小鼠_IL-2_Elisa试剂盒

产品详细说明书

小鼠IL-2定量分析酶联免疫检测试剂盒

本试剂盒仅供科研使用。用于体外定量检测小鼠血清、血浆或细胞培养上清液中的IL-2浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整,如有疑问请与北京博凌科为生物科技有限公司联系，我们将提供力所能及的帮助。

如您有其它需求，请登录北京博凌科为生物科技有限公司网站或致电本公司。

IL-2简介：

IL-2是一种主要由T淋巴细胞产生的多效性的细胞因子，成熟的鼠IL-2是149个氨基酸的糖蛋白，由169个氨基酸的前体蛋白通过剪切而成为成熟的蛋白。

IL-2在抗体刺激引起的不同反应阶段的T细胞，自然杀伤细胞和B细胞的细胞增殖方面起重要的作用，此外，IL-2还可调节γ干扰素、主要组织相容性抗原的表达，刺激活化的B细胞的增殖和分化，提高自然杀伤细胞的活性和抑制粒细胞/巨噬细胞的的增殖。IL-2还可诱导少胶突细胞的增殖和分化。

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中小鼠IL-2的浓度。小鼠IL-2捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标本或参考品时，其中的小鼠IL-2会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗小鼠IL-2抗体后，抗小鼠IL-2抗体与小鼠IL-2接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂，若样本中存在IL-2将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测，读其450nm处的OD值，小鼠IL-2浓度与OD450值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值，即可算出标本中IL-2浓度。

小鼠定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

组分预包被板样本分析缓冲液标准品稀释液标准品生物素化抗体HRP连接的酶结合物浓缩洗涤液20×TMB底物终止液封板胶纸说明书

规格12条或6条1瓶5ml/3ml10ml/5ml2/1支(冻干)1瓶10ml/5ml1瓶10ml/5ml30ml/瓶1瓶10ml/5ml1瓶5ml/3ml3/2张1份

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作：A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可；

B.血清标本应是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集；

D.若待测样本不能及时检测，标本收集后请分装，冻存于－20℃，避免反复冻融。2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；

3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除；

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4.请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确。

注：正常小鼠血清或血浆样本请用标本缓冲液做倍比稀释后再检测。

注意事项:

1.试剂盒请保存在2～8℃。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。3.若标准品复溶后，请在三天内用完。4.底物请勿接触氧化剂和金属。

5.加样时，请及时更换枪头，避免交叉污染。6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。8.室温反应，请严格控制在25～28℃。

9.洗涤过程是至关重要的，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。11.加样过程中避免气泡的产生。

12.血清和血浆标本的检测时，检测抗体的孵育时间应适当延长。

检测前准备工作:

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存。2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。

3.标准品:加入去离子水0.6ml至冻干标准品瓶中使IL-2终浓度达到1000pg/ml，静置15分钟后轻轻混悬待彻底溶解，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点，最高浓度为1000pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）

洗涤方法:

自动洗板机或人工洗板：每孔洗涤液为300ul，注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。

实验过程需自备的材料：

1.不同规格的加样枪及相应的枪头；3．自动洗板机；

2.酶标仪；

4．去离子水或双蒸水；

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数，取出所需板条放置在框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃。

2.建议设置本底较正孔，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。

3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，室温孵育120分钟。对于血清或血浆标本，请加入50ul样本分析缓冲液后加50ul标本，如稀释量大，请将样本与样本分析缓冲液等量加入，不足部分用标准品稀释液补充至100ul。

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育60分钟。6.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

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7.加入酶结合物工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，避光室温孵育20分钟。8.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。9.加入显色剂TMB100ul/孔，避光室温孵育20分钟。10.加入终止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效，复孔的值平均后可作为测量值。2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值。

3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

4.若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

典型数值和参考曲线

浓度pg/ml

典型OD值1

典型OD值2

OD平均值

31.2562.51252505001000

0.10990.170.25630.43620.76771.22862.0198

0.10360.20980.28460.40590.81691.18851.9421

0.106750.18990.270450.421050.79231.208551.98095

小鼠IL-2参考标准曲线

灵敏度，特异性和重复性:

1.灵敏度：多次重复结果表明，最小检出量为7.7pg/ml。

2.特异性：与鼠C10、G-CSF、GM-CSF、IFN-、IL-1、IL-3、IL-5、IL-6、IL-9、IL-13、JE、KC、LIF、M-CSF、MIP-1、MIP-2SCF、TNF、Tpo、VEGF和人IL-2、IL-2\Sr等没有交叉反应。3.重复性：板内，板间变异系数均<10%.

参考文献:

KuzielandGreene,1990J.Invest.Dermatol.,94:275Parkinsonetal.,1988J.Immunol.Methods,15:105

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ELISAKitfortheQuantitativeAnalysisofMouseIL-2

ThemouseIL-2ELISA(enzyme-linkedimmunosorbentassay)kitisusedfordetectionofmouseIL-2incellculturesupernatants,mouseserumandplasma.THEELISAKITISFORRESEARCHUSEONLY.Pleasereadthisinstructionmanualcarefullyandcheckoutthematerialprovidedbeforeuse,andyoucancontactwithourcompanyifanyquestions.Youcanenterourwebsiteorcallusforotheraim.

Introduction

Interleukin2(IL-2)isapleiotropiccytokineproducedprimarilybyTlymphocytes.ThematuremouseIL-2isa149aminoacid(aa)residueglycoprotein.Thematureproteiniscleavedfromthe169aminoacid(aa)residueprecursor.

IL-2playsakeyroleinpromotingtheclonalexpansionofantigen-specificTcells,naturalkillercellsandB-cellsduringcertainphasesoftheirresponse.Moreover,IL-2modulatestheexpressionofinterferon-γandmajorhistocompatibilityantigens,stimulatesproliferationanddifferentiationofactivatedB-cells,augmentsnaturalkillercellactivityandinhibitsgranulocyte-macrophagecolonyformation.Inaddition,IL-2inducestheproliferationanddifferentiationofoligodendrocytes.

PrinciplesoftheTest

Thekitsisasolidsandwichenzyme-linkedimmunosorbentassayfordetectionofmouseIL-2.Ananti-mouseIL-2monoclonalantibodyhasbeenabsorbedontothewellsofthemicrotiterstripsprovided.Samplesincludingspecimensorstandardswerepipettedintowells.ThemouseIL-2inspecimensorstandardswouldbecapturedbythecoatedantibodyandthefreeotherswereremovedbywashing.ThemouseIL-2biotin-conjugatedantibodywereaddedandbindstomouseIL-2capturedbythefirstantibody,whichformedasandwich.Streptavidin-HRPwouldbeaddedandbindstothebiotinconjugatedantibody,thenfreeStreptavidin-HRPwouldberemovedduringawashstep.Afterthis,subtratesolutionwouldbeaddedandcatalyzedbytheHRP,andacolouredproductisformed.TheintensityofthecoloredproductisusedtocalculateinproportiontotheamountofmouseIL-2intheoriginalspecimen.

Materialsprovidedwiththekits:

reagentAssayBuffer

IL-2Antibody-CoatedWellsStandardDiluentIL-2StandardDetetionAntibodyStreptavidin-HRP

WashBufferConcentrate20×TMBStopSolutionPlateCovers

CompleteInstructionManual

96/48TestKit5ml/3ml12strips/6strips

10ml/5ml2/1vial(s)10ml/5ml10ml/5ml30ml10ml/5ml5ml/3ml3/21

SpecimenCollection

1.Collectingspecimenasfollowing:

A.Theparticulateofthecellculturesupernatantsshouldberemovedbeforeuse.B.Serumwasobtainedfromclotatroomtemperature.C.PleasecollectplasmawithEDTA.

D.Assayimmediatelyorstoresamplesat－20℃.Avoidfree-thawcycles.2.AntisepticandanticoagulantshouldnotappearinSerumsamples.

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3.Anyparticulateshouldberemovedfromsamplesbeforeuse.4.Donotusegrosslyhemolyzedorlipemicsamples.

Note:Sronglyrecommendthattheserumandplasmasamplesshouldbediluentasdoublingdilutionbeforeuse.

Precautionsforuse:

1.PleasestoragetheKitat2～8℃。

2.Washingbufferconcentratemayhavecrystalinlowtemperature,andyoucanmeltitsinwater-bathbeforeuse.3.Pleasediscardthedissolvedstandardafter3daysforuse.4.Avoidcontactofsubstratesolutionwithoxidizingagentsandmetal.

ageofdisposablepipettetipsavoidmicrobialcontaminationorcross-contaminationofreagentsorspecimens.6.Donotmixorsubstitutereagentswiththosefromotherlotsorothersources.

7.Toensuretheadequatemixtureofaddedreagents,pleasetapgentlytheplateafterthewellswerefilledwithliquid.8.Incubationtemperatureshouldbe25～28℃.9.Washstepwascrucialforwholeassayprocess.

10.Duplicatewellsofthesamesamplewererecommendedinassayprocess.11.Avoidthefoamwhilepourtheliquidintowells.

12.Forserumorplasmasamples,thebiotin-conjugatedantibodyshouldbeincubateforatleast90minutes.

ReagentPreparation

1.Thereagentsshouldbewarmeduptoroomtemperaturebeforeuse.Theremanentreagentsmustresealandputintorefrigeratoryagainassoonaspossible.

2.Dilute1mlofwashbufferConcentrateinto19mldeionizedordistilledwatertowork.

3.Add0.5mldeionizedordistilledwatertobottlewait15minutesforcompletedissolution.Andinturnaddthehalfconcentrationdiluentbystandarddiluent.

Washstep:

Automatedmicroplatewasheroroperatingbypipette:Eachwellshouldbepourinto300ulwashbufferandsoak15or30seconds,thenbeaspirated,fivetimesprocesswererepeated.Afterthelastwash,removeremainingwashbufferbyaspirating.Inverttheplateandblotitagainstcleanpapertowels.

MaterialsRequiredButNotProvided

1.pipettesandpipettetips

2.Microwellstripreadercapableofreadingat450nm(540nmasoptionalreferencewavelength)3.automatedmicroplatewasher4.Glass-distilledordeionizedwater

Assayprocedure

1.Theneededstripswereputtedintotheframe,theremainswerereturnedintofoilpouchandresealed.

2.Blankwellwererecommended,whichonlycolorreagentandstopsolutionbeadded.Itissuggestedthateachtestingwithgradientdensityofstandardforstandardcurve.

3.Add100ulofstandardorsample.CoverwiththePlateCoversprovided.Incubatefor2hoursatroomtemperature,Ifassaytheserumsample,youshouldadd50μlassaybufferwith50μlsampleintothewells,iftheproteinconcentrationishigherthantherangeoftheKit,addthesamequantitysassaybufferwiththesample,thedeficiencyshouldbecomplementedwithsamplediluentto100μlperwell.

4.Fivetimeswashprocesswererepeated.

5.Add100ulofdetetionantibody.CoverwiththePlateCoversprovided.Incubatefor1houratroomtemperature.6.Fivetimeswashprocesswererepeated.

7.Add100ulofStreptavidin-HRP.CoverwiththePlateCoversprovided.Lucifugalincubationfor20minutesatroomtemperature.

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8.Fivetimeswashprocesswererepeated.

9.Add100ulofTMB，Lucifugalincubationfor20minutesatroomtemperature.10.Add50ulofstopsolutiontoeachwell,determinetheopticaldensityofeachwellwithin10minutes.

CalculationofResults

1.Duplicatesshouldbewithin20percentofthemean.Averageabsorbancevaluesforeachsetofduplicatesampleswereusedasdetectionresults.

2.Theblankabsorbancevaluesofsubtractshouldbededucted.

3.Drawingabestfitcurvethroughthepointsofgraph.DrawthestandardcurvebyplottingassayedODvalue(ontheYaxis)vs.concentration(ontheXaxis).ThesampleconcentrationwasobtainedbasedonitsODvaluefoundinginthestandardconcentrationcurve.

4.Ifthevaluesobtainedarenotwithintheexpectedrangeofthestandard,Samplesshouldbediluteandassayagain.

TypicalDataandStandardCurve

concentration(pg/ml)

Typicaldata1

Typicaldata2

Average

31.2562.51252505001000

0.10990.170.25630.43620.76771.22862.0198

0.10360.20980.28460.40590.81691.18851.9421

MouseIL-2standardcurve

0.106750.18990.270450.421050.79231.208551.98095

specificity,Repeatability

Sensitivity:repeatedassayswereevaluatedandtheminimumdetectabledosewas7.7pg/ml.Specificity:Nosignificantcross-reactivityorinterferencewithMouseC10,G-CSF,

IFN-,IL-1,IL-3,IL-5,IL-6IL-9,IL-13,JE,KC,LIF,M-CSF,MIP-1,MIP-2SCF,TNF,Tpo,VEGFandHumanIL-2,IL-2\Sr.Repeatability:Thecoefficientofvariationbetweenwellsorplatesislessthan10percent.

REFERENCES:

KuzielandGreene,1990J.Invest.Dermatol.,94:275Parkinsonetal.,1988J.Immunol.Methods,15:105

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/qh5j.html