肉毒毒素及其临床应用

肉毒毒素及其临床应用

肉毒毒素是肉毒梭菌在生长繁殖过程中产生的一种细菌外毒素，属于高分子蛋白神经毒素，能引起人和动物死亡率很高的肉毒中毒。根据毒素抗原的不同，将其分为A、B、C、D、E、F和G七个型，C型中尚有C1 和C2两个亚型，其中A型肉毒毒素的结构和功能已较清楚。自上世纪70年代初美国旧金山眼科研究所的Scott 医师从肉毒中毒病人首先累及眼外肌，引起视力模糊、眼睑下垂、瞳孔散大和复视等症状并缓慢恢复的过程中得到启示，与世界著名肉毒毒素专家、美国威斯康辛大学食品微生物及毒素学系 Schantz教授合作在猴试验基础上将肉毒毒素引入眼科疾病治疗，并在1980年首次报告眼外肌注射A型肉毒毒素替代斜视手术的可能性，此后他和其他临床专家对肉毒毒素的临床效果、副作用及免疫学反应进行了大量的试验研究，并在斜视、眼睑痉挛、面肌痉挛、痉挛性斜颈等疾病的治疗中取得了令人鼓舞的结果。从此肉毒毒素的临床应用突飞猛进。

一．肉毒毒素的结构

在自然状态下或人工培养基中，肉毒毒素通常以一种复合体形式存在，即神经毒素和血凝素或非血凝活性蛋白的复合体，也叫前体毒素（progenitor toxin）(见图1)。目前流通的三种A型肉毒毒素制品都是这种复合体。象许多生物活性蛋白一样，肉毒毒素的生物活性与它的空间形态结构有关，血凝素在保持毒素三维结构及稳定性上起着重要作用。 肉毒毒素很容易在40℃以上发生热变性，特别是在碱性条件下；空气／液体界面形成的气泡能引起神经毒素的伸展和形状的改变，从而使毒素溶液失去毒性；在有氮气和二氧化碳的环境中也能发生毒素的变性；稀释至过低浓度（如ng/ml）能使神经毒素的稳定性降低，只有用含其它

蛋白（如明胶、牛或人血清白蛋白）的缓冲液（pH6.8或更低）稀释才能防止。

图1 前体毒素电镜模式图

用半乳糖作为配基的亲和层析或SP-sephadex或CM-sephadex的氯化钠梯度离子交换层析，能使神经毒素从肉毒前体毒素中分离出来。各型肉毒神经毒素具

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有相近的分子量，即150KDa左右，它们的特异毒性或纯度一般在107—108LD50/mgpr。

神经毒素的双链结构和二硫键：现已公认，任何型的毒性成分都是作为单 一多肽链被产生的，但蛋白分解酶，不管是内源或外源性的，能把毒素切割为双链而显示其毒性。被切毒素的两个多肽链间至少有一个二硫键联结，二硫键的作用在于维护毒素的完整及其毒性。还原剂如巯基乙醇,DTT (dithothertol),SDS或尿毒素等能将二硫键还原，使被联结的双链彻底分离为分子量100KDa和50KDa两个链，分别叫“H”链（重链）和L链（轻链）（见图2,图3）。轻链的本质是锌肽链内切酶（Zinic endopeptidase）。彻底被分离的两个链是无毒的，若按等分子的比例（即1∶1的克分子）或重量之比（即L∶H＝1∶2），通过透析性再氧化，则能恢复其毒性的40％。说明除了组分外，两个链的特异性排列或空间位置在毒性维持上也有很大的作用。

图2 肉毒神经毒素的空间结构（电镜图）

图3 肉毒毒素的切割和亚单位的结构（模式图）

二．肉毒毒素的药理作用及其机制

（一）对神经肌肉接头的基本作用

肉毒毒素作用于周围运动神经末梢，神经肌肉接头即突触处，抑制突触前膜对神经介质—乙酰胆碱的释放，引起肌肉松弛性麻痹，即化学去神经作用（chemodenervation）。神经毒素发挥其麻痹作用一般经过三个过程：即①与神经细胞上受体结合；②依赖能量的内化过程（生物大分子进入细胞过程或受体介导的胞吞）；③抑制神经介质的释放。肉毒毒素的受体识别位点在重链的C末端（H1片段）；依赖能量的内化作用和通道形成发生于重链的N末端（H2片段）；轻链进入神经细胞后通过一系列蛋白分解活动抑制神经介质的释放。近年发现肉毒毒素的轻链是锌肽链内切酶,其作用底物是一种与乙酰胆碱囊泡停靠和胞吐有关的融合蛋白，它是由突触体相关蛋白（SNAP－25）、囊泡相关膜蛋白（VAMP）和突触融合蛋白（Syntaxin）组成的一种复合物，也叫SNARE［可溶性的NSF（N

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－乙基－马来酰亚胺－敏感因子）－附着蛋白受体］复合物。各型肉毒毒素的轻链裂解此复合物中一种蛋白的特异残基，阻止SNARE复合物的功能或形成，因此

抑制神经介质的胞吐（见图4，图 5），使乙酰胆碱释放受阻。

图4 肉毒毒素在神经肌肉接头处的结合

图5 肉毒神经毒素的裂解位置及底物

组织学检查显示，神经支配的恢复开始出现是通过从无髓鞘的末端轴索立即向终板靠近的不平行发芽。另外的发芽位置是原本的带髓鞘的末端前轴索的郎飞（Ranvier）结和终板上超末端轴索的分枝（未列出）。在临床前模型中，de paiva指出，新芽而非原有的末端，将在28天由神经刺激引起肌肉收缩。所以在恢复早期，仅仅新芽才反应于刺激性神经－肌肉传导。然而，在随后的第二相和独特相，囊泡转向原来的末梢，新芽失去胞吐作用，并逐步清除新芽。

肉毒毒素抑制胞吐是暂时性的，神经介质的释放最终必将恢复。早期的神经肌肉接头组织学研究显示神经介质的释放被抑制一段时间后，神经末梢开始发芽,表明神经支配修复的开始。最近de paiva在对小鼠的研究中提出了功能恢复的二步模式，并证实肌肉收缩的恢复早期，仅仅新芽能够体现囊泡的周转并对刺激性神经肌肉传导发生反应，只是到了第二步，囊泡的周转才返回原来的末梢,此时新芽失去胞吐作用,并逐步被清除（见图6）。突触功能恢复到原来的神经肌肉接头，并清除新芽，在这一实验模型上要经历91天。

图6 肉毒毒素引起的去神经萎缩

（二）A型肉毒毒素对传入神经的作用

A型肉毒毒素还能改变传入中枢的感觉反馈环。Zwirner等指出，肌肉活动的减少并反馈到喉运动神经原回路也是A型肉毒毒素的一个重要作用。Filippi等支持这一假设，他得到了A型肉毒毒素改变肌梭，影响Ia传入信息的电生理证据，确认局部注射A型肉毒毒素能直接减少传入Ia纤维传输，间接影响中枢

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神经系统，因而对感觉反馈发挥调节作用。Rosales等也认为肉毒毒素可能通过对肌梭内纤维的阻滞，减少Ia的传输，有效地改变感觉传入系统。

以利多卡因或酒精注射治疗颈、颌、肢体肌张力障碍和痉挛状态已用过多年，并有一定疗效，其机理也是对肌梭传入神经的影响。Kaji给利多卡因加酒精疗法起名为“肌肉传入阻滞”（muscle afferent block）,唯它们的疗效只有几周，所以目前用得并不多。然而，阻滞Ia传入的这种模式，可以用来阐明A型肉毒毒素在过度收缩肌肉上的传入作用的机制，并确已在实际应用中取得更好的临床效果。

（三）A型肉毒毒素对感觉神经的止痛效果

A型肉毒毒素临床应用和经验积累证明，它是解除颈肌张力障碍颈、肩疼痛；运动原损伤性痉挛状态的疼痛；贲门失弛缓症病人疼痛；肛裂病人肛痛等的有力工具，而且解痛效果明显，缓解时间较长。原以为这与肌肉痉挛被解除有关，然而，越来越多的研究发现，疼痛的减轻程度远远大于肌肉的松弛程度，提示A型肉毒毒素还可能有止痛作用。上述A型肉毒毒素针对传入神经的实验依据，也许是疼痛缓解的一个因素。

炎性疼痛的大鼠模型则被用来证实A型肉毒毒素能阻止足垫注射福尔马林而引起的典型的行为性疼痛反应。A型肉毒毒素对大鼠的两相疼痛反应都呈现与量相关（30U／kg体重）的抑制，最高量对急性疼痛反应（I相）明显地抑制，而对与II相反应有关的炎性疼痛也有相当作用，但大剂量引起全身反应、体重下降；低剂量仍有局部抗感受伤害的作用，但体重已不下降，证明A型肉毒毒素确能缓解或减轻局部疼痛。

应特别指出的是，A型肉毒毒素能抑制P物质和其他潜在神经调节剂的释放，P物质是一种神经多肽,与痛觉、血管扩张和神经原性炎症有关。

A型肉毒毒素还能抑制周围三叉神经血管系统肽的释放，并对偏头痛发生器产生适当的反馈，使偏头痛过程的激活和启动受到抑制，从而对偏头痛起到良好的治疗作用。

（四）A型肉毒毒素对副交感神经元的作用

乙酰胆碱也是自主神经系统副交感部分节后纤维的神经介质，这些纤维支配不同的腺体，于是A型肉毒毒素对乙酰胆碱的作用成为治疗自主性疾病的实验

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基础。许多研究证实，A型肉毒毒素是治疗多汗症和多涎症的有效药物。

三．常用的肉毒毒素制品

1989年12月美国FDA(食品和药品监督管理局)批准A型肉毒毒素（BOTOX）作为新药上市，是世界上第一个用于临床治疗的微生物毒素。此后英国（Dysport），中国（衡力、BTXA）同类产品相继问世，成为当今国际三大知名品牌。

BOTOX，由美国爱力根公司（Allergan,Inc）生产、经销，已被批准用于斜视、眼睑痉挛和颈部肌张力障碍的治疗。2002年4月15日又批准了除皱适应证。美国FDA还制订了制品质量、稳定性、效价和包装容器等方面的标准。

欧洲A型肉毒毒素（Dysport）1991年被英国卫生部批准，在英国生产，由法国Beaufour-Ipsen药业公司经销，已批准的适应证为斜视、眼睑痉挛、颈部肌张力障碍和小儿脑瘫足畸形等。

中国A型肉毒毒素（衡力、BTXA），由兰州生物制品研究所生产、经销，1997年2月被中国卫生部正式批准为新药，已核准的适应证包括斜视、眼睑痉挛和面肌痉挛、美容除皱等。

B型肉毒毒素（BTX-B）制品在美国称之为MYOBLOC (Elan公司，Ireland生产)，同样的欧洲配方名为NeuroBloc。MYOBLOC 2001年12月由美国批准用于治疗颈部肌张力障碍。每种肉毒毒素制品有它独特的配方和生物学特性,有不同的效价和剂量范围，并直接影响临床效果和副反应，它们的计量单位一般不能换算。

四．肉毒毒素的临床应用

（一）适应症

1980年A型肉毒毒素首次被应用于治疗人类斜视获得成功，1989年美国FDA批准临床应用治疗斜视、眼睑痉挛和偏侧面肌痉挛，1993年我国同类产品-BTXA（商品名衡力）问世，并经过临床使用验证和国外同类产品相比有一致的疗效。目前A型肉毒毒素已被广泛用于以肌肉过度或不适当收缩为特征的许多疾病的治疗。这些疾病包括：

1. 局灶性肌张力障碍：眼睑痉挛、面肌痉挛、痉挛性斜颈、书写痉挛等； 2. 痉挛状态：中风、脑外伤、儿童脑瘫后的肢体痉挛状态；

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