谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研究

X X X大学

生物化学实验技术

生命科学学院

专业：X X X X X X X X X

姓名：X X X

2013/X/X

【摘要】 酶学研究是生物化学研究中的重要领域。谷胱甘肽转硫酶（Glutathion S-transferases，GSTs）是一类广泛存在于动物和人体各种组织中的参与解毒作用的同工酶家族,其中在哺乳动物肝脏中含量最高，约占肝可溶性蛋白的10 %。本实验利用亲和层析法纯化谷胱甘肽转硫酶，以1-氯-2,4-二硝基苯（ CDNB） 为底物，研究酶促反应动力学的特性，加深对酶促反应的特点的理解。利用分光光度法测定了 GST 的酶活力为0.089 IU，用考马斯亮蓝G-250染色法测定GST的比活力为11.125 μmol/min?mg，用直线作图法得出了 GST 的米氏常为0.26 mmol/L，最大速率0.029μmol/L?min。

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谷胱甘肽转硫酶的制备

及动力学研究

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谷胱甘肽转硫酶的制备及

动力学研究

【摘要】 酶学研究是生物化学研究中的重要领域。谷胱甘肽转硫酶（Glutathion S-transferases，GSTs）是一类广泛存在于动物和人体各种组织中的参与解毒作用的同工酶家族,其中在哺乳动物肝脏中含量最高，约占肝可溶性蛋白的10 %。本实验利用亲和层析法纯化谷胱甘肽转硫酶，以1-氯-2,4-二硝基苯（ CDNB） 为底物，研究酶促反应动力学的特性，加深对酶促反应的特点的理解。用分光光度法测定了 GST 的酶活力为0.089 IU，用考马斯亮蓝G-250染色法测定GST的比活力为11.125 μmol/min·mg，用直线作图法得出了 GST 的米氏常数为0.26mmol/L，最大速率0.029μmol/L·min。

【关键词】谷胱甘肽转硫酶；亲和层析；CDNB；酶活力；考马斯亮蓝G-250染色法；比活力；米氏常数。

【引言】 酶是生物体内的重要生物大分子，酶学也是当今生物化学研究的一个重要组成部分。对于酶的研究一般按照以下的策略：分离纯化；测定关键常数，即酶活力、米氏常数等；精细研究活性基团和关键结构域等。本实验以猪肝为实验材料，分离纯化GST 并测定其酶活力和米氏常数。

1.1亲和层析法原理

酶与酶的底物之间可以可逆地结合和分离，将酶的底物结合在亲和层吸柱上，使还有待分离物质的粗提物在有利于酶结合底物的条件下通过层析柱，可以使欲分离的组分吸附在柱上

[1]

。然后更换缓冲溶液使酶竞争性地从层析柱上洗

脱，达到纯化的目的。亲和层析法分离生物大分子示意图如下：

3

1.2 酶活力及其测定

在最适反应条件下，以1min 内催化生成1 μmol产物的酶量为一个酶活力单位，即1 IU = 1μmol/min。酶的比活力为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位，是酶纯度的重要标志

[2]

。本实验中，用CDNB 和还原型GSH 作为酶的底物，用分

光光度法记录酶促反应生成产物GS-DNB引起的光吸收增加值，通过在340nm连续测定反应过程中产物光吸收值的变化，做出光吸收—时间曲线，从而算出GST 的酶活力及比活力。

1.3 米氏方程及Km和Vmax 的测定 1.3.1 米氏方程

1913 年，Michaelis 和Menten 提出了底物浓度和酶促反应速率的关系式，即著名的米氏方程，式子中，v为反应的初速度，V 为最大反应速度，[S]为底物浓度，Km为米氏常数。不同的酶Km和 V不同，受底物、pH、温度、离子强度等因素的影响。

1.3.2 Km和Vmax 的测定

实验中，利用终止法

[3]

，即在酶和底物反应达到预定的时间（1min）时，立

即加入强酸终止酶促反应，在这段反应时间里产物的生成量基本呈线性增加，用这段反应时间内的平均速度代替反应初速度，作图求出Km和Vmax。本实验中，以GSH 和CDNB 为底物，但CDNB 的浓度很大，视为不变，GSH 的浓度变化符合米氏方程。下图为作图原理：

1.4考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白含量实验原理

考马斯亮蓝（G-250Coomassie brilliant blue G-250，CBG）测定蛋白质含量属于一种染料结合法

[4]

。CBG像指示剂，会在不同的酸碱度下变色：在酸性下

4

是茶色，在中性下为蓝色。当结合蛋白质后，因为蛋白质会为CBG提供一个较为中性的环境，因此会变成蓝色。游离状态考马斯亮蓝G-250的最大光吸收在465nm，CBG-蛋白质结合物最大光吸收在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内（10-1000ug/ml），CBG-蛋白质结合物的OD值595nm值与蛋白质含量成正比，故可用分光光度法进行蛋白质的定量测定。

2.材料与方法

2.1材料与试剂 2.1.1 材料

冰冻猪肝组织匀浆液、Sepharose 4B-GSH。 2.1.2 试剂

2.1.2.1 亲和层析GST

Buffer A：0.025mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4，含3mmol/L二硫苏糖醇（DTT），1mmol/L EDTA，0.2mol/L NaCl（1500mL）； Buffer B: 0.025mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4，含3mmol/L GSH，3mmol/L DTT（1000mL）。 2.1.2.2酶活力测定

60mmol/L CDNB：50ml（用1.5ml离心管分装，无水乙醇配置，棕色瓶内避光)； 60mmol/L GSH：50ml（用1.5ml离心管分装，重蒸水溶解)； 0.1mol/L PB (pH 6.5)； 50% TCA：100ml（用1.5ml离心管分装）。 2.1.2.3 蛋白质含量测定

0.25mg/mL标准蛋白溶液(牛血清蛋白)100mL；考马斯亮蓝G-250染色液：CBG 100mg溶于50ml 95％乙醇，加100ml 85％的磷酸，再用水定容到1L。 2.1.3 仪器

层析柱（1.5cm×20cm）、核酸-蛋白质紫外检测仪、便携式记录仪、722型可见分光光度仪、加样器（20、200、1000μL）、塑料注射器（1mL）、秒表、紫外分光光度计、比色皿（2个）、试管、吸量管等。

3 试验方法

3.1亲和层析法分离纯化GST：

3.1.1亲和层析介质Sepharose 4B-GSH的制备

（1）活化：称取10g Sepharose 4B，分别用100mL去离子水、0.5mol/L NaCl、

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去离子水淋洗，加入6.5mL 2mol/L NaOH、15 mL56%二氧六环和1.5mL 环氧氯丙烷，45℃恒温水浴摇动（160r/min），活化2-3h后，用100mL去离子水洗去活化剂；（2）偶联：将0.4 g GSH 溶于10mL去离子水中，用1mol/LNaOH调节pH7.6，将其加入凝胶中，密闭，37℃恒温水浴摇动（60r/min），偶联24ｈ后，分别用100mL去离子水、0.5mol/L NaCl的0.1mol/L乙酸缓冲液（pH4.5）、去离子水淋洗。残余的活化基团用40mL 1mol/L乙醇胺封闭过夜，用100mL去离子水淋洗，得到亲和层析介质GSH－Sepharose。

在碱性条件下，加入环氧氯丙烷和二氧六环活化，将GSH偶联到载体上，制成专一吸附剂

[5]

。

3.1.2 亲和层析柱的准备

将Sepharose 4B-GSH装柱，柱床体积约4-6mL(柱高约2-3cm)，连接蛋白检测系统，Buffer A平衡(约10-20 mL)，至记录仪基线平稳

[6]

。

3.1.3 上柱样品的制备

称4g猪的肝脏，剪碎并加入约10倍组织重的Buffer A，研磨至匀浆状态，匀浆液先用低速离心机离心10min，弃沉淀，上清再次离心（4℃，10000rpm，40min），弃沉淀，上清液用滤纸过滤，收集滤液。

3.1.4亲和层析柱分离GST

（1）上柱：将滤液上柱，流速约4-5秒1滴，这里适当降低流速有利于GST充分吸附；

（2）平衡：调整监测仪的灵敏度为2A，用Buffer A洗去杂蛋白至柱中介质变白，记录仪回到基线。收集透过液；

（3）洗脱：调整监测仪的灵敏度为0.2A，用Buffer B洗脱，流速约4～5秒1滴，收集洗脱峰（约5mL），分装成两管冷冻；

（4）回收：用100 mL蒸馏水冲洗柱子及检测仪，回收凝胶。

3.2 测定酶活力 3.2.1 调参测吸光度

调好紫外分光光度计，使其处于使用状态。取两个比色杯，分别加入磷酸盐缓冲液 、底物CDNB和GSH（60mmol/L），混匀。取两个比色杯（光程为1cm），

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按表1加入溶液在加酶液的同时按“Run”，立即将比色杯内的液体上下颠倒混匀后，放入分光光度计中进行测定。实验中按下表1加样操作：

表1 测定酶活力加样表

反应液

0.1mol/L的PBS (pH6.5)

60mmol/L CDNB 60mmol/L GSH

酶液

空白比色杯 2.9mL 50μL 50μL

混匀，放入分光光度计校零

0

x μL 测定比色杯 2.9mL 50μL 50μL

加入酶同时按“run”，立即混匀，进行反应

（2）酶液加入测定比色杯的反应体系中，立即混匀并同时开始计时，于340nm处检测其光吸收的变化，每隔30s读数一次，共3～5min至底物基本反应完全。做出时间-光吸收关系曲线

[7]

。从图中可以看到，反应速度只是在最初一段时间

内保持恒定，随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降，酶促反应速度以初速度为准。过原点作切线，在切线部分求出ΔA340nm/min。以1min内催化生成1μmol产物GS-DNB的酶量为一个酶活力单位（IU），即1U=1μmol/min。

3.2.3数据处理

做出时间-光吸收关系曲线，过原点做切线，求出ΔA340nm/min，计算酶活力。 酶活力的定义：在一定反应条件下，每分钟内催化1 μmol底物转化成为产物所需要的酶量为一个单位，即1IU = 1μmol/min。计算公式为：

GST活力单位(IU)??A?v??L式中ΔA为每分钟光吸收的变化值，v为酶促反应体积(3mL)，ε为产物的消光系数(9.6L/mmol·cm)，L为比色杯的光程(1cm)。

3.3酶比活力的测定（考马斯亮蓝法） 3.3.1制作标准曲线：

取6支试管，依次分别加入0、0.10、0.20、 0.30、0.40、0.50ml的牛血清蛋白溶液，用水补足到0.5ml，每管均再加5ml染色液，立即摇匀，室温下放置5分钟。然后测各管的OD595nm值，绘制标准曲线。加样如下表：

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表2 标准曲线加样表

编 号 标准蛋白(ml) 水(ml)

1(空白） 0.0 0.5

2 0.1 0.4 0.05 5 0.276

3 0.2 0.3 0.1 5

4 0.3 0.2 0. 15 5

5 0.4 0.1 0.2 5

6 0.5 0.0 0.25 5

酶液 0.5ml 0.025 5

蛋白浓度(mg/ml) 0.0 染色液(ml) OD值（595nm）

5 0

0.478 0.645 0.880 1.033 0.109

注意事项

1. 用移液管准确移取溶液，要求标准蛋白质用差量法，溶液尽量放入试管底部。 2. 注意加样顺序和平行操作。

3. 测定所加入的蛋白质的量应在标准曲线范围之内。

4. 加入乙试剂后，应迅速混匀（加1管混匀1管），避免乙试剂被破坏。

GST比活力(?mol/min?mg蛋白质)?酶活力单位测定酶活力所用蛋白质的量3.3.2 酶促反应速度的米氏常数Km及最大速率Vmax的测定

1．取6支试管，按下表依次加入CDNB、GSH（2mmol/L）、PB后，加入酶，同时用秒表计时，立即混匀，静置，1分钟时加入50%的TCA，混匀，终止反应；反应如下表：

表3 酶促反应加样表

反应液/编号 2mmol/L GSH/mL 60mmol/L CDNB/μL 0.1mol/L PB/mL 酶液/μL

0 0 50 2.85 50

1 0.15 50 2.70 50

2 0.30 50 2.55 50

3 0.60 50 2.25 50

4 1.20 50 1.65 50

5 2.40 50 0.45 50

反应1min时立即加入50%的TCA 100μL，混匀 ΔA340nm/min

0

0.085 0.093 0.206 0.229 0.261

2．调好分光光度计，方法同酶活性测定，以0试管溶液为参比溶液调零，测定其他各管的吸光值。

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4. 实验结果

4.1 亲和层析法纯化谷胱甘肽转硫酶

利用核酸-蛋白质紫外检测仪的数值变化，判断杂蛋白峰和GST 的洗脱峰。洗脱过程，数值趋于稳定，一定时间后有一个骤降，这是杂蛋白峰，然后数值会再次趋于缓慢上升并维持平衡一段时间在开始下降，则这个平衡期就是GST的洗脱峰。

4.2 酶活力测定

选择合适酶量,每隔30s记录1次分光光度计的OD值，使△A340nm/min在0.2-0.4之间,本次加酶液5ul。实验数据如下表所示： 时间（秒） A340 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 0.208 0.316 0.372 0.424 0.459 0.498 0.539 0.574 0.603 0.631 利用Excel作出时间-光吸收关系曲线图如下图所示：

在反应开始阶段的直线部分求出每分钟光吸收变化值，用Excel求出多项式方程，求出各点斜率，然后再作线性回归得到△A340nm/min=0.286,计算出酶的活性：GST活性单位（IU ）=0.286×3/9.6×1=0.089μmol/min.

4.3酶比活力的测定

用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，由表2数据得出蛋白标准曲线如下图：

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酶溶液所加体积应使酶蛋白含量在标准曲线范围之内,通过分光光度计测出酶液的OD值为0.109，由标准方程y = 4.0823x+0.0417可得出待测蛋白质溶液的浓度为0.016mg/mL,根据

酶活力单位GST比活力(?mol/min?mg蛋白质)? 测定酶活力所用蛋白质的量得出GST比活力=0.089/（0.016×0.5）=11.125μmol/min·mg.

4.4 终止法测定GST 对底物GSH 的Km 和V

结合表3数据可以得出米氏方程中的相关数据如下图所示：

2mmol/L GSH/mL 60mmol/LCDNB/μL 0.1mol/L PB/mL 酶液/μL 0 0 50 2.85 50 1 0.15 50 2.70 50 2 0.30 50 2.55 50 3 0.60 50 2.25 50 4 1.20 50 1.65 50 5 2.40 50 0.45 50 反应1min后加入50%的TCA 100μL终止反应 ΔA340nm/min [GSH]/ mmol/ L 1/[GSH]/L/mmol 1/v [GSH]/v/min 0 0 — — — 0.085 0.10 10 112.9 11.29 0.093 0.20 5 103.2 20.64 0.206 0.40 2.5 46.6 18.64 0.229 0.80 1.25 41.9 33.52 0.261 1.60 0.625 36.7 58.72 根据上表数据用双倒数作图法和Hanes作图法做图(图一、图二),从图中可求出Km、Vm值。

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Hanes-Woolf作图法如图二，其拟合曲线为：y=30.179X+9.8581。

图一：双倒数作图法

图二：Hanes-Woolf作图法

从双倒数图的横坐标得到Km=0.26mmol/L,纵坐标得到Vm=0.029umol/L·min。

5 结论与讨论

本次实验通过亲和层析法获得谷胱甘肽转硫酶，并对其进行动力学研究。GSTs在肝脏中含量最高，所以本次试验用猪的肝脏作为试验材料，通过亲和层析获得GST。通过实验结合作图求出相关方程，最终得出GST酶活力为0.089umol/min，酶的比活力为11.125μmol/min?mg。测定酶促反应速度的米氏常数Km为0.26mmol/L，V为0.029umol/L·min。

值得注意的是：酶促反应过程中，只有最初一段时间内反应速度与酶浓度成正比，随着反应时间的延长，反应速度即逐渐降低。反应条件的，如时间、温度、pH等，并在酶测定过程中保持这些反应条件的恒定，如温度不得超过规定温度

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的± 1℃，pH应恒定

[8]

。配制的底物浓度应准确且足够大，底物液中应加入不抑

制该酶活力的防腐剂并保存于冰箱中，以防止底物被分解。标本要新鲜，由于绝大多数酶可因久置而活力降低，标本如无法及时测定，应保存于冰箱中。用血浆时，应考虑到抗凝剂对酶反应的影响。有些酶在血细胞、血小板中的浓度比血清高，为此在采血、分离血清时，应注意防止溶血和白细胞的破裂。在测定过程中，所用仪器应绝对清洁，不应含有酶的抑制物，如酸、碱、蛋白沉淀剂等。

本次试验持续时间相对较长，步骤比较简单，但总的来说试验进行的比较

顺利，最终顺利的完成了试验，获得了所需的试验数据。但其中也存在一些可能的误差，总结主要有一下几个方面：

第一、终止法测定酶的比活力时，用反应开始1min 的平均速率代替初始速率。这一做法的合理性可以由测定酶活力的光吸收-时间曲线来验证。从光吸收-时间曲线可以看出，在反应开始的一段时间内曲线近似为一直线，所以可以用反应开始1min 内的平均速率近似代替初始速率，但事实上这二者之间还是有细微差别，会引起一定的误差。第二，终止法终止时的时间控制可能会造成一定的误差，例如加入终止液的时间精确程度以及溶液混匀终止的反应时间都会引起误差。第三，移液管的精度有限，会造成一定的加样的系统误差，但由于结果是有标准曲线确定的，所以造成的误差也不会很大。第四，实验中的仪器不稳也会造成误差，比如个别点的明显偏离就很可能是仪器突然不稳造成的。第五，数据处理误差，在求Km 和V 的实验中，用几种不同的方法得到的结果接近但并不相同，原因有以下几个方面：不同数据处理的方法会造成数据拟合时的精度不同，拟合程度高时较为精确；不同的数据处理方法会造成不同的有效数字取舍，从而精度不同；双倒数法和Hanes-Woolf 作图法都是微分作图法，对实验测定v 的精度要求较高，即几种方法对不同量的依赖程度不同，故而精度不同。

此外对于实验现象的几个讨论，亲和层析法纯化蛋白的实验中，在洗脱的尖峰出现之前，常会出现几个不稳定的小峰，这可能是由于一些与目的蛋白结合性质有一定相似的蛋白造成的，或者是上一步A 液洗脱是留下的少量杂蛋白。经过计算，酶液的酶活力与匀浆的酶活力相比没有很显著的提高，但比活力明显高于提纯前，这说明提纯的过程可能会使总的酶活力损失，这与提纯中酶的反复冻融和相关活性成分的去除有关。但是酶的比活力或者说有功能的酶的浓度会显著

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提高。

对于本次试验来说，实验之前要做好准备工作，对试验的整体思路要有一个大概的认识，要不然在做实验的时候就会感觉无从下手。但好在这是一个团队试验，有老师和同学的帮助，是整个试验比较轻松的完成了。每个人都按要求完成分部实验，时间安排合理，总体来说还不错！

6 参考文献

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