酵母RNA的提取及含量测定

实验报告

实验三 酵母RNA的提取及含量测定

一、实验目的与要求

1、了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。

2、熟悉和掌握紫外吸收法测定核酸含量原理和操作方法，

3、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。

二、实验原理

由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。

酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。

核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（-C=C一C=C-），能够强烈吸收250-280nm 波长的紫外光。核酸（DNA,RNA）的最大紫外吸收值在260nm 处。遵照Lambert-Beer 定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。

在不同pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。

核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以ε（ρ）来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm 波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。核酸的摩尔消光系数不是一个常数，而是依赖于材料的前处理、溶液的pH 和离子强度发生变化。RNA 溶液（pH = 7.0）的ε（ρ）= 7 700-7 800，RNA 的含磷

实验报告

量为9.5%，含1μg /mL RNA 溶液的光密度为0.022-0.024。因此，测定未知浓度的DNA（RNA）溶液的光密度OD260nm，即可计算测出其中核酸的含量。该法简

单、快速、灵敏度高，如核酸3μg/mL 的含量即可测出。对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品，测定误差较小。

蛋白质由于含有芳香族氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处，在260nm 波长处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中的蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。

三、主要仪器和试剂

啤酒酵母粉

0.04M NaOH溶液

95%乙醇、乙醚、酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mL HCl。

紫外分光光度计

离心机

真空干燥箱

三角瓶、烧杯

水浴锅

四、实验步骤

1、称5g干酵母粉悬浮于30mL 0.04M NaOH溶液中，并在研钵中研磨均匀。

2、悬浮液转入三角烧瓶，沸水浴加热30min，冷却，转入离心管，3000转/分，离心15分钟后，将上清慢慢倾入10mL酸性乙醇，边加边搅动。

3、加毕，静置，待RNA沉淀完全后，3000r/min离心3min。弃去上清液。用95％乙醇洗涤沉淀两次。

4、再用乙醚洗涤沉淀一次后，用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量，

5、纯度测定：将样品配制成含5～50μg核酸/mL的溶液，于紫外分光光度计上测定260nm和280nm吸收值，计算核酸浓度和两者吸收比值。

五、计算：

实验报告

干酵母粉RNA含量（%） RNA重（g）0.2416 100% 4.832% 干酵母粉重（g）5

取0.03gRNA粗品溶于400ml蒸馏水中，

RNAO.D2600.557 稀释倍数 400 0.0092 60.02 4L0.02 41

0.00926 100% 30.9% 0.03 RNA纯度

O.D260为260nm 波长处的光密度读数；L为比色杯的厚度，一般为1或0.5；0.024为1μgRNA/mL的光密度；0.020为1μgDNA/mL的光密度

六、思考题

1.破酵母细胞时为什么要在沸水浴中进行?

破酵母细胞时在沸水浴中进行是为了杀死酵母细胞，并使细胞内蛋白质变性，破坏RNA水解酶活性以保存RNA。

2.为什么用酵母作为实验原料？如何使RNA从酵母中释放出来？RNA的等电点是多少？

由于酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。

RNA可溶于稀碱溶液，在实验中利用 NaOH使细胞壁变性，可以使RNA从酵母中释放出来。RNA的等电点是pH2.0-2.5。

3.为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？

因为NaOH可以使酵母细胞的细胞壁变性，并促使酵母细胞膜裂解，而且RNA可溶于稀碱溶液。

4.核酸的溶解性质是什么?常用什么试剂分离沉淀核酸?

核酸微溶于水，不溶于一般的有机溶剂，同时核酸的等电点在酸性范围内，其在等电点溶解度最小，因此常用乙醇分离沉淀核酸。

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