2009研究生分子医学实验技能实验二

中山医

中山医学院 生物化学与分子生物学教研室

生化与分子生物学技术

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操 作 流 程

质粒DNA提取原理与方法、 质粒DNA提取原理与方法、实验操作 提取原理与方法 纯化的质粒DNA(20µ 纯化的质粒DNA(20µl) 9月23日 月 日

(10 µl)酶切操作、保温(1-3h) 酶切操作、保温( 3h)

琼脂糖凝胶板的制备

9月30日 月 日

质粒DNA及酶切产物电泳( 1h) 质粒DNA及酶切产物电泳(约1h) DNA及酶切产物电泳

DNA的紫外分光光度法定量测定 DNA的紫外分光光度法定量测定

琼脂糖凝胶电泳结果观察

结果分析与问题讨论

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实验三：DNA的琼脂糖凝胶电泳 实验三：DNA的琼脂糖凝胶电泳 实验四：DNA的紫外分光光度法定量测定 实验四：DNA的紫外分光光度法定量测定

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实验三

DNA的琼脂糖凝胶电泳 DNA的琼脂糖凝胶电泳

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琼脂糖凝胶电泳法凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术。 凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术。根据制 DNA片段最常用的技术 备凝胶的材料: 备凝胶的材料: 琼脂糖电泳 凝胶 电泳 聚丙烯酰胺电泳

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一、琼脂糖凝胶电泳的功用琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方 片段的标准方 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化 法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法(如密度梯 该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法( 度离心法)所无法分离的 片段。 度离心法)所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入 片段 染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色 在紫外光下至少 染色,在紫外光下至少 染料溴化乙啶 染色 可以检出1-10ng的DNA条带 从而可以确定 的 条带,从而可以确定 可以检出 条带 从而可以确定DNA片段在凝胶 片段在凝胶 中的位置。此外 还可以从电泳后的凝胶中回收特定的 还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA 中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的 条带,用于以后的克隆操作。 条带 用于以后的克隆操作。 用于以后的克隆操作

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二、实验原理：核酸分子碱基几乎不解离， 在 pH 值为 8.0~8.3 时，核酸分子碱基几乎不解离， ~ 磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。 磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。 采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物， 采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作 用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳

动率出现较大 用下， 的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。 的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸 分子中嵌入荧光染料( 分子中嵌入荧光染料(如 EB )后，在紫外灯下可观察到 核酸片段所在的位置。 核酸片段所在的位置。

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三、琼脂糖电泳分离DNA的范围 琼脂糖电泳分离 的范围琼脂糖可以形成各种形状、大小的孔隙度。 琼脂糖可以形成各种形状、大小的孔隙度。琼脂糖凝 胶分离DNA片度大小范围较广 不同浓度琼脂糖凝胶可分 片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分 胶分离 片度大小范围较广 离长度从200bp至近 至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平 片段。 离长度从 至近 的 片段 装置在强度和方向恒定的电场下电泳。 装置在强度和方向恒定的电场下电泳。

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四、电泳指示剂： 电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种， 溴酚蓝( 核酸电泳常用的指示剂有两种 ， 溴酚蓝 ( bromophenol blue, Bb )呈蓝紫色；二甲苯晴( xylene cyanol, Xc )呈蓝色， 呈蓝色， 呈蓝紫色；二甲苯晴( 它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。 它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。 胶浓(%) 胶浓( ) 0.6 1 1.4 2 溴酚蓝 1kb 0.6kb 0.2kb 0.15kb/department/biochemistry

二甲苯青

2kb 1.6kb

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五、影响凝胶电泳的因素在电场中,在中性 值下带负电荷的 向阳极迁移,其迁 在电场中 在中性pH值下带负电荷的 在中性 值下带负电荷的DNA向阳极迁移 其迁 向阳极迁移 移速率由下列多种因素决定: 移速率由下列多种因素决定 1、 DNA的分子大小 、 的分子大小: 的分子大小 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速 分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速 线状双链 率与DNA分子量对数成反比。 分子量对数成反比。 率与 分子量对数成反比 2、 琼脂糖浓度 、 一个给定大小的线状DNA分子 其迁移速度在不同浓度 分子,其迁移速度在不同浓度 一个给定大小的线状 分子 的琼脂糖凝胶中各不相同。 的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶 电泳迁移率的对数与凝胶 浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于 分子的大小。 浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。 分子的大小/department/biochemistry

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3、 DNA分子的构象 、 分子的构象 分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和 当DNA分子处于不同构象时 它在电场中移动距离不仅和 分子处于不同构象时 分子量有关,还和它本身构

象有关。相同分子量的线状、 分子量有关 还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环 还和它本身构象有关 和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的 超螺旋 在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋 和超螺旋 在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的 DNA移动最快 而线状双链 移动最快,而线状双链 移动最慢。 移动最快 而线状双链DNA移动最慢。 移动最慢 4、 电源电压 、 在低电压时,线状 片段的迁移速率与所加电压成正比。 在低电压时 线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。 线状 片段的迁移速率与所加电压成正比 但电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。 但电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于 2kb的DNA片段的分辨率达到最大 所加电压不得超过 的 片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过 片段的分辨率达到最大 所加电压不得超过5v/cm。 。

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5、嵌入染料的存在 、 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌 染料会嵌 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的 入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其 ， 入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状 刚性更强,还会使线状 迁移率降低15%。 刚性更强 还会使线状DNA迁移率降低 %。 还会使线状 迁移率降低 6、 离子强度影响 、 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。 的电泳迁移率。 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响 的电泳迁移率 在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶 电导率最小 在没有离子存在时 如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小 如误用蒸馏水配制凝胶 电导率最小,DNA几 几 乎不移动,在高离子强度的缓冲液中 如误加 乎不移动 在高离子强度的缓冲液中(如误加 ×电泳缓冲液 则 在高离子强度的缓冲液中 如误加10×电泳缓冲液),则 电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或 变性。 电导很高并明显产热 严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。 严重时会引起凝胶熔化或 变性

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六、材料 前期实验中提取的质粒DNA和其酶切产物，琼脂糖 和其酶切产物， 前期实验中提取的质粒 和其酶切产物 琼脂糖(Agarose) 七、设备 水平式电泳装置,电泳仪 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外 电泳仪, 水平式电泳装置 电泳仪 微量移液枪 微波炉或电炉 紫外 透射仪或凝胶成像系统。 透射仪或凝胶成像系统。 八、 试剂 1、 5×TBE电泳缓冲液：称取 Tris 54g,硼酸 电泳缓冲液： 、 × 电泳缓冲液 ，硼酸27.5g,并 ， 加入 0.5M EDTA (pH8.0) 20ml,定溶至 ，定溶至100

0ml。 。 2、 6×电泳载样缓冲液：0.25% 溴粉蓝，40%(w/v) 蔗糖 、 ×电泳载样缓冲液： % 溴粉蓝， % 水溶液( 甘油), ),贮存于 ℃ 水溶液(或30 % 甘油),贮存于 4℃。 3、 溴化乙锭 溶液母液:将 配制成 配制成10mg/ml,用铝箔 、 溴化乙锭(EB)溶液母液 将EB配制成 溶液母液 用铝箔 或黑纸包裹容器,储于室温即可 储于室温即可。 或黑纸包裹容器 储于室温即可。/department/biochemistry

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九、操作步骤 1、 取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀释缓冲 液,待用。 2、 胶液的制备 胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部 熔化,取出摇匀,此为0.8%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动, 使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减 少水份蒸发。 3、 胶板的制备：将融化的琼脂冷却至50-60℃,而后到入制胶模 、 胶板的制备： 具(预先插上样品梳子)中，待胶完全凝固后拨出梳子 ，取出胶 块，放入加有0.5×TBE 电泳缓冲液的电泳槽内。/department/biochemistry

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4、 加样：取8µlDNA样品与2µl 6×载样液混匀,用微量移液 、 加样： 枪小心加入样品槽中。 5、 电泳 、 电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电 压保持在60-80V,电流在40mA以上。电泳方向由负极向正 极，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。 6、 染色 、 染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5µg/ml的EB 溶 液 中 , 室 温 下 染 色 5-10 分 钟 。 7、 观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染 色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可 辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或 有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。

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五 注意事项1 倒胶时把握好胶的温度，不要高于 ℃ ,否则温度太高会使 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃ 制板变形 2 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上， 坏点样孔 3 点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多 点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡， 4 Goodview有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔 有毒， 有毒 切勿用手接触，更不要污染环境， 5 紫外线照射不要太久

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