡聚糖酶活力的测定

(NY/T911-2004)

B1 应用范围

本标准规定了用分光光度法测定饲料添加剂中β-葡聚糖酶的活力。

本标准适用于饲料添加剂β-葡聚糖酶产品,也适用于添加有β-葡聚糖酶的浓缩饲料和添加剂预混合饲料。样品最低检出量为1.0U/g. B2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注册日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注册日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 B3 β-葡聚糖酶活力单位定义

在37℃、pH 为5.5 的条件下，每分钟从4mg/mLβ-葡聚糖溶液中降解释放1umol 还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U. B4 测定原理

β-葡聚糖酶能将β-葡聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS 试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中β-葡聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中β-葡聚糖酶的活力。 B5 试剂与溶液

除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682 中规定的三级水。 B5.1 葡萄糖溶液，c（C6H12O6）为10.0mg/mL： 称取无水葡萄糖1.000g，加水溶解，定容至100mL。 B5.2 乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L： 吸取冰乙酸0.60mL。加水溶解，定容至100mL。 B5.3 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L： 称取无水乙酸钠0.82g。加水溶解，定容至100mL。 B5.4 氢氧化钠溶液，c（NaOH）为200g/L： 称取氢氧化钠20.0g。加水溶解，定容至100mL。

B5.5 乙酸—乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOH—CH3COONa）为0.1mol/L,pH 值为5.5：

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称取无水乙酸钠14g，加入冰乙酸1.70mL。再加水溶解，定容至2000mL。测定溶液的pH。 如果pH 偏离5.50，再用乙酸溶液（5.2）或乙酸钠溶液（5.3）调节至5.50。 B5.6 β-葡聚糖溶液：浓度为8mg/mL 。

称取β-葡聚糖0.80g，加入10mL 无水乙醇，润湿β-葡聚糖2 分钟，再加入50mL 乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.5）。磁力搅拌，同时缓慢加热，直至β-葡聚糖完全溶解（注：在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过100mL）。然后停止加热，继续搅拌30min，用乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.5）定容至100mL。β-葡聚糖溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4℃避光保存，有效期为3 天。（如冷冻保存，有效期为60 天，使用前在4℃条件下解冻） B5.7 DNS 试剂

称取3，5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500mL，搅拌5s，水浴至45℃。然后逐步加入100mL 氢氧化钠溶液（5.4），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃）。在逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g，苯酚2.50g 和无水亚硫酸钠2.50g。继续45℃水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。用烧结玻璃过滤器过滤(孔径为0.45μm)。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7 天后可以使用，有效期为180d。 B6.仪器与设备

B6.1 分析天平：感量0.0001g。 B6.2 pH 计：精确至0.01。

B6.3 恒温水浴锅：温度控制范围在30—60℃之间，精度为0.1℃。 B6.4 分光光度计：能检测350-800nm 的吸光度范围。 B6.5 移液器：精度为1μL。 B7 标准曲线的绘制

B7.1 吸取贮备液（5.1）按下表配制成葡萄糖标准溶液 管号 1 2 3 4 5 6 7

取葡萄糖糖储备液体积(mL)

1 2 3 4 5 6 7

取乙酸—乙酸钠缓冲液体积(mL)

99 98 97 96 95 94 93

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葡萄糖浓度(mg/mL)

0.10

0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70

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B7.2 吸取乙酸-乙酸钠缓冲液（5.5）4.0mL，加入DNS 试剂（5.7）5.0mL，沸水浴加热5 分钟，用自来水冷却至室温，用水定容至25.0mL，制成标准空白样。

B7.3 分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00mL（做两个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2mL 缓冲液（5.5）和5mLDNS 试剂（5.7）。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25mL。吸取缓冲液（5.5）4.0mL，加入DNS 试剂（5.7）5.0mL，沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，再用水定容至25mL，以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度A 值。

B7.4 以葡萄糖浓度为Y 轴、吸光度A 值为X 轴，绘制标准曲线。新配制或超时的DNS 试剂均需要重新绘制标准曲线。 B8.试样溶液的制备

B8.1 固体样品的反应用酶液制备

按照附录A 中建议的称样量称取试样两份，精确至0.0001g。加入40mL 乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.4）。磁力搅拌30min，再用缓冲溶液（5.5）定容至100mL，在4℃条件下避光保存1-2h，然后以1000r/min 离心3-5min，取上清液，再用缓冲液（5.5）做适当稀释（稀释后的待测酶液中木聚糖酶的活力最好能控制在0.04—0.08U/mL 之间）。 B8.2 液体样品的反应用酶液制备

液体样品可以直接用缓冲溶液（5.5）进行稀释、定容。如果稀释后酶液的pH 偏离5.50，需要用乙酸溶液（5.2）或乙酸钠溶液（5.3）调节至5.50，然后再用缓冲溶液（5.5）做适当稀释定容。 B9 测定步骤，按下表操作。

反应顺序

1．加入待测酶液于25mL 比色管中预热10 分钟 2．反应底物37℃预热10 分钟 3．加入底物溶液 4．电磁振荡3-5s 5．37℃水解30min 6．加入DNS 终止液 7．电磁振荡3-5s 8．沸水浴5 分钟 9．自来水冷却至室温 10．加水定容至25mL 后摇匀 总体积

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样品管 2.0 mL — 2.0 mL √ √ 5.0mL √ √ √ √ 25.0mL

空白管 2.0 mL — 2.0 mL(第二步)

√ √ 5.0mL(第一步)

√ √ √ √ 25.0mL

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取反应液于540nm 波长下以空白为对照测定其吸光度。 B10 试样酶活力的计算

XD??(AE?AB)?K?C0??1000 （1）

M?t式（1）中：

XD — 试样稀释液中的β-葡聚糖酶活力，U/mL； AE — 酶反应液的吸光度； AB — 酶空白样的吸光度； K — 标准曲线的斜率； CO — 标准曲线的截距；

M — 葡萄糖摩尔质量，M(C6H12O6)=180.2g/mol t— 酶解反应时间，min；

1000—转化因子，1mmol=1000umol

XD 值应在0.04—0.08U/mL 之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。

X?XD?DF （2） m式（2）中：

X — 试样β-葡聚糖酶的活力，U/g或者U/mL； Df — 试样的总稀释倍数。 m— 称样量

酶活力的计算值保留三位有效数字。 B11 重复性

同一样品两个平行测定值的相对误差不超过5.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值（保留三位有效数字）。

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附录C

甘露聚糖酶活力的测定

(欧耐施企标）

C1 应用范围

本标准规定了用分光光度法测定饲料添加剂中甘露聚糖酶的活力。 本标准适用于饲料添加剂甘露聚糖酶产品。 C2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注册日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注册日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 C3 甘露聚糖酶活力单位定义

在37℃，pH 为5.5 的条件下，每分钟从浓度为3mg/mL 的甘露聚糖溶液中降解释放1umol 还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。 C4 测定原理

甘露聚糖酶能将甘露聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂发生显色反应。反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中甘露聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中甘露聚糖酶的活力。 C5.试剂与溶液

除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682 中规定的三级水。 C5.1 乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L： 吸取冰乙酸0.60mL。加水溶解，定容至100mL。 C5.2 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L： 称取无水乙酸钠0.82g。加水溶解，定容至100mL。 C5.3 氢氧化钠溶液，c(NaOH)为200g/L： 称取氢氧化钠20.0g。加水溶解，定容至100mL。

C5.4 乙酸—乙酸钠缓冲溶液，c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L，pH 为5.50

称取无水乙酸钠14g，加入冰乙酸1.70mL。再加水溶解，定容至2000mL。测定溶液的pH。 如果pH 偏离5.50，再用乙酸溶液（5.1）或乙酸钠溶液（5.2）调节至5.50。 C5.5 甘露糖储备溶液，浓度为10.0mg/mL：

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称取无水甘露糖1.000g，加缓冲液（5.4）溶解，定容至100mL。 C5.6 甘露聚糖溶液，浓度为6.0mg/mL

称取甘露聚糖0.60g (Sigma G0753)，加入90mL 水（75mL）,加热，磁力搅拌至甘露聚糖完全溶解。再用乙酸乙酸钠缓冲溶液（5.4）定容至100mL。如果pH 偏离5.50，再用乙酸溶液（5.1）或乙酸钠溶液（5.2）调节pH 至5.50，然后再用乙酸乙酸钠缓冲溶液（5.4）定容至100mL。使用前，适当摇匀。4℃避光保存，有效期为36h。 C5.7 DNS 试剂

称取3,5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500mL，搅拌5s，水浴至45℃。然后逐步加入100mL氢氧化钠溶液（5.3），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g 和无水亚硫酸钠2.50g。继续45℃水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。用烧结玻璃过滤器（孔径为0.45μm）.过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后可以使用，有效期为180d。 C6.仪器与设备

C6.1 分析天平：感量0.001g。 C6.2 pH 计：精确至0.01。

C6.3 恒温水浴锅：温度控制范围在30-60℃之间，精度为0.1℃。 C6.4 分光光度计：能检测350-800nm 的吸光度范围。 C6.5 移液器：精度为μL。 C7 标准曲线的绘制

C7.1 吸取贮备液（A5.5）按下表配制成木糖标准溶液 管号 1 2 3 4 5 6 7

取甘露糖储备液体积(mL)

1 2 3 4 5 6 7

取乙酸—乙酸钠缓冲液体积(mL)

99 98 97 96 95 94 93

甘露糖浓度(mg/mL)

0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70

C7.2 吸取乙酸-乙酸钠缓冲液（5.4）4.0mL，加入DNS 试剂（5.7）5.0mL，沸水浴加热5 分钟，用自来水冷却至室温，用水定容至25.0mL，制成标准空白样。

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C7.3 分别吸取上述浓度系列的甘露糖标准溶液各2.00mL（做两个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2mL 缓冲液（5.4）和5mLDNS 试剂（5.7）。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25mL。吸取缓冲液（5.4）4.0mL，加入DNS 试剂（5.7）5.0mL，沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，再用水定容至25mL，以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度A 值。

C7.4 以甘露糖浓度为Y 轴、吸光度A 值为X 轴，绘制标准曲线。新配制或超时的DNS 试剂均需要重新绘制标准曲线。 C8 试样溶液的制备

C8.1 固体样品的反应用酶液制备

按照附录A 中建议的称样量称取试样两份，精确至0.0001g。加入40mL 乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.4）。磁力搅拌30min，再用缓冲溶液（5.4）定容至100mL，在4℃条件下避光保存1-2h，然后以1000r/min 离心3-5min，取上清液，再用缓冲液（5.4）做适当稀释（稀释后的待测酶液中甘露聚糖酶的活力最好能控制在0.04—0.08U/mL 之间）。 A8.2 液体样品的反应用酶液制备

液体样品可以直接用缓冲溶液（5.4）进行稀释、定容。如果稀释后酶液的pH 偏离5.50，需要用乙酸溶液（5.1）或乙酸钠溶液（5.2）调节至5.50，然后再用缓冲溶液（5.4）做适当稀释定容。 C9 测定步骤，按下表操作。

反应顺序

1．加入待测酶液于25mL 比色管中预热10 分钟 2．反应底物37℃预热10 分钟 3．加入底物溶液 4．电磁振荡3-5s 5．37℃水解30min 6．加入DNS 终止液 7．电磁振荡3-5s 8．沸水浴5 分钟 9．自来水冷却至室温 10．加水定容至25mL 后摇匀 总体积

取反应液于540nm 波长下以空白为对照测定其吸光度。

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样品管 2.0 mL — 2.0 mL √ √ 5.0mL √ √ √ √ 25.0mL

空白管 2.0 mL — 2.0 mL(第二步)

√ √ 5.0mL(第一步)

√ √ √ √ 25.0mL

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C10. 试样酶活力的计算

XD??(AE?AB)?K?C0??1000 （1）

M?t式（1）中：

XD — 试样稀释液中的甘露聚糖酶活力，U/mL； AE — 酶反应液的吸光度； AB — 酶空白样的吸光度； K — 标准曲线的斜率； CO — 标准曲线的截距；

M — 甘露糖摩尔质量，M(C6H12O6)=180.2g/mol t— 酶解反应时间，min；

1000—转化因子，1mmol=1000umol

XD 值应在0.04—0.08U/mL 之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。

X?XD?DF （2） m式（2）中：

X — 试样甘露聚糖酶的活力，U/g或者U/mL； Df — 试样的总稀释倍数。 m— 称样量

酶活力的计算值保留三位有效数字。 C11. 重复性

同一样品两个平行测定值的相对误差不超过5.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值（保留三位有效数字）。

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附录D

纤维素酶活力的测定 (NY/T912-2004)

D1 应用范围

本标准规定了用分光光度法测定饲料添加剂中纤维素酶的活力。

本标准适用于饲料添加剂纤维素酶产品，含有纤维素酶添加剂预混料，样品最低检出量1.0U/g。 D2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注册日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注册日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 D3 纤维素酶活力单位定义

在37℃，pH 为5.5 的条件下，每分钟从浓度为4mg/mL 的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。 D4 测定原理

纤维素酶在一定温度和PH条件下，将纤维素底物(羧甲基纤维素钠)水解，释放出还原糖。在碱性、煮沸条件下，3,5一二硝基水杨酸(DNS试剂)与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖(以葡萄糖计)含量成正比。通过在540 nm测其吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶CMCA-DNS酶活力。以此代表纤维素酶的酶活力。 D5.试剂与溶液

除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682 中规定的三级水。 D5.1 乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L： 吸取冰乙酸0.60mL。加水溶解，定容至100mL。 D5.2 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L： 称取无水乙酸钠0.82g。加水溶解，定容至100mL。 D5.3 氢氧化钠溶液，c(NaOH)为200g/L： 称取氢氧化钠20.0g。加水溶解，定容至100mL。

D5.4 乙酸—乙酸钠缓冲溶液，c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L，pH 为5.50

称取无水乙酸钠14g，加入冰乙酸1.70mL。再加水溶解，定容至2000mL。测定溶液的pH。如果pH 偏离5.50，再用乙酸溶液（5.1）或乙酸钠溶液（5.2）调节至5.50。

D5.5 葡萄糖储备溶液，c(C5H10O5)为10.0mg/mL：称取无水葡萄糖1.000g，加缓冲液（5.4）溶解，

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定容至100mL。

D5.6 羧甲基纤维素钠溶液，浓度为8mg/mL

称取羧甲基纤维素钠（Sigma C5678)0.80g，再加入90mL水,加热，磁力搅拌至羧甲基纤维素钠完全溶解。用乙酸乙酸钠缓冲溶液（5.4）定容至100mL。如果pH 偏离5.50，再用乙酸溶液（5.1）或乙酸钠溶液（5.2）调节pH 至5.50，然后再用乙酸乙酸钠缓冲溶液（5.4）定容至100mL。使用前，适当摇匀。4℃避光保存，有效期为36h。 D5.7DNS 试剂

称取3,5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500mL，搅拌5s，水浴至45℃。然后逐步加入100mL氢氧化钠溶液（5.3），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g 和无水亚硫酸钠2.50g。继续45℃水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。用烧结玻璃过滤器过滤（孔径为0.45μm）。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后可以使用，有效期为180d。 D6.仪器与设备

D6.1 分析天平：感量0.001g。 D6.2 pH 计：精确至0.01。 D6.3 离心机：2000r/min 以上。

D6.4 恒温水浴锅：温度控制范围在30-60℃之间，精度为0.1℃。 D6.5 分光光度计：能检测350-800nm 的吸光度范围。 D6.6 移液器：精度为μL。 D7 标准曲线的绘制

D7.1 吸取贮备液（5.5）按下表配制成葡萄糖标准溶液 管号 1 2 3 4 5 6 7

取葡萄糖糖储备液体积(mL)

1 2 3 4 5 6 7

取乙酸—乙酸钠缓冲液体积(mL)

99 98 97 96 95 94 93

葡萄糖浓度(mg/mL)

0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70

D7.2 吸取乙酸-乙酸钠缓冲液（5.4）4.0mL，加入DNS 试剂（5.7）5.0mL，沸水浴加热5 分钟，用

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自来水冷却至室温，用水定容至25.0mL，制成标准空白样。

D7.3 分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00mL（做两个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2mL 缓冲液（5.4）和5mLDNS 试剂（5.7）。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25mL。吸取缓冲液（5.4）4.0mL，加入DNS 试剂（5.7）5.0mL，沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，再用水定容至25mL，以标准空白样为对照调零，在540nm 处测定吸光度A 值。

D7.4 以葡萄糖浓度为Y 轴、吸光度A 值为X 轴，绘制标准曲线。新配制或超时的DNS 试剂均需要重新绘制标准曲线。 D8 试样溶液的制备

D8.1 固体样品的反应用酶液制备

称样量称取试样两份，精确至0.0001g。加入40mL 乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.4）。磁力搅拌30min，再用缓冲溶液（5.4）定容至100mL，在4℃条件下避光保存1-2h，然后以1000r/min 离心3-5min，取上清液，再用缓冲液（5.4）做适当稀释。（稀释后的待测酶液中纤维素酶酶的活力最好能控制在0.04—0.08U/mL 之间）。 D8.2 液体样品的反应用酶液制备

液体样品可以直接用缓冲溶液（5.4）进行稀释、定容。如果稀释后酶液的pH 偏离5.50，需要用乙酸溶液（5.1）或乙酸钠溶液（5.2）调节至5.50，然后再用缓冲溶液（5.4）做适当稀释定容。 D9 测定步骤，按下表操作。

反应顺序

1．加入待测酶液于25mL 比色管中预热10 分钟 2．反应底物37℃预热10 分钟 3．加入底物溶液 4．电磁振荡3-5s 5．37℃水解30min 6．加入DNS 终止液 7．电磁振荡3-5s 8．沸水浴5 分钟 9．自来水冷却至室温 10．加水定容至25mL 后摇匀 总体积

取反应液于540nm 波长下以空白为对照测定其吸光度。

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样品管 2.0 mL — 2.0 mL √ √ 5.0mL √ √ √ √ 25.0mL

空白管 2.0 mL — 2.0 mL(第二步)

√ √ 5.0mL(第一步)

√ √ √ √ 25.0mL

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D10. 试样酶活力的计算

XD??(AE?AB)?K?C0??1000

M?t式（1）中：

XD — 试样稀释液中的甘露聚糖酶活力，U/mL； AE — 酶反应液的吸光度； AB — 酶空白样的吸光度； K — 标准曲线的斜率； CO — 标准曲线的截距；

M — 葡萄糖摩尔质量，M(C6H12O6)=180.2g/mol t— 酶解反应时间，min；

1000—转化因子，1mmol=1000umol

XD 值应在0.04—0.08U/mL 之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。

X?XD?DF （2） m式（2）中：

X — 试样纤维素酶的活力，U/g或者U/mL； Df — 试样的总稀释倍数。 m— 称样量

酶活力的计算值保留三位有效数字。 D11. 重复性

同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值（保留三位有效数字）。

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附录E 果胶酶活力的测定 （QB1502-1992)

E1 应用范围

本标准适用于以黑曲霉菌(Aspergillus niger)发酵法生产，经提纯制取而得的果胶酶制剂，可供食品工业生产作添加剂用.

本法适用于各种含有果胶酶的复合酶和液体酶及单酶的测定。 E2 活性单位定义

在50℃，pH3.5条件下，1h分解果胶产生1mg半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活单位，单位为U/g或U/mL。 E3方法原理

果胶酶水解果胶，生成半乳糖醛酸。 半乳糖醛酸具有还原性糖醛基，可用次亚碘酸法定量测定，以此来表示果胶酶的活性 E4试剂和溶液

E4.1. 果胶粉(Sigma公司出品):10mg/mL水溶液

称取果胶粉1.000g，精确至0.0002 g，加水溶解，煮沸，冷却。如有不溶物则需进行过滤。调pH3.5 用水定容至100 mL，在冰箱中贮存备用。使用时间不超过3d；

E4.2. 硫代硫酸钠标准溶液c(Na2S2O3)= 0.05 mol/L:按GB601配制与标定0.1mol/L溶液。使用时准确稀释一倍；

E4.3 碳酸钠溶液c(1/2Na2CO3)=lmol/LI按GB601配制;

E4.4碘标准溶液c(1/2 I2)=0.lmol/L:按GB601配制与标定，贮存于棕色瓶中;

E4.5硫酸溶液c(1/2H2S04)=2mol/I:取浓硫酸(d=1.84 )5.6mL,缓慢加人适量水中,冷却后用水定容至100mL，摇匀；

E4.6 可溶性淀粉指示液(10g/L):按GB 603配制； E4.7 0.1mol/L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液(pH=3.5)

甲液 : 称取柠檬酸(C6H8O7.H2O)21.01g，用水溶解并定容至1000mL；

乙液 : 称取柠檬酸三钠((C6H5Na3O7.2H2O)29.41 g，用水溶解并定容至1000mL； 取甲液 140mL、乙液60mL，混匀，缓冲液的pH应为3.5(用pH计调试) E5 仪器与设备 E5.1. 比色管 25mL；

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E5.2. 恒温水浴50±0.2℃

E5.3 容量瓶 25mL、50 mL、100mL、200mL、,250m1； E5.4 碘量瓶 250mL； E5.5 吸管1mL、5mL； E5.6 滴定管 25mL。 E5 试样溶液制备

E5.1 固体样品的反应用酶液制备

用已知质量的50mL小烧杯，称取样品1.000g,精确至0.0002g，以少量柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液(pH=3.5)溶解，并用玻璃棒捣研，将上清液小心倾人适当的容量瓶中，沉渣再加少量缓冲液，反复捣研3~4次，最后全部移人容量瓶，用缓冲液定容，摇匀，以四层纱布过滤，滤液供测试用； E5.2 液体酶样品反应用酶液制备

准确吸取浓缩酶液1.00mL于一定体积的容量瓶中，用柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液(pH=3. 5)稀释定容; 注：固体酶或浓缩酶液均需准确稀释至一定倍数，酶液浓度应控制在消耗0.05mol/l硫代硫酸钠标准溶液（A-B）之差在0.5-1.0ml范围内。必要时可先做预备试验。 E6 测定步骤，按下表操作 反应顺序

1．加入反应底物于25mL比色管中 2．加入PH=3.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液 3．反应底物50±0.2℃预热10 分钟 4．电磁振荡3-5s 5．50±0.2℃水解30min

6．立即取出，加热煮沸5min终止反应 7．冷却

8．取反应液于碘量瓶中 9．加入1mol/L碳酸钠溶液 10．加入0.1mol/L碘液 11.电磁振荡3-5s 12.放置暗处20min

13.取出，加入2mol/L硫酸溶液

样品管 5 mL 4mL √ 1 mL √ √ √ 5mL 1mL 5mL √ √ 2mL

空白管 5mL 5mL √ 0 mL √ √ √ 5mL 1mL 5mL √ √

2mL

14.用0.05mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定至浅黄色，加淀粉指示剂3滴，继续滴定至蓝色消失为其终点。

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E7试样酶活力计算

X?(A?B)?c?0.51?194.14?n??(A?B)?c?n?396.05式（1）中

X一样品的酶活力，U/g(U/mL)；

105?1?0.5 （1）

A一空白消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积,mL； B —样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积,mL； c一硫代硫酸钠标准溶液的浓度，mol/L ;；

0. 51一1毫摩尔硫代硫酸钠相当于0.51毫摩尔的游离半乳搪醛酸； 194.14一半乳糖醛酸的毫摩尔质量,mg； n 一酶液稀释倍数； 10—反应液总体积，mL；

5—滴定时取反应混合物的体积,m L；; 1—反应时加人稀释酶液的体积,mL; 0. 5—反应时间，h。 所得结果应表示至整数。

注: 果胶暂定用Sigma公司产品为标准底物。若购不到，使用其他厂产品时，必须做对照试验。 E8 结果允许误差

平行试验，滴定时消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积（毫升）不得超过0.05mL.

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附录F

α-淀粉酶活性测定方法 (GB/T24401-2009)

F 1 淀粉酶活力单位定义 中温α-淀粉酶

1g 固体酶粉（或1mL 液体酶），于60℃、pH =6.0 条件下，1h 液化1g 可溶性淀粉，即为一个酶活单位，以u/g(u/mL)表示。 耐高温α-淀粉酶

1g固体酶粉（或1mL液体酶），于70℃、pH=6.0条件下，1h液化1g可溶性淀粉，即为一个酶活单位，以u/g(u/mL)表示。 F 2 测定原理

α-淀粉酶能将淀粉分子链中的α-1，4 葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐消失，呈红棕色，其颜色消失的速度与酶活性有关，故可通过固定反应后的吸光度计算其酶活力。 F 3 应用范围

本法适用于各种含有α-淀粉酶的复合酶和液体酶及单酶的测定。 F 4 测定条件

F4.1 底物： 可溶性淀粉 F4.2 pH： 6.00

F4.3 温度： 60℃±0.2℃/70℃±0.2℃ F4.4 保温时间： 5min F 5 仪器 F 5.1 分光光度计 F 5.2 恒温水浴 60±0.2℃ F 5.3 秒表

F 5.4 试管 25mm×200mm F 5.5 分析天平：感量0.0001g F 6 试剂

F 6.1 原碘液称取碘11g、碘化钾22g，用少量水使碘完全溶解，然后定容至500mL，于棕色瓶中。 F 6.2 稀碘液吸取原碘液（6.1）2.00 mL，加碘化钾20g 用水溶解并定容至500mL，贮于棕色瓶中。

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F 6.3 20g/L 可溶性淀粉溶液 称取可溶性淀粉（以决干计）2.000g，精确至0.001g，用水调成浆状物，在搅动下缓缓倾入70mL 沸水中，然后，以30mL 水分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热至完全透明，冷却，定容100mL。此溶液需要当天配制。 注：可溶性淀粉采用酶制剂专用可溶性淀粉。

F 6.4 磷酸缓冲液（pH=6.0）称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）45.23g、一水柠檬酸（C6H8O7·H2O）8.07g，用水溶解并定容至1000 mL。配好后用pH 计校正。 F 7 样品制备

称取酶粉1~2g，精确至0.0002g（或吸取液体酶1.00mL），先用少量的磷酸缓冲液（6.4）溶解，并用玻璃搅拌棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3~4 次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀。通过四层纱布过滤，滤液供测定用。（（待测中温α-淀粉酶酶液酶活力浓度控制在3.4 u/mL—4.5 u/mL范围内。；待测耐高温α-淀粉酶活力控制酶浓度在60u/mL—65 u/mL范围内。） F 8 测定步骤，按下表操作：

反应顺序

1．加入底物溶液于比色管 2．加入缓冲液

3．混合，60±0.2℃预热8 分钟 （耐高温α淀粉酶70±0.2℃） 4．加入底物溶液 5．混匀

6．60℃水解5min （耐高温α淀粉酶70±0.2℃） 7．取反应液1mL 于盛有5mL 稀碘液比色管 8．混匀

反应管 20.0 mL 5.0mL √ 1.0mL √ √ √ √

以稀碘液做空白对照，在660nm 波长下测定其上述反应液的吸光度，根据吸光度查表A1，求得测试酶液的浓度（c）。 F 9 计算

中温α-淀粉酶酶活力 X=(c×n)/m （1） 式（1）中：

X——样品的酶活力，U/g（U/mL）； c——测试酶液的浓度，U/mL； n——样品的稀释倍数。

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m——试样质量，g。 所得结果表示至整数。 耐高温α-淀粉酶酶活力 X=(c×n×16.67)/m （2） 式（2）中：

X——样品的酶活力，U/g（U/mL）； c——测试酶液的浓度，U/mL； n——样品的稀释倍数。

16.67—根据酶活力定义计算的换算系数 m——试样质量，g。 所得结果表示至整数。 F10 结果的允许差

平行试验相对误差不得超过5%。

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表1 吸光度与测试α-淀粉酶酶浓度对照表 吸光度(A) 0. 100 0. 101 0.102 0. 103 0.104 0. 105 0. 106 0. 107 0. 108 0. 109 0. 110 0. 111 0. 112 0. 113 0. 114 0. 115 0. 116 0. 117 0. 118 0. 119 0. 120 0. 121 0. 122 0. 123 0. 124 0. 125 0. 126 0. 127 0. 128 0. 129 0. 130

酶浓度(c)／( u/mL) 吸光度(A) 酶浓度(c)/(u/mL) 吸光度(A) 酶浓度( c)/( u/mL) 4. 694 4. 689 4. 684 4. 679 4. 674 4. 669 4. 664 4. 659 4. 654 4. 649 4. 644 4. 639 4. 634 4. 629 4. 624 4. 619 4. 614 4. 609 4. 604 4. 599 4. 594 4. 589 4. 584 4. 579 4. 574 4. 569 4. 564 4. 559 4. 554 4. 549 4. 544 0. 131 0. 132 0. 133 0. 134 0. 135 0. 136 0. 137 0. 138 0. 139 0. 140 0. 141 0. 142 0. 143 0. 144 0. 145 0. 146 0. 147 0. 148 0. 149 0. 150 0. 151 0. 152 0. 153 0. 154 0. 155 0. 156 0. 157 0. 158 0. 159 0. 160 0. 161 4. 539 4. 534 4. 529 4. 524 4. 518 4. 513 4. 507 4. 502 4. 497 4. 492 4. 487 4. 482 4. 477 4. 472 4. 467 4. 462 4. 457 4. 452 4. 447 4. 442 4. 438 4. 433 4. 428 4. 423 4. 418 4. 413 4. 408 4. 404 4. 399 4. 394 4. 389 0. 162 0. 163 0. 164 0. 165 0. 166 0. 167 0. 168 0. 169 0. 170 0. 171 0. 172 0. 173 0. 174 0. 175 0. 176 0. 177 0. 178 0. 179 0. 180 0. 181 0. 182 0. 183 0. 184 0. 185 0. 186 0. 187 0. 188 0. 189 0. 190 0. 191 0. 192 4. 385 4. 380 4. 375 4. 370 4. 366 4. 361 4. 356 4. 352 4. 347 4. 342 4. 338 4. 333 4. 329 4. 324 4. 319 4. 315 4. 310 4. 306 4. 301 4. 297 4. 292 4. 288 4. 283 4. 279 4. 275 4. 270 4. 266 4. 261 4. 257 4. 253 4. 248

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续表1

吸光度(A) 酶浓度(c)／(u/mL) 吸光度(A) 酶浓度(c)/(u／mL) 吸光度(A) 酶浓度(c)/(u／mL) 0. 193 0. 194 0. 195 0. 196 0. 197 0. 198 0. 199 0. 200 0. 201 0. 202 0. 203 0. 204 0. 205 0. 206 0. 207 0. 208 0. 209 0. 210 0. 211 0. 212 0. 213 0. 214 0. 215 0. 216 0. 217 0. 218 0. 219 0. 220 0. 221 0. 222 0. 223 0. 224 0. 225 0. 226 0. 227

4. 244 4. 240 4. 235 4. 231 4. 227 4. 222 4. 218 4. 214 4. 210 4. 205 4. 201 4. 197 4. 193 4. 189 4. 185 4. 181 4. 176 4. 172 4. 168 4. 164 4. 160 4. 156 4. 152 4. 148 4. 144 4. 140 4. 136 4. 132 4. 128 4. 124 4. 120 4. 116 4. 112 4. 108 4. 105 0. 228 0. 229 0. 230 0. 231 0. 232 0. 233 0. 234 0. 235 0. 236 0. 237 0. 238 0. 239 0. 240 0. 241 0. 242 0. 243 0. 244 0. 245 0. 246 0. 247 0. 248 0. 249 0. 250 0. 251 0. 252 0. 253 0. 254 0. 255 0. 256 0. 257 0. 258 0. 259 0. 260 0. 261 0. 262 4. 101 4. 097 4. 093 4. 089 4. 085 4. 082 4. 078 4. 074 4. 070 4. 067 4. 063 4. 059 4. 056 4. 052 4. 048 4. 045 4. 041 4. 037 4. 034 4. 03 4. 026 4. 023 4. 019 4. 016 4. 012 4.009 4. 005 4. 002 3. 998 3. 995 3. 991 3. 988 3. 984 3. 981 3. 978 页 第 24

0. 263 0. 264 0. 265 0. 266 0. 267 0. 268 0. 269 0. 270 0. 271 0. 272 0. 273 0. 274 0. 275 0. 276 0. 277 0. 278 0. 279 0. 280 0. 281 0. 282 0. 283 0. 284 0. 285 0. 286 0. 287 0. 288 0. 289 0. 290 0. 291 0. 292 0. 293 0. 294 0. 295 0. 296 0. 297 3. 974 3. 971 3. 968 3. 964 3. 961 3. 958 3. 954 3. 951 3. 948 3. 944 3. 941 3. 938 3. 935 3. 932 3. 928 3. 925 3. 922 3. 919 3. 916 3. 914 3. 913 3. 912 3. 911 3. 910 3. 908 3. 906 3. 903 3. 900 3. 897 3. 894 3. 891 3. 888 3. 885 3. 881 3. 878 上海欧耐施生物技术有限公司—品控部

续表1

吸光度(A) 酶浓度(c)／(u/mL) 吸光度(A) 酶浓度(c)／(u/mL) 吸光度(A) 酶浓度( c)/( u/mL) 0. 298 0. 299 0. 300 0. 301 0. 302 0. 303 0. 304 0. 305 0. 306 0. 307 0. 308 0. 309 0. 310 0. 311 0. 312 0. 313 0. 314 0. 315 0. 316 0. 317 0. 318 0. 319 0. 320 0. 321 0. 322 0. 323 0. 324 0. 325 0. 326 0. 327 0. 328 0. 329 0. 330 0. 331 0. 332

3. 875 3. 872 3. 869 3. 866 3. 863 3. 860 3. 857 3. 854 3. 851 3. 848 3. 845 3. 842 3. 839 3. 836 3. 833 3. 830 3. 827 3. 824 3. 821 3. 818 3. 815 3. 812 3. 809 3. 806 3. 803 3. 800 3. 797 3. 794 3. 791 3. 788 3. 785 3. 782 3. 779 3. 776 3. 774 0. 333 0. 334 0. 335 0. 336 0. 337 0. 338 0. 339 0. 340 0. 341 0. 342 0. 343 0. 344 0. 345 0. 346 0. 347 0. 348 0. 349 0. 350 0. 351 0. 352 0. 353 0. 354 0. 355 0. 356 0. 357 0. 358 0. 359 0. 360 0. 361 0. 362 0. 363 0. 364 0. 365 0. 366 0. 367 3. 771 3. 768 3. 765 3. 762 3. 759 3. 756 3. 753 3. 750 3. 747 3. 744 3. 741 3. 739 3. 736 3. 733 3. 730 3. 727 3. 724 3. 721 3. 718 3. 716 3. 713 3. 710 3. 707 3. 704 3. 701 3. 699 3. 696 3. 693 3. 690 3. 687 3. 684 3. 682 3. 679 3. 676 3. 673 页 第 25

0. 368 0. 369 0. 370 0. 371 0. 372 0. 373 0. 374 0. 375 0. 376 0. 377 0. 378 0. 379 0. 380 0. 381 0. 382 0. 383 0. 384 0. 385 0. 386 0. 387 0. 388 0. 389 0. 390 0. 391 0. 392 0. 393 0. 394 0. 395 0. 396 0. 397 0. 398 0. 399 0. 400 0. 401 0. 402 3. 670 3. 668 3. 665 3. 662 3. 659 3. 656 3. 654 3. 651 3. 648 3. 645 3. 643 3. 640 3. 637 3. 634 3. 632 3. 629 3. 626 3. 623 3. 621 3. 618 3. 615 3. 612 3. 610 3. 607 3. 604 3. 602 3. 599 3. 596 3. 594 3. 591 3. 588 3. 585 3. 583 3. 580 3. 577 上海欧耐施生物技术有限公司—品控部

续表1

吸光度(A) 酶浓度(c)／(u/mL) 吸光度(A) 酶浓度(c)／(u/mL) 吸光度(A) 酶浓度(c)/( u/mL) 0. 403 0. 404 0. 405 0. 406 0. 407 0. 408 0. 409 0. 410 0. 411 0. 412 0. 413 0. 414 0. 415 0. 416 0. 417 0. 418 0. 419 0. 420 0. 421 0. 422 0. 423 0. 424 0. 425 0. 426 0. 427 0. 428 0. 429 0. 430 0. 431 0. 432 0. 433 0. 434 0. 435 0. 436 0. 437

3. 575 3. 572 3. 569 3. 567 3. 564 3. 559 3. 556 3. 554 3. 551 3. 548 3. 546 3. 543 3. 541 3. 538 3. 535 3. 533 3. 530 3. 528 3. 525 3. 522 3. 520 3. 517 3. 515 3. 512 3. 509 3. 507 3. 504 3. 502 3. 499 3. 497 3. 494 3. 492 3. 489 3. 487 3. 484 0. 438 0. 439 0. 440 0. 441 0. 442 0. 443 0. 444 0. 445 0. 446 0. 447 0. 448 0. 449 0. 450 0. 451 0. 452 0. 453 0. 454 0. 455 0. 456 0. 457 0. 458 0. 459 0. 460 0. 461 0. 462 0. 463 0. 464 0. 465 0. 466 0. 467 0. 468 0. 469 0. 470 0. 471 0. 472 3. 482 3. 479 3. 477 3. 474 3. 472 3. 469 3. 467 3. 464 3. 462 3. 459 3. 457 3. 454 3. 452 3. 449 3. 447 3. 444 3. 442 3. 440 3. 437 3. 435 3. 432 3. 430 3. 427 3. 425 3. 423 3. 420 3. 418 3. 415 3. 413 3. 411 3. 408 3. 406 3. 404 3. 401 3. 399 0. 473 0. 474 0. 475 0. 476 0. 477 0. 478 0. 479 0. 480 0. 481 0. 482 0. 483 0. 484 0. 485 0. 486 0. 487 0. 488 0. 489 0. 490 0. 491 0. 492 0. 493 0. 494 0. 495 0. 496 0. 497 0. 498 0. 499 0. 500 0. 501 0. 502 0. 503 0. 504 0. 505 0. 506 0. 507 3. 397 3. 394 3. 392 3. 389 3. 387 3. 385 3. 383 3. 380 3. 378 3. 376 3. 373 3. 371 3. 369 3. 366 3. 364 3. 362 3. 359 3. 357 3. 355 3. 353 3. 350 3. 348 3. 346 3. 344 3. 341 3. 339 3. 337 3. 335 3. 333 3. 330 3. 328 3. 326 3. 324 3. 321 3. 319 页 第 26

上海欧耐施生物技术有限公司—品控部

续表1

吸光度(A) 酶浓度(c)／(u/mL) 吸光度(A) 酶浓度(c)／(u/mL) 吸光度(A) 酶浓度(c)／(u/mL) 0. 508 0. 509 0. 510 0. 511 0. 512 0. 513 0. 514 0. 515 0. 516 0. 517 0. 518 0. 519 0. 520 0. 521 0. 522 0. 523 0. 524 0. 525 0. 526 0. 527 0. 528 0. 529 0. 530 0. 531 0. 532 0. 533 0. 534 0. 535 0.536 0. 537 0. 538 0. 539 0. 540 0. 541 0. 542

3. 317 3. 315 3. 313 3. 311 3. 308 3. 306 3. 304 3. 302 3. 300 3. 298 3. 295 3. 293 3. 291 3. 289 3. 287 3. 285 3. 283 3. 280 3. 278 3. 276 3. 274 3. 272 3. 270 3. 268 3. 266 3. 264 3. 262 3. 260 3. 258 3. 255 3. 253 3. 251 3. 249 3. 247 3. 245 0. 543 0. 544 0. 545 0. 546 0. 547 0. 548 0. 549 0. 550 0. 551 0. 552 0. 553 0. 554 0. 555 0. 556 0. 557 0. 558 0. 559 0. 560 0. 561 0. 562 0. 563 0. 564 0. 565 0. 566 0. 567 0. 568 0. 569 0. 570 0. 571 0. 572 0. 573 0. 574 0. 575 0. 576 0. 577 3. 243 3. 241 3. 239 3. 237 3. 235 3. 233 3. 231 3. 229 3. 227 3. 225 3. 223 3. 221 3. 219 3. 217 3. 215 3. 213 3. 211 3. 209 3. 207 3. 205 3. 204 3. 202 3. 200 3. 198 3. 196 3. 194 3. 192 3. 190 3. 188 3. 186 3. 184 3. 183 3. 181 3. 179 3. 177 0. 578 0. 579 0. 580 0. 581 0. 582 0. 583 0. 584 0. 585 0. 586 0. 587 0. 588 0. 589 0. 590 0. 591 0. 592 0. 593 0. 594 0. 595 0. 596 0. 597 0. 598 0. 599 0. 600 0. 601 0. 602 0. 603 0. 604 0. 605 0. 606 0. 607 0. 608 0. 609 0. 610 0. 611 0. 612 3. 175 3. 173 3. 171 3. 169 3. 168 3. 166 3. 164 3. 162 3. 160 3. 158 3. 157 3. 155 3. 153 3. 151 3. 149 3. 147 3. 146 3. 144 3. 142 3. 140 3. 139 3. 137 3. 135 3. 133 3. 131 3. 130 3. 128 3. 126 3. 124 3. 123 3. 121 3. 119 3. 118 3. 116 3. 114

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上海欧耐施生物技术有限公司—品控部

续表1

吸光度(A) 酶浓度(c)／( u/mL) 吸光度(A) 酶浓度( c)/( u/mL) 吸光度(A) 酶浓度(c)／( u/mL) 0. 613 0. 614 0. 615 0. 616 0. 617 0. 618 0. 619 0. 620 0. 621 0. 622 0. 623 0. 624 0. 625 0. 626 0. 627 0. 628 0. 629 0. 630 0. 631 0. 632 0. 633 0. 634 0. 635 0. 636 0. 637 0. 638 0. 639 0. 640 0. 641 0. 642 0. 643 0. 644 0. 645 0. 646 0. 647 3. 112 3. 111 3. 109 3. 107 3. 106 3. 104 3. 102 3. 101 3. 099 3. 097 3. 096 3. 095 3. 094 3. 092 3. 089 3. 087 3. 086 3. 084 3. 082 3. 081 3. 079 3. 078 3. 076 3. 074 3. 073 3. 071 3. 070 3. 068 3. 066 3. 065 3. 063 3. 062 3. 060 3. 058 3. 057 0. 648 0. 649 0. 650 0. 651 0. 652 0. 653 0. 654 0. 655 0. 656 0. 657 0. 658 0. 659 0. 660 0. 661 0. 662 0. 663 0. 664 0. 665 0. 666 0. 667 0. 668 0. 669 0. 670 0. 671 0. 672 0. 673 0. 674 0. 675 0. 676 0. 677 0. 678 0. 679 0. 680 0. 681 0. 682 3. 055 3. 054 3. 052 3. 051 3. 049 3. 048 3. 046 3. 045 3. 043 3. 042 3. 04 3. 039 3. 037 3. 036 3. 034 3. 033 3. 031 3. 03 3. 028 3. 027 3. 025 3. 024 3. 022 3. 021 3. 02 3. 018 3. 017 3. 015 3. 014 3. 012 3. 011 3. 01 3.008 3.007 3.005 0. 683 0. 684 0. 685 0. 686 0. 687 0. 688 0. 689 0. 690 0. 691 0. 692 0. 693 0. 694 0. 695 0. 696 0. 697 0. 698 0. 699 0. 700 0. 701 0. 702 0. 703 0. 704 0. 705 0. 706 0. 707 0. 708 0. 709 0. 710 0. 711 0. 712 0. 713 0. 714 0. 715 0. 716 0. 717 3.004 3.003 3. 001 3.000 2. 998 2. 997 2. 996 2. 994 2. 993 2. 992 2. 99 2. 989 2. 988 2. 986 2. 985 2. 984 2. 982 2. 981 2. 98 2. 978 2. 977 2. 976 2. 975 2. 973 2. 972 2. 971 2. 969 2. 968 2. 967 2. 966 2. 964 2. 963 2. 962 2. 961 2. 959

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续表1

吸光度(A) 酶浓度(c)／(u/mL) 吸光度(A) 酶浓度(c)／(u/mL) 吸光度(A) 酶浓度(c)／(u/mL) 0. 718 0. 719 0. 720 0. 721 0. 722 0. 723 0. 724 0. 725 0. 726 0. 727 0. 728 0. 729 0. 730 0. 731 0. 732 0. 733 0. 734

2. 958 2. 957 2. 956 2. 955 2. 953 2. 952 2. 951 2. 95 2. 949 2. 947 2. 946 2. 945 2. 944 2. 943 2. 941 2. 94 2. 939 0. 735 0. 736 0. 737 0. 738 0. 739 0. 740 0. 741 0. 742 0. 743 0. 744 0. 745 0. 746 0. 747 0. 748 0. 749 0. 750 0. 751 2. 938 2. 937 2. 936 2. 935 2. 933 2. 932 2. 931 2. 93 2. 929 2. 928 2. 927 2. 926 2. 925 2. 923 2. 922 2. 921 2. 92 0. 752 0. 753 0. 754 0. 755 0. 756 0. 757 0. 758 0. 759 0. 760 0. 761 0. 762 0. 763 0. 764 0. 765 0. 766 2. 919 2. 918 2. 917 2. 916 2. 915 2. 914 2. 913 2. 912 2. 911 2. 91 2. 909 2. 908 2. 907 2. 906 2. 905 页 第 29

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附录G 蛋白酶活性测定方法 （GB/T23527-2009福林法）

G 1 蛋白酶活力单位定义

1g 固体酶粉(或1mL 液体酶)，在一定温度和pH 值条件下，1min 水解酪蛋白产生1μg 酪氨酸为一个活力单位，以u/g(u/mL)表示。 G2测定原理

蛋白酶在一定温度和pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（FoLin）还原，生成钼蓝和钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。 G 3 应用范围

本法适用于饲料添加剂酶制剂测定。 G4 仪器设备

G4.1 紫外-可见光分光光度计 G4.2 恒温水浴 精度±0.2℃ G4.3 秒表

G4.4 分析天平：感量0.0001g G4.5 PH计精度为0.01PH单位 G5试剂和溶液 G5.1福林试剂的准备

于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2WO4.2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4.2H2O）25g，水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（LiSO4）50g，水50mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15min，以除去多余的溴（冷却后仍有绿色需要再加入溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，加水定容至1000mL，混匀，过滤。制得得试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。

使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。

G5.2 碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.4 mol/L称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4 g,用水溶解并定容至1000 mL。 G5.3 三氯乙酸c(CCl3·COOH)=0.4 mol/L 称取三氯乙酸65.4 g ，用水溶解并定容至1000 mL。 G5.4 氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L 按 GB 601 配制。 G5.5 盐酸溶液c(HCL)=1 mol/L 及0.1 mol/L 按 GB 601 配制。 G5.6 缓冲溶液

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a.磷酸缓冲液(pH=7.5)，适用于中性蛋白酶

称取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H2O)6.02 g 和磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)0.5 g，加水溶解并定容至1000 mL。

b.乳酸缓冲液(pH=3.0 ) 适用于酸性蛋白酶(1和2方法都可以）

1)称取乳酸(80%～90%)4.71 g和乳酸钠(70%)0.89g，加水至900mL，搅拌至均匀。用乳酸或者乳酸钠调整PH3±0.05；定容至1000mL。

2)甲液 称取乳酸（80%~90%）10.6g，加水溶解并定容至1000mL。 乙液 称取乳酸钠（70%）16g，加水溶解并定容至1000mL。

使用溶液 取甲液8mL，乙液1mL，混匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。 c.硼酸缓冲溶液(pH= 10.5) 适用于碱性蛋白酶

1)取硼酸钠(硼砂)9.54g和氢氧化钠1.6 g，加水至900mL，搅拌至均匀。用0.1mol/L盐酸溶液和0.05mol/L的氢氧化钠溶液，调整PH=10.5±0.05，定容至1000mL。 2)甲液 称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000mL。

乙液 称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000mL。(1和2方法都可以） 使用溶液 取甲液500 mL、乙液400 mL 混匀，用水稀释至1000 mL, 上述各种缓冲溶液，均须用pH 计校正。

G5.7 L0 g/L 酪蛋白溶液(注:3 酪素（酪蛋白）采用国药试剂和Sigma代替。)

称取标准酪蛋白（NICPBP国家药品标准物质）1.000 g，精确至0.001 g，用少量0.5 mol/L 氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3 滴)湿润后，加人适量的各种适宜pH 的缓冲溶液约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100 mL 容量瓶中，用适宜的pH 缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。 G5.8 100μg/mL L-酪氨酸

a. 称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000 g，精确至0.0002 g，用1mol/L 盐酸60mL 溶解后定容至100 mL，即为1 mg/mL 酪氨酸标准溶液。

b. 吸取 1 mg/mL 酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.L mol/L盐酸定容至100mL，即得到100 μg/mLL-酪氨酸标准溶液。 G6 分析步骤 G6.1 标准曲线的绘制

a)L-酪氨酸标准溶液：按照表G1配制，L-酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。

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表G1

酪氨酸标准溶液的浓度/

管号

（μg/mL）

0 1 2 3 4 5

0 10 20 30 40 50

（mL） 0 1 2 3 4 5

10 9 8 7 6 5

取100μg/mL酪氨酸标准溶液的体积/

取水的体积mL

b).分别取上述溶液各1.00mL（须做平行试验），各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.0mL，福林试剂使用液1.00mL，置于40℃±0.2℃水浴中显色20min，用分光光度计于波长680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度，以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度C为横坐标，绘制标准曲线（曲线应通过零点）。

c)利用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），既为吸光度常数K值。其K值应在95~100范围内。如不符合，需重新配置试剂，进行试验。 G7 待测酶液的制备

称取酶粉1～2g，精确至0.0002 g(或吸取液体酶1.00 mL) ，然后用相应的缓冲溶液溶解并稀释到一定浓度，推荐浓度范围为酶活力10U/mL~15U/mL。

对于粉状样品，然后用相应的缓冲溶液充分溶解，然后取滤液（慢速定性滤纸）稀释至适当的浓度。 G8测定步骤，按下表操作

反应顺序

1．加入待测酶液 2．40℃±0.2℃预热2 min 3．反应底物40℃±0.2℃预热3min 4．加入底物溶液 5．混匀

6．40℃±0.2℃水解10min 7．加入三氯乙酸终止液 8．混匀 9．静止10 分钟

10．过滤（慢速定性滤纸） 11．取滤液 12．加碳酸钠溶液

样品管 2.0 mL √ √ 2.0 mL √ √ 4.0 mL √ √ √ 1.0mL 5.0mL

空白管 2.0 mL √ √

2.0 mL （第二步）

√ √

4.0 mL （第一步）

√ √ √ 1.0mL 5.0mL

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13．加福林使用溶液 14．混匀

15．40℃±0.2℃显色20min 取反应液于680nm 波长下以空白为对照测定其吸光度。

1.0mL √ √ 1.0mL √ √ 1.398和166中性蛋白酶，除反应与显色温度为30±0.2℃外，其他操作同5.2，标准曲线也作同样处理。 G9计算

X?A1?V1?4?N11? （1）

m10式 (1) 中：

X—样品的酶活力，u/g(u/mL)；

A1—由标准曲线得出样品最终稀释液的活力，u/mL； V1—溶解样品所使用的容量瓶的体积，单位为毫升（mL)

4—反应试剂的总体积8mL，吸取酶液2.00 mL ，4=8/2，即1mL酶液反应总体积； N1—样品的稀释倍数 ； m—样品的质量，单位为克（g);

1—反应时间为10min,以1min计。 10所得结果表示至整数。 G 10 结果的允许差

平行试验测定值之差不得超过3%。

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附录G 蛋白酶活性测定方法

（GB/T23527-2009紫外分光光度法）

G 1测定原理

蛋白酶在一定的温度与pH 条件下，水解酪素酪蛋白生成酪氨酸，然后加人三氯乙酸终止酶反应，并沉淀未水解的酪蛋白，滤液中的酪氨酸对紫外分光光度法在275nm下进行测定。根据吸光度与酶活的比例关系计算其酶活力。

不同的蛋白酶酶制剂对其紫外法结果与福林法结果的换算系数不同。如需要，相关方可根据试验结果统计，确定两个方法的换算系数。 G2 仪器设备 同福林法中G4 G3试剂和溶液 同福林法中G5 G4分析步骤

按福林法表1 配制不同浓度的L-酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计测定其吸光度(A)，并计算K 值，(其K 值应在130～135 范围内)，如不符合，需重新配置试剂，进行试验。 G5待测酶液的制备

同福林法G7,样品稀释最终浓度应该在10U/mL~20U/mL范围之内。 G6 测定

操作同福林法G8中的取液、反应、静置沉淀，直至过滤[1~11操作步骤]。滤液用紫外分光光度计，在275nm波长下，测定吸光度。

注：如结果不平行，可以考虑将三氯乙酸的试样溶液返回到水浴中保温30min,然后再测吸光度。 G7计算

计算公式同福林法G9

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附录H

α-半乳糖苷酶活性测定方法

(奕农企标检测方法-Q/321322JSY007-2010）

H1范围

本标准规定了用比色法测定饲料添加剂中α-半乳糖苷酶的活力定义、产品分类、技术要求、试验方法、检验规则、标签、包装、运输、贮存和保质期等内容。

本标准适用于本公司生产、销售的以玉米淀粉为载体的饲料添加剂α-半乳糖苷酶产品，也适用于添加有本公司α-半乳糖苷酶的浓缩饲料和添加剂预混合饲料。样品最低检出量为1.0u/g。

H2.规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用本标准。 H3 α-半乳糖苷酶酶活力单位定义

在pH5.5，温度为37℃条件下，每分钟内从10mmol/L对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖中降解释放1μmol对硝基酚所需要的酶量为一个酶活单位U。 H4 测定原理

α-半乳糖苷酶能将对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖降解成对硝基酚。通过400 nm比色测定释放的对硝基酚的量，可以计算反应液中α-半乳糖苷酶的活力。 H5试剂与溶液

除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均符合GB/T 6682中规定的三级水。 H5.1 0.05 mol/L醋酸钠缓冲液：

A液：称取无水醋酸钠4.2 g定容至1000 mL； B液：冰醋酸3.0 mL定容至1000 mL。 用B液调节A液至pH5.5。 H5.2 0.2 mol/L碳酸钠溶液：

准确称取21.198 g无水碳酸钠，定容至1000 mL。 H5.3 对硝基酚标准溶：(10 mmol/ L)

称取0. 1391 g 对硝基苯酚，精确到0. 001 g，用碳酸钠溶液定容至100 mL，低温保存。

依次移取对硝基苯酚标准贮备液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、7 mL、9 mL，用碳酸钠溶液定容至100 mL，配成浓度为0.1 mmol/ L、0.2 mmol/ L、0.3 mmol/ L、0.4 mmol/ L、0.5 mmol/ L、0.7 mmol/ L、0.9 mmol/ L 的对硝基苯酚标准工作液。

H5.4 底物10 mmol/L对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖溶液：

称取3.031 g 对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖，用醋酸钠缓冲液定容至1000 mL，置棕色试剂瓶于4 ℃以下保存。 H6仪器与设备

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H6.1分析天平：感量为0.001 g。 H6.2 pH计：精确至0.01。 H6.3 离心机：2000 rpm以上。

H6.4恒温水浴锅：温度控制范围在30-60 ℃之间，精度为0.1 ℃。 H6.5分光光度计：能检测350-800 nm的吸光度范围。 H7标准曲线的绘制

吸取1 mL对对硝基酚标准溶液（H5.3）于试管中，加入1 mL醋酸钠缓冲液(H5.1)；对照的空白试管中加入2 mL醋酸钠缓冲液（H5.1）；在所有的试管中加入8 mL碳酸钠溶液(H5.2)，振荡，在400 nm处测定吸光度OD值。以对硝基酚浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。 H8试样溶液的制备

固体试样应粉碎或充分碾碎，然后过60目筛（孔径为0.25 mm）。称取固体样品1 g左右，用80 mL醋酸钠缓冲液浸泡，磁力搅拌30分钟，用醋酸钠缓冲液定容至100 mL，离心取上清液。 液体试样可以直接用醋酸钠缓冲液(3.1)进行稀释和定容。 当酶液的酶活在0.02 U/mL以内，测试结果较准确。 H9测定步骤，按照下表操作

反应顺序

1．加入待测酶液

2．37℃±0.2℃预热10 min 3．反应底物37℃±0.2℃预热10min 4．加入底物溶液 5．混匀

6．37℃±0.2℃水解10min 7．加入碳酸钠终止液 8．混匀 总体积

取反应液于400nm波长下以空白为对照测定其吸光度。 H10试样酶活力的计算

样品管 0.1 mL √ √ 0.1mL √ √ 0.8 mL √ 1mL

空白管 0.1 mL √ √

0.1 mL （第二步）

√ √

0.8 mL （第一步）

√ 1mL

XD??(AE?AB)?K?C0??Dfm?t (1)

式（1）中：

X — 试样α半乳糖甘酶的活力，U/g或U/mL； AE — 酶反应液的吸光度；

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AB — 酶空白样的吸光度； K — 标准曲线的斜率； CO — 标准曲线的截距； Df—试样总稀释倍数 m — 称取酶制剂试样量（g) t— 酶解反应时间，min； H11重复性

同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值（保留三位有效数字）。

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附录I

植酸酶活性测定方法 （GB/T18634—2009）

I 1 应用范围

本标准规定了用分光光度法测定饲料添加剂中植酸酶的活力。

本标准适用于饲料添加剂植酸酶产品，也适用于添加有植酸酶的配合饲料。方法最低定量限为0.13U/g。

I 2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注册日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注册日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 I 3 方法原理

植酸酶在一定温度和pH 条件下，水解底物植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生物。在酸性溶液中，能与钒钼酸铵会生成黄色的[(NH4)3PO4NH4VO3·16MoO3]复合物，在波长415nm 下进行比色测定。 I 4 活性单位定义

在温度37℃、pH 值5.50 的条件下，每分钟从浓度为5.0 mmol/L植酸钠溶液中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U 表示。 I 5 仪器

I 5.1 恒温水浴锅 37±0.1℃

I 5.2 分光光度计 415nm，1cm 比色皿 I 5.4 离心机 4000r/min I 6 试剂

I 6.1 磷酸二氢钾（KH2PO4） ：基准物。 I 6.2 0.25 mol/L乙酸缓冲液(I)：

c (CH3COONa·3H2O)为0.25mol/L：称取无水乙酸钠20.52g（三水乙酸钠:34.02g）于1000 mL容量瓶中，加入900 mL 水溶解，用冰乙酸调节pH 至5.50±0.01，并用蒸馏水定容至1000mL。室温下存放2个月有效。 I 6.3 乙酸缓冲液(Ⅱ)

c (CH3COONa·3H2O)为0.25mol/L：称取称取无水乙酸钠20.52g （三水乙酸钠：34.02g）， 0.5g 曲拉通X-100(Triton X-100)，0.5g 牛血清白蛋白（BSA）于1000mL 烧杯中，加入900mL 水

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