核磁共振波谱法

第15章 核磁共振波谱法

15.1基本原理

核磁共振波谱学是利用原子核的物理性质，采用先进的电子学和计算机技术，研究各种分子物理和化学结构的一门学科，自从1946年美国斯坦福大学和哈佛大学的F.Bloch和E.M.Purcell两个研究组首次独立观察到核磁共振信号并荣获1952年的诺贝尔物理学奖以来，核磁共振波谱学已发展成为化学家、生物化学家、物理学家以及医学家的不可缺少的物理方法，是分子科学、材料科学和医学等领域中研究不同物质结构、动态和物性的最有效工具之一。

核磁共振最先应用于研究有机物质的分子结构和反应过程。迄今为止，利用高分辨核磁共振谱仪已经测定了几万种有机化合物的核磁共振波谱图。

核磁共振还被广泛用于物理学和医学的研究，并能应用于食品工业、化学工业和制药工业等生产部门，进行生产流程的控制和产品的检验。特别是用于药物的定性、定量分析和结构测定时，能够在不改变药物的分子化学性质的前提下，研究其活性部位与细胞受体中起反应时的分子机制。

20世纪60年代末，超导核磁共振波谱仪和脉冲傅里叶变换核磁共振（简称PFT-NMR）仪的迅速发展，以及电子计算机和波谱仪的有机结合，使核磁共振技术取得了重要突破，其功能越来越完善。它可以在不破坏生物样品并保持在液体状态下研究生物大分子（如酶、蛋白质以及一些活体组织）的动力学过程、分子结构与生物功能的关系，获得用其他分析方法无法得到的多种信息参数，极大地弥补了X射线技术、电子显微技术和一般光谱技术的不足。另外，双共振技术的应用对于简化复杂谱线、发现隐蔽谱线、确定谱学参数以及物质结构也是一个非常有用的方法。

核磁共振的研究对象为具有磁矩的原子核，带正电的原子核的自旋运动产生磁矩，但并不是所有同位素的原子核都有自旋运动。原子核的自旋运动与自旋量子数I有关，I＝o的核没有自旋运动，不能用核磁共振来研究，按I的数值可将原子核分为三类：

（1）中子数、质子数均为偶数，则I＝0，如12C、16O和32S等同位素。

（2）中子数与质子数其中之一为偶数，另一为奇数，则I为半整数，例如，I＝1/2，11315193177113119195199

H、C、N、F、P、Se、Cd、Sn、Pt、Hg等。

I＝3/2，7Li、9Be、11B、23Na、33S、35Cl、39K、63Cu、65Cu、79Br、81Br等。 （3）中子数、质子数均为奇数，则I为整数，如H、Li、N等核的I＝1，Co的I=2，10

B的I＝3。

当原子核自旋量子数I非0时，它具有自旋角动量P： P?I(I?1)?h/2? 2

6

14

58

式中：h为普朗克常量；

具有自旋角动量的原子核也具有磁矩μ，μ与P之间存在下列关系：

???P

式中：γ称为磁旋比或旋磁比，是原子核的重要属性。

在静磁场中，具有磁矩的原子核存在不同的能级，此时如果运用某一特定频率的电磁波来照射样品，原子核就可能产生能级之间的跃迁，就产生了核磁共振信号。为满足核磁共振的条件，可以固定静磁感强度、扫描电磁波频率或者固定电磁波频率，扫描静磁感强度，这两种方式均为连续扫描方式，其相应的仪器称为连续波核磁共振谱仪，它的磁感强度由电磁

体或永磁体提供，磁场强度非常有限，远远不能满足现代高分辨核磁共振的要求，已经被超导脉冲傅里叶变换核磁共振谱仪逐渐取代。

由于原子核所处的环境不同，具有不同的屏蔽常数，例如，抗磁屏蔽、顺磁屏蔽、邻基团各向异性及溶剂、介质的影响各不相同，导致其核磁共振谱线的位置也各不相同。在核磁谱图中采用某一标准物质作为标准，以基准物质的谱线位置作为谱图的坐标原点，不同官能团的原子核谱峰位置相对于原点的距离可以反映它们所处的化学环境，称为化学位移（chemical shift）δ，δ按式（15-3）计算：

6??10?(?样品－?标准）/?标准

δ表示的是距原点的相对距离，其单位是ppm（百万分之一），是一个无量纲单位。

四甲基硅烷TMS（tetremethylsilane）在H、C、Si谱中均作为测量化学位移的基准，因为TMS只有一个峰（结构对称性高），分子中氢核和碳核的核外电子的屏蔽作用都很强，无论氢谱或碳谱，一般化合物的峰大都出现在TMS峰的左边（低场），即每个基团的疗均为正值。另外，TMS沸点仅27℃，易于从样品中除去，便于样品回收，而且TMS与样品之间不会发生分子缔合，所以在这些谱中都规定δTMS＝0。

当测量某个核的核磁共振谱图时，往往该核附近有其他一些有磁矩的核存在，这些核会对测量核所处的化学环境产生影响。例如，它们的磁矩大体和外磁场平行时，测量核感受到的磁感强度略有增强，反之，则会略有减弱。这样测量核就不会在预定的化学位移出峰，而是在高场和低场方向分别出峰，与待测核偶合的核有n个的话（假设其偶合作用均相同），这些核的磁矩均有2I+1（I为自旋量子数）个取向，则这n个核就有2nI+1种分布情况，待测核的谱线也就会分裂成2nI+1条，对于I＝1/2的核如1H、13C、19F、31P等来说，自旋-自旋偶合产生的谱线分裂数为，n+l，称为n+1规则。

偶合产生的分裂的裂距反映了相互偶合作用的强弱，称为偶合常数（cou-pling constant）J，J以赫兹为单位。偶合常数的大小和两个核在分子中相隔化学键的数目密切相关，故在J的左上方标以两核相距的化学键数目。例如，13C-1H之间的偶合标为1J人偶合常数随化学键数目的增加而迅速下降，两个氢核相距四根键以上则很难存在偶合作用，若此时J≠0，则称为远程偶合或长程偶合（long-range spin-spin coupling），碳谱中2J以上即称为长程偶合。

另外，J是个矢量，谱线的裂距反映偶合常数的大小。有偶合作用的两核，若它们取向相同时能量较高，或它们取向相反时能量较低，这相应于J>0，反之，则为J<0。 傅里叶变换NMR中，不是通过扫描频率（或者扫描磁场）的方法找到共振条件，而是采用在恒定的磁场中，在对应某种核的整个可能频率范围内施加具有一定能量的脉冲，使所有的核自旋取向发生改变而跃迁至高能级，之后处于高能级的核会放出能量回到初始能级，通过信号接收装置来接收发出的电磁波，转变成为数字信号，即以时间为自变量的一个函数，称为FID（free induction de-cay）。而傅里叶变换能够将时间域的函数转变成频率域的函数，因此FID经过傅里叶变换后就得到了以频率为自变量的函数，其图形表现形式就是核磁谱图。傅里叶变换的公式如下：

F（?）=12????1

13

29

?f(t)e?i?tdt

1980年以前，核磁共振谱主要采用一维谱图，即只有一个频率坐标，而第二个坐标为信号强度。20世纪80年代以后，二维NMR（two dimensional NMR）波谱发展成熟并被常规使用，即两个坐标轴皆为频率坐标，而信号强度出现在第三维空间。随后又发展成功三维或多维核磁，只是目前还没发展到常规应用的阶段。二维核磁共振谱的发明是核磁共振技术划时代的发展，在二维核磁共振谱方面做出突出贡献的瑞士核磁共振谱学家R.R.Ernst获得

1991年诺贝尔化学奖。

二维核磁中的两个频率维通常称为P1和F2，这种谱图打印到纸上有很多种方法，最常用的是等高线显示，以一定间距的等高线来表示峰的强度（类似地图的表示方法），每个峰的位置用分别对应于n和F2维的相关来标明。通常二维谱的相关是对应于普通一维谱的在F2维方向的一系列相关，F2维一般也附上相应的一维谱来强化得到的相关。

图15-1显示的是只有互相偶合的两个质子A、X的COSY谱示意图，F2维也附上了普通的一维谱，很明显，相关是以对角线（图中虚线）为对称中心的。一维谱中的偶合在二维谱中产生了分散，变为正方形或是矩形的外形。谱中的相关分为两种：一种是P1维和F2维相同的峰产生的相关，它们位于对角线上；另一种F1维和F2维中不同的峰产生的相关，它们以对角线为对称轴对称，在COSY谱中表示这两个氢的距离在叁键以内，所以根据COSY谱可以确定整个分子中的偶合关系。

在一维的脉冲调制的傅里叶变换核磁中，记录的信号是一个时间变量的函数，然后经过傅里叶变换成为一个以频率为变量的函数的谱图。在二维谱中，记录的信号是两个时间变量·九和22的函数，而且将得到的数据进行两次傅里叶变换来得到一个两个频率变量的函数，一般的二维谱的形式见图15-2。

第一个时期称为预备期，样品被一个或多个脉冲激发。得到的磁化矢量处于不平衡阶段，不断演化，即处于发展期t1阶段。后面的称为混合期，由另一些脉冲组成，混合期并不是必不可少的。混合期之后信号记录为第二个时间变量t2的函数，称为检出期t2。以上的组合称为一个脉冲序列，预备期和混合期的本质决定了二维谱能够给出的信息。比较重要的一点是信号并不是在t1时间段内记录的，而仅仅是在t2。时间段内、脉冲序列的终点处记录。记录的数据在t1和t2方向均有规则的时间间隔。

二维信号的记录方式如下：首先，t1设为0，脉冲序列开始执行，然后记录得到的自由感应衰减（FID），随后核的自旋被允许回到平衡状态。t1随后被设为△1，即t1方向的时间间隔，重复脉冲序列，再次记录一个FID，和第一个FID分别记录。自旋再次回到平衡状态，t1设为2△l，重复以上过程，重复的次数根据△的大小而定，可以自行调整仪器参数，但是必须足够多，保证二维谱的分辨率足够高，一般在50～500次。这样就通过在不同的t1时刻重复执行脉冲序列并记录以t2为函数的FID记录了一个二维数据。

发展期和混合期的不同决定了二维谱的种类的不同，一般二维谱可以分为三大类，J分辨谱、化学位移相关谱和多量子谱。J分辨谱也称J谱或γ-J了谱，它把化学位移和自旋偶合的作用分辨开来，包括异核J谱及同核J谱。化学位移相关谱也称γ-γ谱，是二维核磁共振谱的核心。它表明共振信号的相关性，包括同核偶合、异核偶合以及NOE和化学交换。多量子谱是用脉冲序列检出多量子跃迁的二维谱。

较为常用的二维谱包括COSY（correlation spectroscopy）、TOCSY（total correlation spectroscopy）、HMQC（heteronuclear multi-quantum coherence）、HSQC（heteronuclear single-quantum coherence）、HMBC（heteronuclear mul-tiple bond coherence）和NOESY（nuclear Overhause effect spectroscopy）等。H-HCOSY谱可以给出氢之间的近程偶合关系，帮助确定分子中氢的连接顺序，而H-HTOCSY则不仅给出近程偶合关系，还能给出远程的偶合关系，可以确定独立的自旋体系。HMQC和HSQC给出的是异核的直接键连关系。例如，H-CHMQC能够指出哪些氢和哪些碳是直接相连的；HSQC是检测单量子跃迁的异核相关谱，灵敏度更高，效果更好；HMBC提供异核的远程键连信息；而NOESY则测量分子中可能存在

?的NOESY效应，NOE效应是空间距离小于5A的核之间产生的一种效应，由此可以判断溶液中各种核的空间距离，推断分子的空间结构。

其他的应用（如自旋密度成像和定域磁共振）可以用于测量活体动物的全身和某一器官。研究器官的基础代谢和疾病，研究并估价缺血的范围，详细评价药物的疗效，研究移植器官的活性。总之，它为研究生物大分子的动态变化提供有用的信息，是现代科学技术中十分重要并有广泛发展前途的新技术之一。

15.2仪器及使用方法

根据化学位移和偶合常数的概念，我们知道对于某种同位素来说，由于其所处基团不同以及原子核之间相互偶合作用的存在，对应某一化合物有一核磁共振谱图。当使用连续波仪器时（无论是扫场方式还是扫频方式），是连续变化一个参数使不同基团的核依次满足共振条件而画出谱线来的。在任一瞬间最多只有一种原子核处于共振状态，其他的原子核都处于“等待”状态。为记录无畸变的核磁谱，扫描速度必须很慢（如常用250s记录一张氢谱），以使核自旋体系在整个扫描期间与周围介质保持平衡。

当样品量小时，为记录到足够强的信号，必须采用累加的方法。信号S的强度和累加次数n成正比；但噪声N也随累加而累加，其强度和n成正比，因此信噪比S/N和n成正比。如果需要把S/N提高到10倍，就需要累加100次，即需2500s。如果S/N需要进一步提高，所需时间更长，这不仅造成时间的浪费，而且谱仪也难于保证信号长期不漂移。

为克服上述缺点，必须采用新型仪器脉冲-傅里叶变换核磁共振（pulse and Fourier transform NMR）波谱仪，使所有的原子核同时都共振，从而能在很短的时间间隔内完成一张核磁共振谱图的记录。

傅里叶变换波谱仪具有以下优点：

（1）在脉冲（一束包含一定频率范围的短而强的电磁波）作用下，该同位素所有的核（不论处于何官能团）同时共振。

（2）脉冲作用时间短，为微秒数量级。若脉冲需重复使用，时间间隔一般也小于几秒（具体数值决定于样品的T1）。在样品进行累加测量时，相对CW（连续波）仪器远为节约时间。

（3）脉冲FT仪器采用分时装置，信号的接受在脉冲发射之后，因此不会有CW仪器中发射机能量直接泄漏到接收机的问题。

（4）可以使用各种脉冲序列（pulse sequence），达到不同的目的。

前三点使FT仪器灵敏度远较CW仪器为高，样品用量可以大为减少。以氢谱而论，样品可以从CW仪器的几十毫克降到1mg以下，测量时间也大为缩短。后两点使FT仪器可以进行很多CW仪器无法进行的工作。

实验55核磁共振谱法测定乙酰乙酸乙酯互变异构体的相对含量

一、实验目的

（1）了解超导核磁共振谱仪的基本结构。

（2）掌握核磁实验的基本原理和操作步骤。

二、实验原理

乙酰乙酸乙酯除具有酮的典型反应（例如，与NaHSO3、HCN加成，与苯腙、羟氨作用，碘仿反应等）外，还能与三氯化铁水溶液发生颜色反应；使溴水褪色；与金属钠作用放出氢。这些实验事实是无法用前面所写的结构式解释的。经过许多物理和化学方法的研究确定，乙酰乙酸乙酯实际上是由酮式和烯醇式两种异构体组成的一个互变平衡体系（图15-3）。

酮式和烯醇式异构体之间以一定比例呈动态平衡存在。在室温下，彼此互变的速率很快，不能将二者分离。这种同分异构体间以一定比例平衡存在，并能相互转化的现象叫作互变异构现象。

互变异构体的平衡混合物遇到与羰基反应的试剂，则酮式异构体发生反应，烯醇式异构体便随之转化为酮式，在足够量试剂的作用下，最后全部转化为酮式异构体的衍生物。反之，如果在平衡混合物中加入足够量的溴水或金属钠，则最后得到的都是烯醇式异构体的衍生物。从上述表现出来的化学性质看，可以说乙酰乙酸乙酯具有酮和烯醇的双重反应性能。但必须明确的是，乙酰乙酸乙酯并不是一种单一的物质，而是酮式和烯醇式两种异构体的互变平衡混合物。

互变异构现象是有机化学中常见现象。从理论上讲，凡有?-H的羰基化合物都有互变异构现象，但不同结构的羰基化合物，其酮式和烯醇式的比例差别很大（图15-4）。

丙酮的?-H只受到一个羰基的活化，因此烯醇式结构不稳定，所占比例太小，可以忽略不计。而在乙酰乙酸乙酯分子中，亚甲基由于受羰基和酯基的双重影响，其上的氢原子较活泼，因此能够形成一定数量的烯醇式异构体；而且形成的烯醇式异构体，因羟基上的氢原子与酯基中羰基上的氧原子形成分子内的氢键而稳定（图15-5）。

乙酰乙酸乙酯的互变异构是由质子移位而产生的。除乙酰乙酸乙酯外，还有许多物质（如。 ?-二酮以及某些糖和含氮的化合物等）也能产生这类互变异构现象（图15-6）

酮式与烯醇式的相对含量与分子结构、浓度、温度等因素有关。不同物质的互变平衡体系中，异构体的比例不同（表15-1）。

表15-1不同物质互变异构体中烯醇式的含量 结构式 烯醇式含量（液态）/%

CH3COCH3 CH3COCH2COOC2H5 CH3COCH2COCH3 CH3COCH（COOC2H5）2

环己酮

同一物质在不同溶剂中的烯醇式含量也不同（表15-2）。

表15-2乙酰乙酸乙酯在不同溶剂中烯醇在互变异构体中所占含量 溶剂

水 50%甲醇 乙醇 戊醇 氯仿

用化学法测定乙酰乙酸乙酯两种互变异构体的相对含量，操作麻烦，条件与终点也不好控制。用核磁共振谱法测定，具有简单、快速的优点，实验结果与化学法相近。

酮式的羰甲基[图15-3（a）]和烯醇式的甲基[图15-3（b）]在谱图中不互相重叠，均

0.00025 7.5 80 69 0.02

烯醇式含量/%

0.4

0.25 10.52 15.33 8.2

溶剂 乙酸乙酯

苯 乙醚 二硫化碳 已烷

烯醇式含量/%

12.9

16.2 27.1 32.4 46.4

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/qpd6.html