基因工程 - 图文

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基因工程

（GENETIC ENGINEERING）

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第一节 概 述

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基因工程技术的定义

用人工方法，提取或制备某种细胞的某种基因，在体外把它和一种载体连接构造杂种DNA分子，然后导入受体细胞，让其复制与表达，以改变受体细胞的某些性状或产生人们所需的产物的实验工程技术。

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DNA重组(DNA recombination)

DNA重组（DNA recombination）：不同来源的DNA分子末端通过磷酸二酯键共价连接，形成重新组合的DNA分子。 幻灯片5

克隆（clone）

克隆（clone）:由一个细胞经无性繁殖而形成的细胞群体。 幻灯片6

分子克隆(molecular cloning)

分子克隆（molecular cloning）:指建立单一的重组DNA的无性系的过程。即指在体外制备DNA，切割拼接成重组DNA，通过载体导入受体细胞，使重组DNA在受体细胞中扩增复制，形成单一DNA分子大量拷贝的过程。 幻灯片7

第一节 基因工程的发展史 幻灯片8

基因工程三大理论准备：

? 四十年代，Avery通过肺炎双球菌转化实验证明了DNA

? 是遗传物质，既是分子生物学的开端，也是基因工程的先导 。

? 2. 1953年，Watson和Crick的DNA双螺旋结构，奠定了分子生物学的基础，也为基

因工程打下了理论基础 。

? 3. 1961-1966年，Nirenbery等，破译64个遗传密码，编译 ? 出生命科学的密码本；阐述了遗传的中心法则

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幻灯片12 技术上的进步

1、1940年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯 化了限制性核酸内切酶HindⅡ，为基因工程打下了 最重要的技术基础。

2、1946年，Lederberg发现了细菌的性因子 –F因子， 细菌中独立于染色体外能自我复制的双链环状DNA即 质粒

1973年，Cohen用质粒作为运输重组DNA的工具，即 载体。载体的发现为基因工程诞生，提供了又一个重要 技术准备

3、1970年，Baltimore与Temine分别独立发现了逆转 录酶，补充完善了中心法则的同时，为真核表达基因 的制备成为可能。 幻灯片13

? 20世纪中期：发现限制性核酸内切酶和 DNA连接酶，实现DNA体外切割

和连接。

? 1972年，Berg用E.coRⅠ切割SV40DNA和λphageDNA，经过连接组成重组

的DNA分子。Berg是第一个实现DNA重组的人。

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美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子 幻灯片15

第一个取得基因工程成功的人－Cohen

1973年，Cohen Group将E.coli的tetr质粒psclol和nersrR6-3质粒体外限制酶切割，连接成一个新的质粒，转化E.coli，在含四环素和新霉素的平板上筛选出了terrNer,实现了细菌遗传性状的转移。这是基因工程史上的第一个克隆化并取得成功的例子，这一年被定为基因工程诞生的元年。 幻灯片16

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1997 英国罗林研究所成功的克隆了多莉

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克隆技术的应用前景

1.改良动物品种

2.挽救濒临灭绝的物种 3.培植人体皮肤 4.研制名贵药品 5.培育人体器官 幻灯片24

第二节 工具酶

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一、限制酶

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（一）限制酶的定义

限制酶(restriction enzyme): 一类专门切割DNA的酶。是一类能识别双链DNA分子中 的某种特定核苷酸序列，并与其特异结合，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。

“Restriction endonucleases are bacteria enzyme which cut (hydrolyze)DNA into defined and reproducible fragments . In bacteria they form part of the restriction—modification defense mechanism against foreign DNA. They are basic gene cloning tools .”

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（二）限制酶的发现

大肠杆菌的限制—修饰系统中，该系统由两种酶组成： 限制酶（分解和识别DNA的酶）

修饰酶（改变碱基结构，免遭限制酶分解）

甲基化修饰Am/Cm 两种酶作用于同一DNA的相同部位

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（三）限制酶的命名与分类

1.分类（根据酶的组成、所需辅助因子及裂解DNA的方式）： Ⅰ型R.E

复合酶：核酸内切酶、甲基化酶（修饰）、ATPase 识别序列: 特异性识别15bp

切割特点: 识别位点与切割位点不一致产生片段较大、 识别后,要移动100~1000bp切割。 Ⅲ型R.E

M.W和亚基组成类似Ⅰ类R.E，作用方式同 I 型。 Ⅱ型R.E

分子内部切割、特异性强、切割序列可知且固定。 幻灯片29

2、限制酶命名的原则

（1）以该菌株的属名的第一个字母及种名的头两个字母组成三个斜体字母的略语表示 （2）同一种细菌若有不同菌株，则在属名种名后再加上株名 （3）若一个菌株中有几种酶时，以罗马字加以区分

（4）同一属细菌种名头两个字母完全相同，其中一个菌的酶可改用词头后的另一个字母来代替

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限制酶命名举例：

第一个字母 该酶来源的细菌属名 大写英文字母 第二、第三个字母 该细菌的种名 小写英文字母 第四个字母 代表株名 罗马数字 同株、不同酶发现的先后次序

属 名 + 种 名 + 株 名 + 序号 （大.斜） (小.斜) (大/小.正) (正)

E- Escherichia H- Haemophilus （EcoR I）co- coli （Hin d Ⅲ）in- influenzae

R- RY13 d- Rd

I- 该株首次分离 Ⅲ- 该株第3次分离

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（四）限制酶的识别和切割位点

识别和切割位点： 识别： 4～6 碱基对，多具有回文结构（palindrom），少数识 别长序列或简并序列（有的核苷酸位点可以不同 ）。 EcoRI PstⅠ SmaⅠ 5′ GAATTC CTGCAG CCCGGG 3′ 3′ CTTAAG GACGTC GGGCCC 5′ 简并序列： GTYRAC—— Y=C/T R=G/A YR=CG/CA/TG/TA ∴ HindⅡ可识别4个特定序列 幻灯片32

（五）限制酶的切割方式

(1)识别序列内两条链上交错切割，产生单链突出的粘性末端 (2)对称处同时切断DNA的两条链，产生平端DNA片段 幻灯片33

（六）限制酶的切割结果

切割的结果：产生三种不同的末端

平末端— blunt end

5’突出— 5’- protruding （cohesive end ） 3’突出— 3’- protruding （overhang tail） 切割的化学本质：磷酸二酯键的断裂，

形成含5’— P和3’—OH 末端的两个DNA片段。

对一特定的DNA而言，识别序列碱基对少的，则切点数多，产生的片段小。 幻灯片34

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（七）同功异源酶（isoschizomers）

同裂酶(isoschizomer)：又称异源同工酶，是指来源不同，但能识别和切割同一位点，切割DNA后产生相同末端的一类限制酶。

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（八）同尾（裂）酶

有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同类型的粘性末端。 BglⅡ BamHⅠ

GGATCCCTAG

AGATCTCTAG

GATCC G

A

TCTAG

+

GATCT

A

+

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原核表达表达载体结构示意图

用T7 表达系统质粒的基本结构元件 幻灯片61

（三）原核表达载体的表达构件 ① 启动子（promoter） trp-lac启动子（tac）：杂合启动子，由trp启动子加lac操纵子中的操纵基因和SD序列融合而成。

如：tacI ： 由 Trp的－35P 区和 Lac O区

tac12：由Trp的－35P区、Lac O区、SD序列

（在lac阻遏蛋白高水平表达的lacIq 大肠杆菌菌株中，其转录可被抑制，加入异丙基硫代糖苷（IPTG）可诱导表达）

宿主菌：RB791/XL-1-blue/SB221/JM109 诱导表达：Lactose 或 IPTG 幻灯片62

T 7噬菌体启动子 表达效率高，需要特殊的受体菌。 宿主菌：如BL21（DE3），Jm109（DE3）带有lacUV5启

动子控制下的T 7噬菌体RNA聚合酶基因，为溶原 菌，可用IPTG诱导表达。 λ噬菌体PL启动子（温度敏感启动子）

该启动子受控于温度敏感的阻抑物cIts857. 温度诱导： cIts857在 37℃时， 阻抑转录

42℃时， 去阻遏，激活转录 宿主菌：E·coli M5219 (被缺陷型溶原λBPф感染后，含 有阻抑物cIts857的编码基因) PBV220/221（我国构建）

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②核糖体结合位点（ribosome-binding site，RBS ）

RBS包括SD序列 和AUG起密码子（或单指SD序列）

③转录终止序列（termination sequence）

多数表达载体含终止子序列，从几十到800碱基对的长度。

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(四)哺乳动物表达载体

原核序列（克隆用）+ 真核序列（表达用）

复制子 真核抗药基因+真核表达组件 抗药基因 （或真核复制起始点）

Promoter / Enhance + Cloning Site+Terminater + PolyA-adding Signal

① 启动子（promoter）

必须用真核启动子和增强子，但活性差异较大。常用病毒的 元件，如SV40病毒早期基因增强子、Rouse肉瘤病毒（RSV） 的LTR、人类巨细胞病毒（CMV）等 幻灯片65

②转录终止和加尾信号

真核细胞中转录后，准确地加poly（A）尾依赖于： poly（A）加尾信号 –AAUAAA

poly（A）位点及其下游的GC-rich区或U-rich区 真核表达载体必须含有上两部分，以弥补内源性序列本身的不足。

常用SV40的信号：237bp的BHI-Bcl I酶切位点片段，同时含有早期和晚期转录单位的切割和加polyA信号，两套信号作用相反，分别位于不同的DNA链上，对mRNA的加工均有效。

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真核表达载体的转录终止信号

TAA/G 10～30 bp 尾

转录—— AAUAAA ———— poly(A)100～200 100～1000bp

切割及加尾的必需条件：加poly(A)n信号及随后的U丰富区 ③其它

纯化表达载体： pRSET / pET/ pcDNA3.0～5.0 （ pRSET）： — P—TAG—His His His His His His—MCS—

Ni 柱分离

终止密码子 加尾信号 切断 幻灯片67

第四节 重组DNA技术的基本过程 重组DNA技术的应用目的： 克隆某个特定的基因 建立基因文库 cDNA文库

基因片段的亚克隆进行测序

构建表达载体以便在特定的细胞中表达某个基因

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重组DNA技术的基本步骤

重组DNA技术的基本步骤：

① 制备目的基因和相关载体

② 将目的基因和有关载体进行连接 ③ 将重组的DNA导入受体细胞

降解 ④ DNA重组体的筛选和鉴定

⑤ DNA重组体的扩增、表达和其它研究

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一、目的基因的制备（Isolation）

（一）建立基因组文库（genomic library） 采用限制酶将基因组DNA切成片段，每一个DNA片段都与一个载体分子拼接成重组DNA，然后将所有的重组体都引入宿主细胞并进行扩增，得到的分子克隆的混合体称为“基因文库”。从基因组文库中通过杂交筛选得到目的基因片段。 从细胞中分离基因组DNA、用Sau3A或MboI部分消化、回收大小在一定范围内的片段、构建重组体。 幻灯片70

（二）建立cDNA文库（cDNA文库）

将不同细胞类型或不同阶段 细胞的mRNA逆转录成cDNA 后，将所有cDNA混合体与载 体进行连接后，将所有的重组 体分子都引入宿主细胞并进行 扩增，所得到的分子克隆的混 合体称为 cDNA文库。

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（三）制备用于表达的基因片段

1. 直接用限制酶消化基因组 / 重组质粒 / 特定的cDNA文库获得目的基因片段，然后用电泳分离纯化。

2. 用PCR或RT-PCR技术体外扩增有关的DNA或cDNA片段。 3. 化学合成

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二、载体的选择和制备（Digestion）

（一）载体的选择（主要考虑以下5个条件） 1.有足够容纳目的基因的幅度

根据克隆外源DNA片段的大小选择合适的 载体 2.构建DNA重组体的目的

克隆选克隆载体，表达选表达载体 3.载体MSC中的酶切位点

根据克隆外源的酶切位点选择具有相同酶切位点的载体

4.根据受体细胞的类型确定表达载体的类型

5.载体克隆位点的阅读框要与目的基因的阅读框匹配

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（二）根据不同的用途选择载体

λ噬菌体和粘粒： 构建基因组文库 pUC系列：构建cDNA文库和小的重组体 M13噬菌体：克隆待测序的DNA片段

获得载体后，用适当的限制酶切割载体DNA分子，获得线形分子。尽量用与消化目的基因时相同的酶来切割载体，以便获得相同的粘末端，便于连接。

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（三）载体的制备的方法

1.碱变性法

2.羟基磷灰石柱层析法 3.释放法 4.酸酚法

5.溴乙锭-CsCl2密度梯度离心法 6. Kit-试剂盒法

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三、DNA分子的体外连接（Ligation)

（一）粘性末端连接： 用同一种酶或同裂酶裂解后，产生相同的粘性末端，很容易按照碱基配对的原则以氢键结合，在

T4DNA连接酶的作用下，共价闭合。

连接方式： 定向取代 双向插入（正向/反向） （双酶切） （单酶切）

措施：载体酶切后，用AP（碱性磷酸酶）水解5’端的磷酸基团防止载体的自身环化。 幻灯片76

DNA分子的体外连接示意图

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（二） 利用同裂酶：

载体和目的基因之间找不到共同的酶时，利用同裂酶原理 产生相同粘末端,可连接在一起.

例：Bam H I / Sau 3A I

Bgl II / Bam H I Sal I / Xho I Xhe I / Nhe I

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DNA分子的体外重组过程示意图

外源基因克隆入 质粒载体的过程

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（三）利用人工接头（linker）连接：

Hae Ⅲ 和 SmaI等切割DNA产生平末端，机诫力剪切产生平端，可采用linker连接。 幻灯片80

（四）加入同聚体尾（homopolymeric tail）连接

TdT：末端转移酶，可将某种单一脱氧核苷酸逐一加到 3’- OH上去。

底物：3’ 粘性突出末端

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（五）平端连接

不同方式产生的平端DNA片段可以在T4DNA连接酶的作用下，与某些限制酶产生的平端载体相连接。在连接时，所用的ATP及T4DNA连接酶的浓度要比连接粘末端的高些。

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（六） T-载体连接 （六） T-载体连接

Taq DNA polPCR扩增产物的3’端总要多加上一个以上A 的特征，与含有5’-T的载体相连。适用于PCR产物与载体的连接 幻灯片83

四、外源DNA导入受体细胞 受体细胞应具备下列条件:

1.安全宿主菌（或宿主细胞）在人肠道几无存活或存活率极低 2.限制酶缺陷型，外源DNA进入受体菌不被降解

3.重组缺陷型，保证外源DNA不与细菌基因组DNA重组，独立存在 4.能发展成感受态细胞的菌株

感受态：是受体菌能接受外源DNA能力的一种生理状态

感受态细胞：指经过一定方法处理后具备接受外源能力的一种生理状态 幻灯片84

（一） 转化（transformation）

定义： 将质粒或其它外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。 过程：细胞—低温CaCl2处理—感受态细胞—加重组DNA—42℃热休克—重组吸入细胞—复苏—涂板（含抗生素）—筛选转化菌落。 其它方法：电转化、PEG法等。 幻灯片85

重组DNA转化过程示意图

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（二） 感染（fection）

以噬菌体、粘粒和真核病毒为载体的重组DNA分子，体外经包装成为具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染相应的细胞，并在其中扩增。此过程又叫转导（transduction）。

感染效率》转化效率

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（三） 转染（transformation）

真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。

进入细胞的DNA可以整合到宿主基因组中，也可游离于染色体外存在和表达。 幻灯片88

五、目的基因的筛选和鉴定

涉及遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交和PCR方法 （一）遗传学方法

1.筛选转化菌： 所有的克隆载体均带有可供选择的遗传学标志或特征，如某种抗生素的抗性基因，为选择提供方便。 2.筛选带有重组体的克隆：

2-1 插入灭活（insertion inactivation）

适用于含>2个的抗性标记的质粒。例如pBR322，含Tetr（BamHI位点）和Ampr基因，外源DNA插入，使Tetr灭活。

用分别含Ampr 和Tetr的平皿同时筛选，可鉴定出重组子。 幻灯片89

插入失活示意图

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2-2 a –互补（ a- complementation）

某些质粒（如PUC系列），含有大肠杆菌的lacZ基因片段，在该基因区又有MCS，这些质粒将导入 lacZ- 的宿主菌中表达。

如果无外源基因插入：则质粒lacZ基因正常表达和宿主菌的lacZ基因互补，产生有活性的β –半乳糖苷酶，经IPTG诱导后，分解X-gal底物，产生blue clony。

如果有外源基因插入：则质粒编码的lacZ基因失活、菌体不可能互补产生β –半乳糖苷酶，产生white clony。 幻灯片91

a –互补筛选重组体示意图

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（二）免疫学方法

用表达产物的抗血清或McAb进行筛选

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（三）核酸杂交法—菌落原位杂交

从基因文库、cDNA文库或重组质粒中筛选目的基因的最有效的方法之一，它与目的基因的表达与否无关。 幻灯片94

（四）PCR技术

针对插入重组体中的目的基因，设计一对引物，进行菌落PCR，如能扩增出条带，则为阳性克隆。 幻灯片95

（五）酶切鉴定

挑选单个菌落—扩大培养—小量快速提取质粒—酶切（根据插入片段上的酶切位点选定）—分析有无插入片段、插入片段大小及数量、插入方向等。 幻灯片96

基因工程的基本过程

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第五节 克隆基因的表达 一、表达系统分类

按克隆基因与受体 细胞不同组合分为4类

1. 原核基因在原核细胞中表达，例基因工程生产各类工具 2. 原核基因在真核细胞中表达，如β-gal在昆虫细胞中表达 3. 真核基因在原核细胞表达，如IL-2,INF-γ等

4. 真核基因在真核细胞表达，如人β-干扰素和α-干扰素 在昆虫细胞中表达， α-干扰素在小鼠细胞表达 按受体细胞表达类型分2类

1、原核细胞表达系统（大肠杆菌、枯草杆菌等）

2、真核细胞表达系统（酵母、哺乳动物细胞及昆虫细胞） 幻灯片98

二、克隆基因在大肠杆菌中的表达 （一）真核基因与原核基因的差别

1、真核基因较大，有内含子，原核生物无剪接 内含子的功能

2、缺乏E.coli RNA聚合酶识别的启动子 3、无SD序列，不能与E.coli核糖体小亚基 16srRNA结合，不能翻译

4、真核蛋白易被E.coli蛋白酶水解 幻灯片99

（二）构建策略：

一）目的基因：表达真核基因必须克隆cDNA片段

表达分泌蛋白必须去除真核信号肽序列 ATG的5’端非编码区必须去除 二）载体选择：必须是大肠杆菌的启动子，能为大肠杆菌 RNA聚合酶所识别。

商用载体已含P和SD序列，无须构建。 启动子的条件：转录效率高和可调控

PL、tac、T7启动子能满足上述要求 幻灯片100

三）目的基因和载体的连接 3-1 非融合蛋白的表达：

插入载体的SD序列下游、可利用PCR引物的5’端、目的 片段的酶切/修饰/加接头等办法，引入NdeI（CATATG） /Nco（CCATGG）酶切位点，利用其中的ATG作为起始 密码子。

3-2 构建5’原核—真核3’融合蛋白（fusion protein） 表达载体：

优点为较稳定，不易被菌体蛋白酶水解；原核多肽部分 有利于分离纯化；原核部分可被水解；原核部分可加入 信号肽，构成分泌蛋白。

注意事项：读框漂移（frame shift） 幻灯片101

四）受体菌株和诱导条件

选择几种菌株，以获得最好的表达效率 根据启动子选择特定的菌株

PL 启动子 要求cIts857阻遏物、

T7 启动子 要求T7 噬菌体的RNA聚合酶

诱导条件根据启动子类型和表达蛋白质而定

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三、克隆基因在哺乳动物细胞中的表达

（一）目的基因：cDNA 或 genome DNA

（二） 载体：真核表达载体。先在原核中扩增、提取和纯化载 体、再导入哺乳动物细胞。 （三）真核细胞中重组体的抗性筛选标志：

neor 氨基糖苷磷酸转移酶（aph）失活 G418 hygr 潮霉素B磷酸转移酶失活 hydromycin B

（四）无须诱导启动子表达，但在不同的宿主细胞中的表达效 率不同。

（五）得到转染细胞后，可加药物培养并逐渐加大浓度，增加 选择压力，以增加目的基因的拷贝数。

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四、克隆基因在其它表达系统中的表达

（一）昆虫表达系统

优点：高等生物、高表达、产物修饰、生长速度快、悬浮培 养、不需CO2、规模大 1-1 果蝇表达系统（DES） 1-2 杆状病毒表达系统 （二）酵母表达系统

优点：真核单细胞生物、遗传背景清晰、产物修饰、易于培 养，价格便宜，是大规模生产真核重组蛋白的理想工具。 幻灯片104

第六节 真核细胞转染 一、真核细胞转染的基本方法和原理 （一）磷酸钙共沉淀法

（calcium phosphate co-precipitation）

DNA+Ca3（PO4）2 细胞摄取。转染效率可达1%。 筛选后，可得稳定的转化细胞株。 （二）电穿孔法（electroporation）

高频电流作用下，细胞膜出现许多小孔，使外源DNA进入，并整合，建立稳定细胞株。

（三）DEAE-葡聚糖法（DEAE-Dextran）

DEAE-Dextran带大量的正电荷，与负电荷的DNA磷酸基团结合，黏附于细胞表面，内吞入细胞。快速、简单，可用于外源基因的短暂表达研究。

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（四）脂质体（liposome）介导基因转入

原理：阳离子脂质体与带负电荷的DNA混合后，形成稳定的复

合物，加到细胞培养基中与细胞膜融合，DNA进入胞浆。 特点：方法温和，对细胞无损伤、效率高 转入的基因可表达但不整合。

（五）显微注射法（microinjection）

原理：物理直接注射的方法。要求细胞大、转移效率低。

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二、转染细胞的筛选

（一）药物筛选转染细胞

要求：用于筛选的选择标记基因应具有简单的显性遗传特性、 它们编码的酶能够破坏药物。

选择种类 编码蛋白 筛选药物 neo r 氨基糖苷磷酸转移酶 氨基糖苷抗生素G418

（geneticin） hyg r 潮霉素B磷酸转移酶 Hydromycin B dhfr 二氢叶酸还原酶（DHFR） 胺甲蝶呤（MTX）

tk 胸苷激酶（合成胸苷酸） 氨基蝶呤（抑制合成）

xgprt X-G磷酸核糖转移酶 霉酚酸（抑制de nove XGPRT（利用G合成X） GMP合成） 幻灯片107

（二）TK - 细胞突变株筛选转染细胞 氨基蝶呤（叶酸类似物） X de nove （补救途径）

DHFR thymidine hypoxanthine X dUMP tk X TMP THFR

tk 基因选择系统： TTP dATP /dCTP HAT选择培养基（hypoxanthine/aminopterin/thymidine） 宿主菌： tk- 缺陷株

目标：转染tk 基因，补救合成，细胞活。无tk 基因，细胞死。

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第七节 目的基因的定点诱变及其应用

基因定点诱变（site-directed mutagenesis） 一、基因定点诱变技术

（一）寡核苷酸介导的定点诱变法

原理： 在寡核苷酸引物中设计突变，在单链环状DNA分子为 模板，由klenow片段合成杂合双链，T4DNA连接酶闭合。转 化细胞后，由于环状M13 DNA分子复制的特点，可形成野生型 和突变型两种DNA分子以供筛选。 幻灯片109

实验步骤：

a. 目的DNA片段插入M13噬菌体载体 b. 以重组噬菌体制备单链DNA c. 设计和合成诱变寡核苷酸引物

d. 诱变寡核苷酸引物和靶单链DNA杂交（退火） e. 利用klenow片段进行延伸反应

f. T4DNA连接酶作用形成双链闭环DNA分子 g. 转化宿主菌

h. 筛选含诱变DNA片段的重组噬菌体

I. 以含诱变DNA片段的重组噬菌体制备单链DNA

j. 测序证明M13噬菌体DNA带有目标诱变而无其它诱变 k. 从重组M13噬菌体RF型DNA中回收诱变DNA片段， 克隆到其它载体中 幻灯片110

（二）PCR 定点诱变法

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三、基因定点诱变技术的应用

蛋白质工程 （一）长效胰岛素

（二）快速吸收的胰岛素

（三）增加与受体亲和力的胰岛素

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/qssx.html