isolation of LPMC 小鼠肠粘膜固有层单个核细胞的分离和纯化

小鼠肠粘膜单个核细胞的分离和纯化 一．材料： （一）试剂：

1×Phosphate-buffered saline (PBS)、1×HBSS、FBS、100 U/ ml青霉素, 100 U/ ml链霉素、细胞分离液（Percoll） （二）器材：

剪刀、镊子、培养皿、40um和100um的细胞筛、15ml和50ml离心管、巴氏管 （三）试剂配制：

1）预消化液--HBSS (Hanks Balanced Salt Solutions)：5mM EDTA (100*)和1mM DTT(2000*)。

2）消化液：将0.05 g collagenase D (Roche)、0.05 g DNase I (Sigma)和0.3 g dispase II (Roche)溶解于100ml 1*PBS中。临用临配，配制后37℃孵育几分钟。 3）FACS缓冲液：1*PBS+3% FBS (vol/vol)。

4）40% Percoll(vol/vol)(100mL)：42.01 ml Percoll分离液（Sigma，密度为 1.124 g/ml）+57.99ml 1*PBS。

5）80% Percoll(vol/vol)(100mL)：79.83 ml Percoll分离液（密度为1.124 g/ml）+20.17 ml 1*PBS。

二．操作步骤：

（一）获取小鼠结肠组织：

1. 颈椎脱臼法处死小鼠，75%酒精消毒2min，然后转移至无菌工作台。 2. 仰卧位固定小鼠四肢，剪开腹部皮肤，分离肌肉，将肠管从肠系膜脂肪组织上剥离下来。

3. 将肠道组织放入预冷的1*PBS中，并切成4-5cm的节段。

4. 用镊子夹住肠管的一端，在另一端用吸满无菌1*PBS的注射器进行冲洗。并去除肠管上粘附的脂肪组织和Payer’s结。 （二）获取肠粘膜单个核细胞：

1. 将肠管纵行切开，并切成1cm左右的片段，在预冷的1*PBS中冲洗 2. 将肠道组织片段放入50ml离心管中，并加入5ml预消化液，孵育40g*37℃*20min。

3. 用100um的细胞筛过滤，再将剩余片段放入含有新的预消化液的50ml离心管，过滤掉的为含有上皮细胞的结肠成分（可以用来匀浆或者存储以分离上皮内淋巴细胞-350g, 5min, FACS buffer 洗1次）。 4. 再次孵育40g*37℃*20min。

5. 用100um的细胞筛过滤。用剪刀将剩余组织切成1mm的片段，用1*PBS洗去残留的EDTA。将组织收集入含有5ml消化液的50ml离心管中孵育40g*37℃*20min。

6. 孵育结束后，漩涡混匀器剧烈晃动20s，用40um细胞筛过滤后收集入50ml离心管中。

7. 收集碎片放入装有5ml新鲜消化液的50ml离心管中。

注：只要细胞筛上可以看到结缔组织即重复Step6 和Step7 （一般需要2-3次）。最理想状态是所有组织都被消化成不可见的小片段。

8. 将所有消化所得的溶液收集入50ml离心管中，离心500g*20℃*10min (=1200 r.p.m. Megafuge 1.0R )，弃上清。

9. 用预冷的FCAS缓冲液重悬，离心500g*20℃*10min。 10. 弃上清，用10ml 40%的Percoll分离液重悬。

11. 用巴氏管仔细地沿倾斜管壁将细胞悬液加到含有5ml 80% Percoll分离液的15ml离心管中。

12. 将40/80 Percoll 梯度溶液离心，1000g*20℃*20min。离心后即可见LPMC在两层Percoll液的界面上形成一个白色的环。夹杂的红细胞会出现的界面的下方。顶层是上皮细胞，底层是颗粒碎片和死细胞。

13. 用吸管小心的将细胞收集入新的15ml离心管中，并加1mlPBS。 14. 离心500g*20℃*10min。

15. 用FCAS缓冲液立即重悬，计数细胞，台盼蓝测活力，细胞活力95%以上继续。

三.后续处理：

细胞可以用来培养以获得含有细胞因子的上清或者采用FCM鉴定细胞抗原。 细胞还可以用来做增殖实验，分离mRNA用来做PCR，或者分离蛋白用来做WB。 LP T细胞可以进一步通过使用结合CD4抗体的磁珠进一步分离。 注：

1. 分离越快，细胞状态越好。

2. 大约可收集0.5-3*10^6个细胞；若结肠炎可收集1-7*10^6个细胞。

参考文献：

Weigmann B, Tubbe I, Seidel D, Nicolaev A, Becker C, Neurath MF. Nat Protoc. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonictissue. 2007;2(10):2307-11.

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/qqg2.html