乙醇脱氢酶Ⅰ类基因全长cDNA的克隆与表达

?类乙醇脱氢酶(ADH)在乙醇的肝代谢中发挥重要作用,由ADH1、ADH2和ADH3组成。根据序列数据设计一对引物,利用RT-PCR同时克隆乙醇脱氢酶?类基因全长cDNA。测序后的cDNA被克隆在表达载体pTYB11上并在大肠杆菌中稳定表达。纯化获得的酶通过检测其在340nm处吸光值的变化进行酶活性

乙醇脱氢酶 类基因全长cDNA的克隆与表达

周文婷1，崔羽，王晓燕2，张永红，李世荣，李景鹏*

（东北农业大学生命科学与生物技术中心，哈尔滨 1500301；

哈尔滨医科大学附属第四医院检验科，哈尔滨 1500012）

摘 要： 类乙醇脱氢酶(ADH)在乙醇的肝代谢中发挥重要作用，由ADH1、ADH2和ADH3组成。根据序列数据设计一对引物，利用RT-PCR同时克隆乙醇脱氢酶 类基因全长cDNA。测序后的cDNA被克隆在表达载体pTYB11上并在大肠杆菌中稳定表达。纯化获得的酶通过检测其在340nm处吸光值的变化进行酶活性测定。经检测重组ADH1，ADH2和ADH3的酶活力分别为1.8± 0.3U/mg, 0.9±0.2U/mg和1.4±0.2U/mg。

关键词：乙醇脱氢酶（ADH）；基因克隆，原核表达；酶活力检测1

酒是重要的消费品。现已知乙醇及其代谢产物是包括癌症在内的许多疾病的重要诱因。乙醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase，ADH）是催化乙醇代谢初始反应的重要酶[1]。根据酶学及DNA/蛋白质序列上的差异，人类ADH被分为五类[2]，其中Ⅰ类ADH由ADH1、ADH2和ADH3组成，在乙醇代谢中发挥主要作用[3]。现已发现ADH2和ADH3位点均存在基因多态性，从而使所编码酶在乙醇代谢过程中表现不同的催化速率。一般认为编码高活性乙醇脱氢酶的等位基因ADH2*2和ADH3*1能够降低东亚人乙醇相关疾病的患病风险。

乙醇脱氢酶Ⅰ类基因的克隆已有很长时间[4]，然而国内尚无此类报道。由于该类基因的获得是深入进行其分子组成分析及结构研究的基础，本文中，我们以一对引物同时克隆该类基因，并在大肠杆菌中获得稳定表达。经检测，获得的重组酶具有较高的生物活性。

1. 材料与方法

1.1 材料与试剂

五月龄流产胎儿新鲜肝、肾组织，切小块液氮中急速冷冻，-80℃保存。E.coli ER2566、表达载体pTYB11及IMPACT -CN蛋白纯化系统购自NEB公司。限制性内切酶购自Takara。pGEM-T载体系统及M-MuLV 逆转录酶购自Promega。TRIzol试剂及NAD+氧化性辅酶Ⅰ购自Gibco。酵母醇脱氢酶标准酶制剂购自Sigma。

1.2 Ⅰ类乙醇脱氢酶基因cDNA的克隆及pGEM-T-ADH重组质粒的鉴定

按Trizol试剂说明书提取肝、肾总RNA。因该类基因具有约95%同源性，根据GenBank发布的该类基因多个mRNA序列同源区设计引物PⅠ 5’GAATTCATGAGCACA GCAG 3’ 和PⅡ ，各自带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点。按说明书*电子信箱：E-mail:ljingpeng@

?类乙醇脱氢酶(ADH)在乙醇的肝代谢中发挥重要作用,由ADH1、ADH2和ADH3组成。根据序列数据设计一对引物,利用RT-PCR同时克隆乙醇脱氢酶?类基因全长cDNA。测序后的cDNA被克隆在表达载体pTYB11上并在大肠杆菌中稳定表达。纯化获得的酶通过检测其在340nm处吸光值的变化进行酶活性

进行RT-PCR扩增，获得的cDNA与pGEM-T载体分别连接，重组质粒经EcoRⅠ /XhoⅠ双酶切初步鉴定。比较三个基因的限制性内切酶图谱发现，1-375范围内，ADH1在第171碱基处有一个KpnⅠ酶切位点，ADH3在第133碱基处有一个PstⅠ酶切位点，而ADH2在这两个位置无酶切位点。据此，设计引物PⅢ 5’CAATATGAGCACAGCAGGAAA 3’和PⅣ

5’CCACACTGAGGAGTAAAGAGC 3’进行PCR扩增并对扩增产物分别进行PstⅠ和KpnⅠ单酶切，对鉴定的重组子测序并对测序结果进行分析、比较。

1.3 ADH1-3基因cDNA的表达与纯化

重组载体pGEM-T-ADH与表达载体pTYB11分别经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切，获得的cDNA与表达载体连接后转化大肠杆菌ER2566，对含重组表达质粒的阳性菌进行双酶切鉴定。

在LB培养基(含100µg/ml Amp)中分别培养阳性菌及对照菌。培养物的OD600达到0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，16℃诱导表达8h。取诱导前后阳性菌及对照菌样品行SDS-PAGE电泳检测表达情况并按纯化系统说明书对表达的重组酶进行纯化。

1.4 纯化蛋白质含量的测定

以考马斯亮蓝染色法测定纯化的蛋白质的浓度。取8只试管，以结晶牛血清白蛋白为标准蛋白质，用0.15mol / L NaCl配制成1.3 mg / mL蛋白溶液，按表1进行平行操作，混匀，静止10min。1h内以0号管为空白对照调零，测得595nm处各管吸光度值，重复测定3次，取平均值。以吸光度为横坐标，标准蛋白浓度为纵坐标，绘制蛋白浓度-吸光度曲线。根据样品管（7号管）的吸光度值，得到三种纯化重组酶的蛋白质浓度（mg/mL）。

表1绘制标准曲线—试剂组成

Table 1 The protraction of the standard curve — the constitution of reagents

试剂 管号 0 1 2 3 4 5 6 7

0.15mol/L NaCl(ul) 25 21.1517.313.59.626 0 0 标准蛋白溶液(ul) - 3.857.7 11.5 15.3819 25 -

样品(ul) - - - - - - - 25

蛋白浓度 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.3

考马斯亮蓝试剂1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

（ml）

1.5 酶活力检测

以活性为300U/mg酵母醇脱氢酶为标准蛋白质，配制30U/ml酵母乙醇脱氢酶反应液。在25℃下，吸取pH7.5的100 mmol/L磷酸钠溶液0.5ml、33mmol/L乙醇溶液0.1ml、2.4mmol/L

，加入标准酶制剂0.1ml，立NAD+溶液0.1ml、蒸馏水2.2ml置于石英比色杯中（容量4ml）

即混匀，测定A340nm，以后每隔15s测一次，直至A340nm不变，记下反应时间和A340nm读数。于

?类乙醇脱氢酶(ADH)在乙醇的肝代谢中发挥重要作用,由ADH1、ADH2和ADH3组成。根据序列数据设计一对引物,利用RT-PCR同时克隆乙醇脱氢酶?类基因全长cDNA。测序后的cDNA被克隆在表达载体pTYB11上并在大肠杆菌中稳定表达。纯化获得的酶通过检测其在340nm处吸光值的变化进行酶活性

另一石英比色杯中，以蒸馏水代替底物，做空白试验。每分钟A340nm增加0.001为1活力单位。

分别取纯化的酶制剂0.1ml，按上面方法测定三种重组酶制剂的酶活力。重复测定3次。根据酶活力以酵母醇脱氢酶为标准比较计算三种重组酶制剂的酶活力。

2．结果

2.1 克隆载体及表达载体的构建与鉴定

PCR扩增获得的ADH1-3 cDNA大小为1187bp，纯化后分别与pGEM-T载体连接， EcoRⅠ /XhoⅠ双酶切初步鉴定重组子。以此重组子为模板，PⅢ和PⅣ为引物进行PCR扩增，均获得300bp大小片段。分别以PstⅠ和KpnⅠ对其进行消化，发现经PstⅠ酶切ADH1片段大小不变，KpnⅠ酶切后则产生170bp和130bp两条片段；ADH3经PstⅠ酶切产生164bp和136bp两条片段，KpnⅠ酶切后片段大小不改变；而ADH2片段在PstⅠ和KpnⅠ消化后，大小均为300bp（图1）。分析测序结果发现，与发表的ADH2 cDNA序列相比，获得的ADH2第946碱基处发生错配(G→A)，使第316位氨基酸由Glu变为Lys；而ADH1及ADH3序列与发表的ADH1及ADH3 cDNA序列完全相同，因此认为这三个基因cDNA已克隆成功，分别为ADH1,ADH2*2和

ADH3*2。将ADH1-3 cDNA定向克隆到表达载体pTYB11后，对其进行双酶切鉴定，证实cDNA已正确连接于表达载体中（图2）。

图1. pGEM-T-ADH重组子的特异性鉴定

Fig.1 Differentia identification pGEM-T-ADH recombinants

M：100bp ladder Marker；1,4,7分别为ADH1, ADH2和ADH3的300bp PCR产物；2,5,8分别为ADH1, ADH2和ADH3 PCR产物KpnⅠ单酶切结果；3,6,9分别为ADH1, ADH2和ADH3 PCR

产

物PstⅠ单酶切结果；

?类乙醇脱氢酶(ADH)在乙醇的肝代谢中发挥重要作用,由ADH1、ADH2和ADH3组成。根据序列数据设计一对引物,利用RT-PCR同时克隆乙醇脱氢酶?类基因全长cDNA。测序后的cDNA被克隆在表达载体pTYB11上并在大肠杆菌中稳定表达。纯化获得的酶通过检测其在340nm处吸光值的变化进行酶活性

图2. pTYB11-ADH重组载体EcoR I /Xho I双酶切鉴定

Fig.2 Two enzyme digestion of pTYB11-ADH recombinants.

M1：DL15000 Marker；1：pTYB11 双酶切结果；2,5,8分别为ADH1, ADH2和ADH3重组载体质粒；3,6,9分别为pTYB11-ADH重组载体双酶切结果；4,7,10分别为从pGEM-T-ADH中纯

化的ADH1-3 cDNA片段；M2：DNA Marker Ⅲ

2.2 重组酶的表达与纯化

由于与pTYB11内含肽/几丁脂结合域(55kDa)结合，表达的融合蛋白大小预期为95kDa。分别取IPTG诱导前后的对照菌与阳性菌样品，处理后经SDS-PAGE电泳，发现IPTG诱导的对照菌及阳性菌分别表达55kDa及95kDa大小片段，二者在诱导前则均无此大小片段。阳性菌经IMPACT -CN蛋白纯化系统纯化后均获得40kDa大小的重组酶，与报道相同[5] （图3）。

图3. 表达与纯化目的蛋白

Fig.3 Expressed and purified of the target protein

1：低分子量蛋白Marker；2. 未诱导的对照菌；3. 16℃下0.5m mol/L IPTG诱导8hr的对照菌；4.7.10.分别为未诱导的阳性菌 pTYB11-ADH1、pTYB11-ADH2和 pTYB11-ADH3；5.8.11.分别为16℃下0.5m mol/L IPTG诱导8hr的阳性菌pTYB11-ADH1、pTYB11-ADH2和

pTYB11-ADH3；6.9.12. 纯化的重组蛋白ADH1、ADH2和 ADH3

2.3 纯化的重组酶的蛋白质浓度

不同浓度的标准蛋白溶液与显色剂反应，测得的595nm吸光度值制成蛋白浓度标准曲线图。根据测定所得到的三种纯化酶制剂吸光度值，通过标准曲线得出纯化重组酶ADH1、

?类乙醇脱氢酶(ADH)在乙醇的肝代谢中发挥重要作用,由ADH1、ADH2和ADH3组成。根据序列数据设计一对引物,利用RT-PCR同时克隆乙醇脱氢酶?类基因全长cDNA。测序后的cDNA被克隆在表达载体pTYB11上并在大肠杆菌中稳定表达。纯化获得的酶通过检测其在340nm处吸光值的变化进行酶活性

ADH2和ADH3的蛋白质浓度范围分别是0.08～0.13mg/mL、0.06～0.11mg/mL和0.15～0.20mg/mL 。

2.4 酶活力检测

以酵母乙醇脱氢酶为标准蛋白，配制活性为30U/ml的酶反应液，浓度为0.1mg/ml。取该酶液0.1ml，按常规方法测定其酶活力，确定其酶活力为823±0.2活力单位。同样以此方法检测0.1ml纯化的三种重组酶活力，测定ADH1、ADH2和ADH3的酶活力分别为5活力单位、2活力单位和7活力单位。以酵母醇脱氢酶为标准比较计算三种重组酶制剂的酶活性，结果ADH1、ADH2和ADH3的酶活性分别为1.8±0.3U/mg、0.9±0.2U/ mg和1.4±0.2U/ mg。

3．讨论

当前，Ⅰ类乙醇脱氢酶成为乙醇相关疾病易感性分子机制研究中的热点，相关研究在国外起步较早，研究也较为透彻。因其表现基因多态性，亚洲人及其他人种中该类基因分布呈现显著差异，导致相关研究的侧重点不尽相同。在国外成功克隆该类基因十几年后，国内仍尚未有该类基因克隆的报道，因此，克隆并表达该类基因对我国今后相关工作的有效展开有重要的现实意义。

本实验中，我们根据mRNA同源区设计一对引物，同时获得该类基因全长cDNA，然后以一对特异引物简单有效地对其进行直接分离与鉴定。我们通过采用一种特殊的表达载体pTYB11及其配套的IMPACT 蛋白纯化系统实现了cDNA的稳定表达及纯化。在该载体中，目的蛋白的N-末端与含有内含肽和几丁脂结合域[9,10]的双功能标签融合，当存在DTT，β-巯基乙醇或半胱氨酸时，内含肽产生特异的自我裂解将目的蛋白从与几丁脂结合的内含肽标签上释放出来，无需使用蛋白酶，从而大大节省了成本并简化了操作。经酶活力检测，发现纯化的重组酶与成人肝组织分离的该类同工酶具有相似的活力，从而为今后进一步研究其功能及催化机制奠定了坚实基础。

参考文献

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4. Duester G, Hatfield GW, Buhlert R, et al. Molecular cloning and characterization of a cDNA for the beta subunit of human alcohol dehydrogenase. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1984, 81(13):4055-4059

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Cloning and Expression of the Full-length cDNAs Encoding

Human Class ⅠAlcohol Dehydrogenases

Zhou Wen-ting, Cui Yu, Wang Xiao-yan，Zhang Yong-hong, Li Shi-rong，Li Jing-peng (Life Sciences and Biotechnology Research Center, Northeast Agriculture University, Harbin,

150030, China)

Abstract

The classⅠAlcohol Dehydrogenases (ADH) play a key role in hepatic alcohol catabolism and contain ADH1, ADH2, and ADH3. Based on the sequence data, a pair of primers was designed and the full-length cDNAs encoding human ClassⅠADHs were cloned by RT-PCR at one time. After sequencing, they were subcloned in the plasmid pTYB11 and expressed in E. coli stably. ADH activity assay and kinetic analysis were monitored at 340 nm in an ultrospec 1000 spectrophotometer. The relative activity of recombinant enzymes metabolizing ethanol was1.8± 0.3 U/mg, 0.9±0.2 U/mg and

1.4±0.2 U/mg, respectively.

Keywords：Alcohol dehydrogenase (ADH), cDNA cloning, prokaryotic expression, enzyme assay

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/qt21.html