实时定量PCR 的操作流程

用于检测细胞基因转录水平的实时定量PCR的操作流程

（Real Time Quantitative PCR Protocol For Detection of Gene Expression）

第一部分 原理

real time PCR 是普通PCR的一项改进，使用了针对扩增DNA的荧光物质，使得DNA的数量与检测到的荧光强度成线性关系，大致得到DNA的扩增曲线（如，图一）。

图一：引自美国应用生物系统中国公司网站——实时荧光定量的定量方法。

名词解释：

PCR ——一种科学准确

Rn:一个反应管经n次热循环后，测得的荧光强度。 Rn+:反应管含有模板DNA。 Rn-:反应管含有模板DNA。

无模板对照：No template control，Rn-，理想情况下，是一条平线，只具有背景荧光数值。 Threshold: 荧光（Rn）超过本底时的临界数值。 Ct: threshold cycle，临界循环数，threshold 横线与扩增曲线相交，所得交点所对应的循环数。 基线：baseline, 是背景曲线的一段，范围——从反应开始不久荧光值开始变得稳定，直到所有反应管的荧光都将要，但是还未，超出背景。

仪器：热循环仪器（GeneAmp Thermal Cycler 9600）+电脑（装有Sequence Detection System 软件）+荧光检测系统(GeneAmp Sequence Detector 5700)（如，图二）。

图二，引自http://www.77cn.com.cn/。

全部实验包括步骤： 1，类似普通PCR反应的物品混合于反应管，之外还要添加荧光物质（SYBR染料 或 TaqMan 探针）。

2，使用SDS软件标明热循环仪器中放入的所有反应管，设定热循环仪器的温度变化，存储热循环仪器的工作情况，存储荧光信号，分析DNA的扩增曲线。

3，利用SDS输出的数据，其他专业数据处理软件，近似计算得到原始DNA的浓度，做必要的误差分析。

SYBR 是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。 TaqMan探针是由产荧光基团，荧光淬灭基团，与扩增子有互补的核苷酸序列组成。

GeneAmp 5700 Sequence Detector 总是在PCR循环的退火/延伸时间段依次收集反应馆的激发荧光强度。

Real time PCR 与普通PCR的细节上的区别还有：

使用持家基因作内部参比（endogenous control/reference，是同一种cDNA中的比较，并不是同一反应管中作比较的意思）；

推荐使用ROX(具有红色激发波长的染料)来抵消荧光背景（本底）；

用浓度（比较）确定的DNA来做出标准曲线（Ct——log原始模板/DNA浓度）。 具体情况将在操作流程中讲述。

本次实验的具体目的：测出PTX, LPS刺激不同时间后，DC的基因转录变化，属于“relative quantitation (相对定量)”。这个结果可以拿来与以前所做的 cDNA Microarray 结果（半定量）作比较，确认或修正之。

第二部分 操作流程 一 仪器，用品，试剂

GeneAmp Thermal Cycler 9600 GeneAmp Sequence Detector 5700 电脑

Sequence Detection System 软件 数据处理软件（如，Excel） 引物设计软件

光学管子，optical tube and cap + 架子 微量移液器（枪）+ 枪头（tip） 离心机 + 螺旋振荡器 冰箱 冰盒

一次性手套 试剂 PCR buffer MgCl2 dNTPs

引物： sense, anti sense primers 模板： cDNA, 从细胞中抽提RNA并反转录得到 SYBR染料

终浓度 1× 2——4 mM 200+200nM

体积？

ddH2总0.01——Taq酶

琼脂糖凝胶电泳相关试剂

二 前期准备

细胞按要求培养，抽RNA, 反转录为cDNA。

有细胞计数，测RNA浓度（分光光度计）等环节。

选择反应物，

待测样本：0hr, P4, L4, P12, L12, P24, L24, P36, L36 九种 阴性对照：即无模板对照， NTC

作为标准的样品：如果有必要做标准曲线的话，选择一种比较容易准确定量的DNA (如果是进行绝对定量分析，则需要浓度完全已知的DNA标准品——要求：能够被引物所扩增，比如，其他种类细胞的cDNA, 或，克隆有DNA片段的质粒载体)。

选择引物（基因）

endogenous control 使用的持家基因：GAPDH(甘油醛脱氢酶)，HPRT （为什么使用之？……） 转录水平待测的基因

因为每个反应管要做3次重复以上，所以应该准备好充足量的 PCR试剂，推荐——先混合得到Master Mix, 再分至各个反应管。

三 流程

G H

※标准曲线和待测样品其实应该在同一次real time PCR中做。第一次做的话，试验的成分更多些，所以，重复数应该大一些（4），这样就不得不把标准曲线和待测样品分开了。等到扩增曲线能够被完美地，轻松地得到后，就可考虑减少重复数（至少3吧）， 96个孔全被使用了。

但是，重复数越少，结果的可信性就越小，对实验曲线的完美度要求就更高。

四 SDS软件的使用

1 打开电脑，用户名：administrator 密码：5700 2 开启5700，9600的电源 3 打开SDS软件，

在“New Plate Application”中同时选定“5700”和“5700 quantitation”,点击“OK”，建立了一个新文档。

出现“GeneAmp 5700 SDS Software[Plate1]”窗口，从A-1 到H-12 96个方格代表了Sample Block 中96个加热（反应）孔，位置是对应的。 4 选择样品（反应）类型和取名

选定将要设参数的方格（可多选），点“Type”下拉框，选定正确的样品类型： STND: standard UNKN: unknown

NTC: no template control Not In Use:用于取消设定

完成以后，样品类型的缩写显示在方格中。

选好方格后，在“Name”文本框中可输入合适的样品名字，如：0hr,P4,L4,…… 如果每个样品（STND，UNKN，NTC）做4个重复，则它们的名字必须相同。

5 设置引物/探针

选定方格（已经取好名字，类型），点击“P”按钮，打开“Primer/Probe Palette”对话框，根据缩写，引物/探针名称，颜色，选定一栏（点击），于是Primer/Probe颜色出现在方格底部。

如果“Primer/Probe Palette”中Primer（可选项）不够或不合适，则可在Setup菜单/“Primer/Probe Setup”窗口中增加与修改，比如双击颜色条，弹出“选择颜色”窗口。

最后设置完每个方格后，如果有多余（无用）的Primers的话，在“Primer/Probe Setup”中，点击“Remove Unreferenced”。

6 给标准样品设值

先确认一下，含样品的方格 Type,Name,Prime/Probe 都已设好。然后选Type=STND的孔，填入DNA的已知初始浓度，比如：1.0，0.1，0.01，0.001，0.0001。

7 编辑热学过程

点击主界面/Instrument按钮，出现

Stage 1 50℃ 2:00(minute) 目的——激活UNG酶。

Stage 2 95℃ 10:00 目的——失活UNG,激活Taq Gold酶。 Stage 3 Step 1 95℃ 0:15(seconds) 目的——模板变性。

Step 2 60℃ 1:00 目的——模板退火，引物延伸。 30-40 cycles.

点击这些温度，时间数字后就可更改之。

8 保存文档（Plate Setup）

9 点击“Run”,real time PCR 整套设备开始自动运行。

10 查看结果，简单分析

PCR结束后，Instrument/Status显示“Idle(机器空闲)”。 保存文档（每轮循环，每个反应管的发射荧光数值）。 点击Result/“Amp Plot”选项卡，

出现扩增曲线（半对数坐标显示），

双击纵轴可出现“Graph-Set Scale”对话框，选定“Linear”，于是得到线性的扩增曲线（如图一）。

在“Reference”中设定Baseline范围和Threshold数值， 在Analysis 菜单选择“analyze”,出现对扩增曲线的分析， 点击Result/“standard Curve” 选项卡， 出现标准曲线（斜直线，如图）

五 更为详细的数据处理，包括误差分析

1 根据标准曲线得到待测cDNA中各种基因（模板）的原始数量

还是先得到（Ct 待测基因－Ct持家基因），再转换为原始模板浓度（处理样品，对照样品，respectively），最后相除？

2 用Ct比较法来测算转录水平差异。

如果做确认实验（Validation Experiment）并得到理想结果，可以不使用标准曲线。

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Xn=X0×(1+Ex)n Ex=ER

Folds=2 –ΔΔCt

ΔΔCt=(Ct1-Ct2)-(Ct3-Ct4)

Ct1:处理样品待测基因的临界循环数 Ct2: 处理样品持家基因的临界循环数

Ct3: 对照样品待测基因的临界循环数 Ct4: 对照样品持家基因的临界循环数

第三部分 如何优化实验条件，得到可信的数据 一 产物特异性

Real time PCR 使用SYBR Dye的话，对PCR产物的特异性要求非常高。 SYBR与所有dsDNA结合，包括引物二聚体（Primer Dimers）。理想情况是引物设计非常完美，各种试剂的使用量恰到好处，温度变化与“变性，退火，延伸”完全吻合，使得PCR过程中产生极少引物二聚体，极少有偏差的延伸，极少非目的模板的扩增。

移液必须准确。

防止污染，如环境中的DNA进入反应管。

引物二聚体，除了寻找合适的序列，还可以改变退火温度，限制引物的浓度。 Mg2+浓度，可以从2mM到5mM做梯度实验。 退火/延伸温度，可以从60℃到72℃做梯度实验。 模板浓度，

还有许多其它参数，如与仪器相关的，与实验材料相关的，一般是凭经验来定的。

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