皮质下缺血性血管性疾病的MTHFR基因多态性_朱小群

中国神经精神疾病杂志 2010年 第36卷 第12期719

#论 著#

皮质下缺血性血管性疾病的MTHFR基因多态性

朱小群 刘际 赵晶晶 周江宁 孙中武

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=摘要> 目的 研究皮质下缺血性血管性疾病(subcorticalischemicvascualardisease,SIVD)与N5,N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolatereductase,MTHFR)基因C677T多态性的关系。方法 应用聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)技术和限制性酶切片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)分析技术检测46例SIVD患者和43名正常人的MTHFR基因C677T多态性。结果 SIVD组T/T型、C/T型基因频率分别为36196%、34178%,分别高于对照组(20193%、23126%)。SIVD组T等位基因频率明显高于对照组(分别为54135%、32156%,P<0101)。T/T型、C/T型患SIVD风险度较C/C型分别高31487倍(95%CI,111217~91993)和21954倍(95%CI,11045~81350)。结论 MTHFR基因T等位基因可能是SIVD的遗传易感因子,而C等位基因则具有一定保护作用,MTHFR基因C677T点突变与SIVD发病密切相关。 =关键词> N5,N10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性 皮质下缺血性血管性疾病 =中图分类号> R743,R749.1+3 =文献标识码> A

Methylenetetrahydrofolatereductasegenepolymorphismsinpatientswithsubcorticalischemicvasculardis-ease.ZHUXiaoqun,LIUJi,ZHAOJingjing,ZHOUJiangning,SUNZhongwu.DeptofNeurology,HospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022,China.Te:l0551-2922328.

=Abstract> Objective Tostudytheassociationbetweensubcorticalischemicvasculardisease(SIVD)andmeth-ylenetetrahydrofolatereductasegene(MTHFR)polymorphisms.Methods MTHFRgeneC677Tpolymorphismswerede-terminedin46patientswithSIVDand43controlsusingpolymerasechainreaction(PCR)andrestrictionfragmentlengthpolymorphism(RFLP).Results ThefrequencyofMTHFRC677ThomogenetictypeandheterogenetictypeinSIVDgroupwere36196%and34178%respectively,whichwerehigherthanthoseinthecontrolgroup(20193%and23126%).Thefrequencyofthe677TallelewasmuchhigherinSIVDgroupthaninthecontrolgroup(54135%and32156%respectively,P<0101).TherelativeriskofSIVDassociatedwiththeT/T,C/TgenotypeversustheC/Cgenotypewas31487(95%CI,111217~91993)and21954(95%CI,11045~81350).Conclusions TheTallelecontributestogeneticsusceptibilityforSIVDwhiletheCalleleisaprotectivefactorforSIVD.TheMTHFRC677TgenepolymorphismiscloselyassociatedwithSIVD.

=Keywords> Methylenetetrahydrofolatereductasegenepolymorphism Subcorticalischemicvasculardisease

theFirstAffiliated

皮质下缺血性血管性疾病(subcorticalischemicvascualardisease,SIVD)是指由于颅内小血管病变(多发性腔隙性梗死、腔隙状态)和血管狭窄或/和脑部血液低灌注状态(脑白质疏松、Binswanger病)而导致的,以血管性认知功能损害或痴呆为主要表现的一组疾病

[1]

脉粥样硬化的一项独立危险因素,与心血管疾病和脑血管疾病发病密切相关

[2]

。MTHFR基因677位点的

碱基C被碱基T置换,其编码的丙氨酸被缬氨酸取代,导致酶活性下降,血清Hcy水平增高。MTHFR基因作为痴呆的一个候选基因成为近年研究的一个热点关

[4]

[3]

。

。高半胱氨酸或同型半胱氨酸血症(Hhcy)是动我们的前期研究发现Hhcy与SIVD的发病密切相

。因此,我们利用PCR-RFLP技术对SIVD和对照组的MTHFR基因多态性进行检测,进一步探讨MTH-FR基因多态性与SIVD的关系。

m

国家/973计划0项目子项目(编号:2007CB512306);安徽省自然科学基金项目(编号:090413121);安徽医科大学第一附属医院博士科研启动基金

*

v

安徽医科大学第一附属医院神经内科(合肥 230022)通讯作者(E-mai:lsunzhwu@)中国科学技术大学生命科学院

1 材料与方法

1.1 研究对象 SIVD组入组标准

[5]

:¹高危人群:包

神

720ChinJNervMentDis Vo.l36,No.12 Demcember2010

经心理学评估:应用简易精神智能检查量表(min-imentalstateexamination,MMSE)、临床痴呆量表(clin-i

caldementiarating,CDR)、老年抑郁量表(thegeriatricdepressionscale,GDS)测试。认知功能损害评定标准:MMSE标准为文盲[17分,小学[20分,中学或以上[24分(文盲组、小学以中学或以上的评分折算如文盲17分=24分),且CDR>015;»神经影像学检查(MRI):广泛脑室旁和脑深部白质损害,多发性腔隙性梗死。SIVD组排除标准:¹早期出现明显记忆障碍和进行性记忆衰退;º头MRI未发现相应的脑血管疾病的证据。对照组入组标准:¹神经心理学评估无异常;º头MRI未发现相应的脑血管疾病的证据。

SIVD组46例,其中男35例,女11例,平均年龄(69189?8191)岁,平均受教育程度(7175?4114)年;对照组43名,其中男21名,女22名,平均年龄(64119?11104)岁,平均受教育程度(8158?4187)年。以上研究对象全部来自安徽医科大学第一附属医院,均为随机选择、无血缘关系的汉族人。病例组和对照组均签署知情同意。

1.2 研究方法 标本基因组DNA的制备采用TaKa-Ra(宝生物工程大连有限公司)提供DNA抽提试剂盒,按说明书中提供的实验步骤进行。

PCR扩增反应:PCR反应体系体积为25LL,5LLDNA,2mMdNTP1LL,引物对2LL,10@PCR缓冲液215LL,Taq聚合酶0125LL,蒸馏水14125LL。PCR反应条件为94e预变性5min,94e60s,60e30s,72e60s,共30个循环。72e延伸7min。

RFLP分析:¹HinfI内切酶消化产物:取10LLPCR产物,10@buffer2LL,H2O7LL,HinfI酶1LL,37e水浴过夜;º12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析酶切产物:取10LL酶切产物加入12%PAGE负极端的加样孔,以溴酚蓝为指示剂,溴化乙锭(EB)为染色剂,在80V电压下电泳90min,360nm紫外线灯下观察带型并予定型,标准分子量对照为DL2000Markers。引物的设计及合成:引物设计参照有关文献

[3]

CCCGAAGC-3c,下游引物P25c-AGGACGGTGCGGT-GAGAGTG-3c。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0进行统计学分析。病例组与对照组基因型构成的差异用µ检验;两组间MMSE评分差异用Studentt检验;应用Logistic回归分析,采用比值比(OR)评价不同基因型对疾病的影响,并计算其95%的可信区间(95%CI)。检验水准A=0105。

2

2 结果

2.1 总体认知功能损害情况 SIVD组MMSE评分(24163?4135),对照组为(27119?2102),两组间统计学处理有统计学差异(P=01001)。

2.2 基因型判定 经PCR扩增后MTHFR基因目的片段大小为246bp,根据酶切情况,MTHFR基因型有3种:T纯合T/T基因型有246bp一条带,C纯合C/C基因型有174bp、72bp两条带,杂合型C/T基因型有246bp、174bp、72bp三条带。

2.3 MTHFR基因型及等位基因频率 见表1。由表1可知,SIVD组与对照组基因型均有统计学差异(µ

2

=71023,P=01030)。SIVD患者中MTHFR基因C/T、T/T基因型频率高于对照组,与SIVD存在正关联;而C/C基因型频率则明显低于正常人,与SIVD存在负关联。SIVD组中MTHFR基因等位基因C的频率为45165%,T等位基因频率为54135%;与对照组的C等位基因67144%、T等位基因32156%比较有统计学差异(µ=41286,P=01038)。

2.4 MTHFR基因多态性致SIVD效应 Logistic回归分析结果显示:变量基因型的Waldµ=61805,P=01033,说明3种不同基因型在SIVD组与对照组之间的差异有统计学意义。以C/C型作为哑变量,检验结果表明SIVD组与对照组之间C/T型与C/C型的差异有统计学意义(P=01041),OR=21954,95%CI:11045~81350;SIVD组与对照组之间T/T型与C/C型的差异也有统计学意义(P=01020),OR=31487,95%CI:11217-91993。以T/T型作为哑变量,SIVD组与对照组之间的C/T型与T/T型的差异无统计学意义(P=01773)。

2

2

,其序列为上游引物P15c-CAAAGGCCAC-

Table1 ComparisionofthedistributionofMTHFRgenotypeandallelegenotypebetweenSIVDgroupandcontrolgroup

表1 SIVD组与对照组MTHFR基因型频率与等位基因频率的分布

Groups组别SIVDgroupSIVD组Controlgroup对照组

n4643

ThefrequencyofMTHFRgenotypeMTHFR基因型频率(%)C/C28.26(13)55.81(24)

1)

Thefrequencyofallelegenotype等位基因频率(%)

C45.65(21)1)67.44(29)

T54.35(25)32.56(14)

1)

C/T34.78(16)1)23.26(10)

T/T36.96(17)1)20.93(9)

1)Comparedwiththecontrolgroup,P<0105 与对照组比较,P<0105

中国神经精神疾病杂志 2010年 第36卷 第12期721

3 讨论

Hcy浓度升高的原因有遗传和环境营养两种因素,去除各种环境营养因素,代谢酶的基因突变引起其缺陷或活性下降是导致Hcy升高的主要原因。MTH-FR将N,N-亚甲基四氢叶酸还原为甲基四氢叶酸,后者作为Hcy再甲基化甲硫氨酸的甲基供体。MTH-FR基因定位于染色体1p363上,cDNA全长22kb。Hinf位点限制性内切酶片段长度多态性系cDNA序列上第677位核苷酸CyT突变,产生1个Hinf限制性内切酶识别序列,这一变化造成编码的氨基酸由丙氨酸变成缬氨酸,这种突变造成MTHFR活性下降,导致Hcy水平增高

[3]

5

10

管性疾病有所不同。Pollak等

[11]

研究发现:VaD、AD、

正常对照组间平均血浆Hcy值无显著差异,MTHFRT/T型以及T等位基因在3组间也无显著区别,故认为MTHFRC677T突变并未增加VaD和AD的患病风险。Zuliani等

[12]

通过对60例VaD、45例AD、54例正常对

照的MTHFR基因多态性研究发现,3组之间MTHFR基因多态性分布也无显著性差异,因而认为MTHFR基因多态性分布与VaD、AD发病无关。

我们的结果表明:SIVD组与对照组MTHFR基因频率分布不同。SIVD组与对照组T等位基因频率、C等位基因频率相比较有统计学意义。采用比值比(OR)来评价不同基因型对疾病的影响时,我们发现3种不同基因型致SIVD效应上存在着统计学差异(P=01033)。SIVD和对照组之间C/T型与C/C型的差异有统计学意义;SIVD和对照组间T/T型与C/C型的差异也有统计学意义。但SIVD和对照组间的C/T型与T/T型的差异无统计学意义(P>0105)。从上述结果可以看出,MTHFR基因C/T型、T/T型患SIVD风险度较C/C型分别高21954和31487倍,提示T等位基因可能是SIVD的遗传易感因子,而C等位基因则具有一定保护作用,进一步支持MTHFR基因C677T点突变与SIVD发病密切相关。

不足之处在所难免。本研究样本量偏小,最好能将SIVD再分成多发性腔隙梗死、缺血性脑白质疏松、腔隙性梗死合并脑白质疏松3组进行研究,观察3组中Hcy水平,以及MTHFRC677T等位基因变化情况。

将来,我们进行的随访研究将有助于进一步观察基线水平Hcy、MTHFR基因多态性、适当使用药物降低Hcy水平等方面对SIVD向VaD转化的影响。

参

考

文

献

。

[6]

有关MTHFR基因多态性与痴呆和老化之间的关系报道较多。Regland等

研究发现,MTHFR基因突

变后导致不耐热MTHFR(MtTHFR)产生,从而导致酶活性下降和Hcy升高,MTHFR基因多态性和携带ApoE-4等位基因协同作用可导致阿尔茨海默病(Alzhemierpsdisease,AD)发生。日本学者等对100名60岁以上人群进行了检测,结果发现存在MTHFR基因C677T突变的痴呆患病率显著高于非突变患者,其中7例男性痴呆患者中有5例为MTHFRT/T型且与痴呆的严重程度有关。

近年来有几项研究探讨MTHFR基因型与血管性痴呆(vasculardementia,VaD)的关系,但结果不一。McIlroy等

[8]

[7]

。

MTHFR基因C677T突变不仅与老年期痴呆发病有关,

研究发现:AD、VaD、中风患者血浆Hcy均

较对照组显著升高;尽管携带MTHFRT等位基因时可显著增加VaD和中风后痴呆患病风险,但MTHFR基因型并不影响血浆Hcy水平。因此作者认为:血浆Hcy升高与中风、AD、VaD发病密切相关,但这种影响与其他血管危险因素、营养状况、MTHFR基因型等无关。Hassan等

[9]

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[5] RomanGC,ErkinjunttiT,WallinA,eta.lSubcorticalischemic

vasculardementia[J].LancetNeuro,l2002,1(7):426-436.[6] ReglandB,BlennowK,Germg¼rdT,eta.lTheroleofthepoly-nmlre将颅内小血管病(cerebralsmallvessel

disease,SVD)分成两种类型,即多发性腔隙性梗死和缺血性脑白质疏松。结果发现:SVD血清Hcy水平较对照组显著升高,且Hcy水平高低与多发性腔隙性梗死和缺血性脑白质疏松的关系均密切相关,尤以后者为甚;MTHFR基因677T等位基因仅是缺血性脑白质疏松的危险因子。

但Chapman等

[10]

通过对41例VD患者、49例AD

患者和40名对照组MTHFR基因多态性研究发现,VD患者与AD和对照组相比,其MTHFR基因多态性分布,

722

ductaseinthedevelopmentofdementiaoftheAlzheimertype[J].DementGeriatrCognDisord,1999,10(4):245-251.[7] NishiyamaM,KatoY,HashimotoM,

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[9] HassanA,HuntBJ,OpSullivanM,eta.lHomocysteineisarisk

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[10]ChapmanJ,WangN,TrevesTA,CE,MTHFR,factorV

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(收稿日期:2010-03-31)

(责任编辑:李 立)

(上接第718页)

二酸为正常值的619倍(分析值:0.62,基准值:0.001),即予维生素B12肌注,14周时复查尿血中的甲基丙二酸浓度,并做血同型半胱氨酸、氨、乳酸、氨基酸、酯酰肉碱谱分析,结果示:血代谢蛋氨酸7.6LmoL/L,丙酰肉碱水平升高(5.04mmoL/L),游离肉碱水平极低(7.52mmoL/L),乙酰/游离肉碱比1.5,丙酰/游离肉碱比0.67,符合/甲基丙二酸血症,继发性肉碱缺乏症0。继续给予维生素B12、叶酸、左旋肉碱补充治疗,补充甜菜碱,奥氮平2.5mg/d维持治疗。第18周时上述代谢指标改善,患者精神症状明显改善,自知力部分恢复,粗测记忆力及计算力正常,一般常识可。但表情仍显欣快,仍稍跛行。出院修正诊断:/脑损害和功能紊乱以及躯体疾病所致的其他精神障碍;甲基丙二酸血(尿)症0。出院1个月后停用奥氮平,继续维生素B12、叶酸、左旋肉碱、甜菜碱治疗。患者行走自如,精神症状消失,表情稍显欣快,记忆力尚可,但对病中表现部分遗忘。2 讨论

甲基丙二酸血(尿)症系遗传性疾病,乃因甲基丙二酰辅酶A(methylmalonylCoA)活性下降导致甲基丙二酸及丙酸等有机酸蓄积,影响细胞代谢而引起一系列临床表现

[1]

代谢病对皮层的损害所致,而非奥氮平所致。最后本病例是因肌力下降、跛行而引起医生重视并进一步明确了诊断。提示对于跛行的患者,既要考虑到神经系统疾病的可能性,也要考虑到代谢性疾病的可能性。如:周围神经即是甲基丙二酸尿症经常受累的部位

[3]

,其临床症状可表现为反射降低或肌萎缩及跛行。本病例

的诊断经历了一个复杂的过程,即使在已有神经系统阳性体征并考虑器质性疾病时,仍做了许多筛网式检查才得以明确诊断。因此,还有一点总结:精神科儿科若怀疑器质性疾病,应常规做尿代谢检查。

甲基丙二酸血(尿)症的治疗包括:急性期补液纠酸,补充左旋肉碱治疗及长期治疗应型

[5]

[4]

,临床可分为维生素B12反应型和不反

。对于有精神症状的患者,本案例的治疗过程提示,应以

代谢病治疗为主,小量精神药物治疗为辅。

参

考

文

献

eta.lMethylmalonicand

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(收稿日期:2010-05-13)

。患者多在出生后

数周内即出现呕吐、肌张力减低、嗜睡、脱水、酸中毒等症状,罕见精神症状。本病例为青少年女性,青春期起病,临床表现为类分裂样症状,存在认知损害,并伴有神经系统阳性体征,最后经血尿有机酸分析而确诊为甲基丙二酸血(尿)症晚发型,针对性的治疗后疗效良好,进一步验证了诊断。该病例的临床表现提示,甲基丙二酸血症症状非常复杂,患者不仅存在躯体和神经系统症状及体征,也可能出现认知损害、类似精神分裂症表现。同时,该案例良好的治疗效果,进一步验证了晚发病例的病程相对为一个良性过程

[2]

,预后较好。

回顾总结本病例,提醒临床医师即使在患者具有明显的精神症状时,也应重视和早期识别提示患者可能存在器质性损害的神经系统症状体征及精神方面的表现,如本病例早期时已显示可疑的智能损害,但因患者欠配合,未能进行充分的检查。同时,临床医师在患者出现抽搐时,既要考虑到精神药物导致的可能性,也要考虑到器质性疾病的可能性,如该患者出现的抽搐很有可能是

phenotype-genotype

MolGenet

correlationsandethnic-specificobservations[J].

(责任编辑:曹莉萍)

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/qrr4.html