放线菌菌株Y23活性物质的分离纯化及理化性质的初步研究 - 图文

山东农业大学硕士学位论文

山東農業大學 硕 士 学 位 论 文

放线菌菌株Y23活性物质的分离纯化及理化性质的初

步研究

Study on isolation and purification of the antibiotic substance from the fermentation broth of actinomycetes

strain Y23 and the primary its characteristics.

2010年4 月 29 日

目录

中文摘要 ............................................................................................................... 1 Abstract ................................................................................................................. 2

I

放线菌菌株Y23活性物质的分离纯化及理化性质的初步研究

1 引言 ................................................................................................................... 4 1.1 烟草青枯病的发生与危害 ................................................................................. 4 1.2 病原与主要症状 ............................................................................................... 4 1.3 青枯病菌的致病机制 ........................................................................................ 5 1.3.1 青枯菌的运动性 ............................................................................................ 6 1.3.2 青枯菌胞外蛋白 ............................................................................................ 6 1.3.3 青枯菌的胞外多糖 ......................................................................................... 6 1.4烟草青枯病的发生发展规律 .............................................................................. 6 1.5 青枯病的防治方法............................................................................................ 7 1.5.1 药剂防治 ....................................................................................................... 7 1.5.2 生物防治 ....................................................................................................... 7 1.6 放线菌 ............................................................................................................. 8 1.7 利用放线菌开发抗生素的意义 .......................................................................... 9 1.8 放线菌的抗生作用机理................................................................................... 10 1.9 利用放线菌开发抗生素过程中存在的问题及解决途径 ..................................... 10 1.10 生物农药与农用抗生素的关系 .......................................................................11 1.11化学农药的问题和抗生素类农药具有的优点...................................................11 1.11.1 化学农药的问题 ..........................................................................................11 1.11.2 抗生素类农药具有的优点 ............................................................................11 1.12 国外农用抗生素的研究进展 ...........................................................................11 1.13 国内农用抗生素研究进展 ............................................................................. 13 1.14 农用抗生素的开发模型 ................................................................................. 14 1.14.1构建农用抗生素开发模型的必要性 ............................................................. 14 1.14.2 开发模型 ................................................................................................... 14 1.15 农用抗生素的分离纯化 ................................................................................. 15 1.15.1 农用抗生素的分离纯化特点 ....................................................................... 15 1.15.2 农用抗生素分离纯化技术........................................................................... 16 1.15.2.1 预处理和固液分离................................................................................... 16 1.15.2.2 提取(初步分离) ...................................................................................... 17 1.15.2.3 精制(高度纯化) ...................................................................................... 18 1.15.2.4 成品制作................................................................................................. 20 1.15.3农用抗生素分离纯化的发展趋势 ................................................................ 21 1.16 农用抗生素的发展前景 ................................................................................. 22 1.17 多糖 ............................................................................................................. 23 1.18本研究的立题依据和目的意义....................................................................... 24 2 材料与方法....................................................................................................... 25 2.1 材料............................................................................................................... 25 2.1.1 发酵菌株 ..................................................................................................... 25

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2.1.2供试病原菌.................................................................................................. 25 2.1.3 培养基 ........................................................................................................ 26 2.1.4 试剂 ............................................................................................................ 26 2.1.5 实验仪器 ..................................................................................................... 27 2.2 实验方法........................................................................................................ 27 2.2.1菌种发酵培养 .............................................................................................. 27 2.2.2 发酵液预处理 .............................................................................................. 27 2.2.3抑菌活性测定 .............................................................................................. 28 2.2.4发酵液抑菌活性的贮藏稳定性...................................................................... 28 2.2.5 发酵液抑菌活性的pH稳定性....................................................................... 28 2.2.6发酵液抑菌活性的热稳定性 ......................................................................... 29 2.2.7发酵液抑菌活性的光稳定性 ......................................................................... 29 2.2.7.1发酵液抑菌活性的紫外光稳定性................................................................ 29 2.2.7.2 发酵液抑菌活性的日光稳定性 ................................................................... 29 2.2.8有机溶剂对发酵液活性物质的萃取实验........................................................ 29 2.2.8.1 萃取剂的选择 ........................................................................................... 29 2.2.8.2 萃取比例的选择 ........................................................................................ 29 2.2.8.3 萃取次数的选择 ........................................................................................ 30 2.2.9 粗分离 ........................................................................................................ 30 2.2.10 硅胶柱色谱................................................................................................ 30 2.2.10.1 硅胶薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）对硅胶柱色谱起始洗脱条件的选择实验 ...................................................................................................... 30 2.2.10.1.1 薄板的制备 .......................................................................................... 30 2.2.10.1.2 样品制备 .............................................................................................. 30 2.2.10.1.3 展开系统的选择 ................................................................................... 30 2.2.10.1.4点样 ..................................................................................................... 31 2.2.10.1.5展开与检测........................................................................................... 31 2.2.10.2 硅胶柱色谱分离 ...................................................................................... 31 2.2.10.2.1 样品制备 .............................................................................................. 31 2.2.10.2.2 柱层析用硅胶的预处理 ......................................................................... 31 2.2.10.2.3 装柱与上样 .......................................................................................... 31 2.2.10.2.4 洗脱和产物处理 ................................................................................... 32 2.2.11 硅胶薄层色谱制备抑菌活性物质 ................................................................ 32 2.2.11.1 硅胶薄层色谱展层条件筛选..................................................................... 32 2.2.11.2 薄层色谱法制备抑菌活性物质 ................................................................. 32 2.2.12高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)检测活性物质的纯度 ............................................................................................................. 32 2.2.12.1样品处理 ................................................................................................. 32

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2.2.12.2活性物质的全波长紫外检测 ..................................................................... 33 2.2.12.3 高效液相色谱洗脱条件筛选..................................................................... 33 2.2.12.4 高效液相色谱法检测纯度 ........................................................................ 33 2.2.13捷克八溶剂系统纸色谱 .............................................................................. 33 2.2.14 pH纸色谱 .................................................................................................. 34 2.2.15官能团反应试验 ......................................................................................... 34 3 结果与分析....................................................................................................... 34 3.1 抑菌活性测定................................................................................................. 34 3.2 Y23菌株发酵液的贮藏稳定性......................................................................... 37 3.3 Y23菌株发酵液的pH稳定性.......................................................................... 38 3.4 Y23菌株发酵液的热稳定性 ............................................................................ 38 3.5 Y23菌株发酵液的光稳定性 ............................................................................ 39 3.6有机溶剂对发酵液活性物质的萃取实验 .......................................................... 40 3.6.1萃取剂的选择 .............................................................................................. 40 3.6.2萃取比例的选择........................................................................................... 41 3.6.3 萃取次数的选择 .......................................................................................... 41 3.7硅胶柱色谱 .................................................................................................... 42 3.7.1硅胶柱色谱起始洗脱条件的确定 .................................................................. 42 3.7.2硅胶柱色谱分离........................................................................................... 43 3.8 硅胶薄层色谱制备抑菌活性物质..................................................................... 44 3.8.1 硅胶薄层色谱洗脱剂的筛选 ......................................................................... 44 3.8.2 抑菌活性物质的硅胶薄层色谱制备 .............................................................. 45 3.9高效液相色谱法检测活性物质的纯度 .............................................................. 47 3.9.1活性物质的全波长紫外检测 ......................................................................... 47 3.9.2高效液相色谱洗脱条件筛选 ......................................................................... 47 3.9.3高效液相色谱法检测纯度............................................................................. 49 3.10捷克八溶剂系统纸色谱及pH纸色谱 ............................................................. 49 3.11官能团反应试验............................................................................................ 50 4 结论与讨论....................................................................................................... 51 4.1抑菌试验 ........................................................................................................ 51 4.2发酵液预处理 ................................................................................................. 51 4.3发酵液的稳定性 ............................................................................................. 51 4.4发酵液活性物质的提取 ................................................................................... 52 4.5活性物质的分离纯化 ...................................................................................... 52 4.5活性物质的理化性质 ...................................................................................... 54 5参考文献 .......................................................................................................... 55 6附录 ................................................................................................................. 63 7致谢 ..................................................................................... 错误！未定义书签。

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中文摘要

烟草青枯病是由茄劳尔氏菌[Ralstonia solanacearum(E.F.Smith)]引起的一种细菌性病害，在国内的广东、福建等南方地区普遍发生。近几年来，该病的发生和危害范围有向北方烟区扩展的趋势，在山东、河南及陕西等省均有发生，局部地区为害较重，已成为烟草主要病害之一。

本实验室从来源于山东临沂的烟田土样中筛选出一株放线菌菌株Y23，该菌株对烟草青枯病菌等多种植物病原菌有明显的抑制作用。本实验主要从菌株Y23发酵抑菌活性物质的稳定性、理化性质、分离提纯方法等几个方面进行研究：

1．分别采用抑制菌丝生长速率法和琼脂扩散法测定了 Y23菌株发酵液对15种病原真菌、3种病原细菌的抑菌活性。结果表明，Y23菌株发酵液对禾谷镰刀菌、苹果轮纹病菌、大麦条纹病菌的菌丝生长抑制率达55%以上，占供试真菌数的20%；琼脂扩散法生测结果表明，Y23菌株发酵液只对烟草青枯病菌有抑制作用。发酵液的稳定性测定结果表明，发酵液低温贮藏效果好，对热、酸碱及紫外光照稳定性较强，对日光照稳定性较差。

2．发酵液通过有机溶剂萃取实验，选择乙酸乙酯为适宜的萃取剂。经预处理、溶媒萃取等步骤后，采用硅胶柱色谱对活性物质进行分离。首先以硅胶薄层色谱初步筛选分离条件，在此基础上，进一步优化柱色谱条件：依次采用石油醚∶异丙醇为9∶1、7∶3、5∶5、2∶8洗脱，结果取得了较好的分离效果。最后采用硅胶薄板层析法，以石油醚∶异丙醇∶甲醇为10∶1∶0.5做展开剂薄层层析时，分离得到了1种对烟草青枯病菌有明显抑菌作用的活性物质。

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放线菌菌株Y23活性物质的分离纯化及理化性质的初步研究

3．利用高效液相色谱对分离产品进行纯度分析，为得到最佳的效果，试验对色谱条件进行优化，结果为：色谱柱EclipseXDB_C18，5μm，4.6mm×150mm；以甲醇-水系统60∶40为流动相；流动相流速为1mL/min；柱温30℃；紫外检测波长207nm。结果表明，分离提取的活性物质纯度较高，可以满足光谱分析等进一步研究的需要。

4．拮抗产物纯品的理化性质和官能团反应。通过捷克八溶剂系统纸色谱和pH纸色谱检测，表明该活性物质是一类极性、酸性和水溶性较强的抗生素。通过官能团反应，结合紫外光谱分析，初步推断该拮抗产物纯品为一种多糖。

关键词：活性物质；分离纯化；理化性质

Abstract

Tobacco bacterial wilt caused by ［Ralatonia solanacearum(E.F.Smith) ］is a bacterial disease. It is widely occurred in Guangdong, Fujian and other southern areas of China. Recently, it has the tendency that expanded into north of China. It has happened and damaged severely in Shandong, Henan and Shaanxi province. It has become one of the major diseases on tobacco.

The strain of Y23 was isolated from the soil of the farmland being planted with tobacco in Linyi area of Shandong province of China，which has Strongly antagonistic against Ralstonia solanacearum. The purposes of this study are to identify the stability, characteristics of the antibiotics of Y23, and to isolate and purify the antibiotics，the main results are as follows：

1．Taking 15 epiphyte and 3 bacteria as object, antibiotics activity was studied. By means of mycelium growth rate, the results showed that the fermentation products of Y23

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had more than 55% control effects on Fusarium graminearum , Physalospora piricola , Drechslera graminea (20% of the total). By means of agar plate diffusion method, the text exhibited that the fermentation products of Y23 is just effective for refraining the growth of Ralstonia solanacearum. Though the research of stability of the fermentation products of Y23, it is indicated that Y23 had a high activity when it was stored up at 4℃, and is better stable to heat, acid, alkali and ultraviolet, but is less stable to sunlight.

2．The bioactive compounds from the culture of the strain Y23 were extracted with different solvents. The result showed that ethyl acetate was the optimal extraction for bioactive component for 3 times. After the culture was pretreated, the antibiotic substances were purified by silica gel column chromatography. The concentrated residue was passed through a silica gel column. A linear gradient elution was carried out using Petroleum ether-Isopropyl (9∶1, 7∶3, 5∶5, 2∶8). Then a antibiotic substance which has a distinct inhibition against Ralstonia solanacearum was isolated when TLC in Petroleum ether∶Isopropyl alcohol∶Methanol (10∶1∶0.5) as mobile phase.

3．The purity of this antibiotic substance was analyzed by high-performance liquid chromatography (HPLC) with a diode array detector using a EclipseXDB-C18 column. Analysis conditions were as follows: solvent system methanol-water(60∶40)at a flow rate of 1mL/min, with a UV detector at 207 nm. The result showed that the purity of the antibiotic substance was enough to analyze its characteristics.

4．The physico-chemical characteristics and the functional group response of the antibiotic product were studied. The partial physical and chemical properties of the antibiotic product were analyzed by Doskochilova system and paper chromatography pH. Results showed that the antibiotic product was a high polar, acerbic and hydrophilic antibiotic. The functional group response showed that the antibiotic product was a kind of polysaccharide, which was also proved by ultraviolet absorbability.

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Key words：antibiotics ; isolation and purification; character

1 引言

1.1 烟草青枯病的发生与危害

烟草青枯病1880年首次发现于美国，目前广泛分布于全世界的热带、亚热带和一些温暖的地区。在我国，该病在安徽、福建、江苏、云南、广西、河北、湖南、广东等地普遍发生（刘雅婷等，2001），个别年份常常暴发流行，造成毁灭性损失。发病重的地块产量损失达80%左右，已成为毁灭性病害（霍沁建等，2007）。

1.2 病原与主要症状

青枯病病原菌原为茄假单胞杆菌（Pseudomonas solancearum E.F.Smith），1995 年更改为茄劳尔氏菌[Ralstonia solannacearum (E.F.Smith)]（Cardoso等，1996）。菌体杆状，两端钝圆，大小为0.9～2μm×0.5～0.8μm，具1～3 根单极生鞭毛，偶有两极生。无内生孢子，无荚膜，为好气性细菌。革兰氏染色阴性，在肉汁蛋白胨培养基上菌落为小圆形，表面润滑有光泽，初为乳白色，后变为褐色。病菌生长的温

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度范围为18～37℃，最适温度30～35℃，致死温度为52℃持续10min；pH 值4～8，最适为6.6。烟草青枯病菌在病残体中可以存活7个月，在土壤或堆肥中可存活2～3 年以上，有的竟达8～25 年，但在干燥的条件下很快就死亡，在种子表面的病菌两天后即可全部死亡。青枯病寄主范围很广，可浸染茄、豆、凤仙花等44个科的数百种植物。除烟草外，对花生、辣椒、番茄、茄子及马铃薯等为害最重，但不浸染禾本科及麻类植物（霍沁建等，2007）。

烟草青枯病是一种典型的维管束病害，最显著的症状是枯萎，危害期多出现在旺长期或旺长期后，根、茎、叶各部均可受害。发病初期，先是病侧有一、二张叶片软化萎垂，但仍为青色，故称“青枯病”。发病的中前期，烟株一直表现一侧叶片枯萎，另一侧叶片似乎生长正常，这种半边枯萎的症状可作为与其他根茎类病害的重要区别。若将茎部横切，可见发病一侧的维管束呈黄褐色至黑褐色。若纵剖病茎，则见维管束的黑色病斑为长条状，但外表仍为暗黄色。发病后期，病株全部叶片萎蔫，髓部呈蜂窝状或全部腐烂，形成中空，但多限于烟株茎基部，可与髓部全部中空的烟草空茎病相区别。若将病茎横切，用力挤压切口，可见黄白色的乳状黏液自导管处渗出，即细菌溢脓。此外，茎上的黑色条斑和叶片上的黑黄色网状病斑是烟草青枯病最重要的症状特征。

1.3 青枯病菌的致病机制

作物青枯病菌引起多种植物的致死性枯萎，主要通过根和茎的伤口或次生根的根冠进入植物体，侵染寄主的木质部，然后在整个维管束中蔓延，引起严重的萎蔫，最终导致植物死亡。青枯菌可分泌于细胞外多种细胞壁降解酶（如果胶酶类和纤维素酶类），其可能在破坏导管组织，引起植株枯萎死亡方面有重要作用；青枯菌在导管中生长时可产生大量的胞外多糖 （EPS，polysaccharide），其影响和阻碍植物体内的水分运输，特别是易于对叶柄结和小叶处较小孔径的导管穿孔板造成堵塞，因而引致植株萎蔫。

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1.3.1 青枯菌的运动性

早先人们普遍认为青枯菌的野生型没有运动性，而自发无毒突变株一般都能够运动（Kelman等，1973）。后来发现青枯菌的一些野生型也具有十分明显的运动性，而且这种运动性是重要的致病因素之一（毛国璋等，1997）。

1.3.2 青枯菌胞外蛋白

青枯菌分泌多种蛋白质到胞外， 最主要的是97kDa、80kDa、52kDa、43kDa、41kDa和28kDa的蛋白质，这些蛋白质具有一些酶的活性，例如聚半乳糖醛酸酶和纤维素酶，估计这些胞外酶在细菌降解植物细胞壁的过程中发挥了重要的作用（Husain等，1958）。目前发现青枯菌产生一种葡聚糖酶，其分子量为43kDa，葡聚糖酶在致病过程中的作用与聚半乳糖醛酸酶相似，仅仅起着次要的作用（赖世龙，1998）。

1.3.3 青枯菌的胞外多糖

青枯菌的毒性菌株产生大量的胞外多糖，早在50年代人们就认为胞外多糖可能是青枯菌的致病因素，并着手研究青枯菌胞外多糖的病理学意义。上世纪80年代中期以来，已发展到从分子水平上研究这些因素的作用。佐治亚大学Denny实验室克隆出了控制胞外多糖等表型转变的基因phcA，认为这是一种综合调节基因（BrumbleySM等，1990；DennyTP等，1990）。近年进一步研究明确，这是一复合调节网络，该基因网络的成员可控制胞外多糖产生量、控制对某些环境条件或信号的反应，甚至可控制其它致病因素如纤维素酶（EG）、果胶酶（PGA）和28kDa胞外蛋白等编码基因的表达，胞外多糖是青枯病致病过程中的重要因素，其主要在引起萎蔫症状上起关键作用。

1.4烟草青枯病的发生发展规律

病菌多从烟株根部的伤口侵入，如伸根时的生理性伤口、地下害虫、土壤线虫造成的伤口均有利于病菌侵入，自下而上发展。移栽及中耕培土造成的伤口更利于病菌侵入，但是在菌量较大时，即使没有伤口

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也能从其他各个部位侵入。青枯病菌能分泌一种果胶酶，使寄主细胞的中胶层遭到破坏，维管束解体。病菌一旦侵入寄主组织，即行分裂繁殖，并进入维管束，进而向其他组织扩展蔓延（何礼远等，1995）。

青枯病菌主要在土壤中或遗留在土壤中的病残体上越冬，亦能在生长着的各种寄主体内越冬，其主要初浸染源是病土、病残组织及带菌肥料。在苗床及大田中，病菌借助水流、肥料、病苗、病土、人畜以及生产工具等传播，而且一年之中病菌可以反复多次传播和侵染而造成病害流行。中耕培土、打顶抹芽、收摘烟叶及昆虫为害等均能使病菌传播和侵入一并完成。高温（30℃以上）、高湿（相对湿度90%以上）是该病流行的主要气候因素，6～7月份如果天气阴雨连绵，就有利于该病的发生。另外，排水不良地块及线虫、地老虎等伤根害虫多的烟田容易发病。常年连作的烟田比经常轮作的烟田发病重（周本国等，1999）。

1.5 青枯病的防治方法

目前，青枯病的防治包括抗病品种选育（Zhang zhan yuan，1998）、化学防治和生物防治，且主要倾向于后两者，但从总体上看，对青枯病的防治研究重点已经转向生物防治为主的综合方法（Prior P，2006）。

1.5.1 药剂防治

药剂防治可以延迟青枯病的发病时间，有良好的防治效果。姚旺家等（2000）比较了农用链霉素，50% DT粉剂，Q201（生物制剂）防治烟草青枯病的药效，试验结果表明，3种药剂的施用对烟草青枯病的发生与危害均有一定的控制作用，其中以50 % DT粉剂1 500 g/hm2防治效果相对比较好，在青枯病始发期和盛发期的防效分别达42.72%和42.36%；孔凡玉等（2004）在1999～2000年进行了20 %青枯灵可湿性粉剂400倍，600倍，800倍3个处理防治烟草青枯病药效试验，结果表明，400倍，600倍两处理平均防效在62.1～81.5%，好于目前常用药剂农用链霉素。

1.5.2 生物防治

（1）微生物源的生物防治

BEKWE A M等（2002）从微生物群落结构入手进行防治研究。

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放线菌菌株Y23活性物质的分离纯化及理化性质的初步研究

王雅平等（1993）用分离自丝瓜土壤的枯草芽孢杆菌TG26浸根处理防治烟草青枯病，苗期防效可达100%，田间试验防效为79.6%，并有明显的增产效应。

Hayward等（1991）在菲律宾的研究发现，菌根菌可以减轻青枯病的发生。

郑继法（1994）对利用无毒产细菌素菌株防治烟草细菌性青枯病研究表明，用浸根法处理A3-5，A4-3，A1-4 三个无毒菌株对致病菌均有防治效果，其中A3-5防效最好，病情指数比对照降低50%～60%，并能推迟病害的发生，用多次浇灌法处理，只有A3-5 表现出良好的防治作用，病情指数比对照降低80%，推迟发病25 d。

尹华群等（2004）从烟草茎内分离得到的内生细菌001、009和011共3个菌株对烟草青枯病均有良好的防治效果，其中菌株001为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），菌株009和菌株011为短芽孢杆菌（B. brevis），经田间防效初步测定，这3株菌株的平均防效分别达到82.5%、100%和 84.5%。

湛方栋等（2004）从中性紫色土中筛选出了15株烟草青枯病拮抗菌，其中细菌两株，放线菌三株，其余为真菌，经平板拮抗试验表明：SXM-2，PCM-4，LCA-9有良好的拮抗抑制效果。 （2）植物源的生物防治

邓正平等（2003）为研制防治烟草青枯病的植物性药剂，选择山苍籽，大蒜和黄岑3种植物性药物对烟草青枯病进行了田间防效试验。结果表明：平均防效山苍籽为70.54%，大蒜为63.80%，黄岑为20.44%。用农用链霉素和烟病克两种农药与3种植物性药物作比较，两种农药效果不及山苍籽和大蒜而比黄岑好，山苍籽和大蒜处理的经济效益亦有明显提高。

1.6 放线菌

放线菌是一类具有丝状结构的革兰氏阳性细菌，营养细胞能分化形

成菌丝并能产生分生孢子。在这一过程中细胞发展了丰富而灵活的次生代谢来合成各种控制分化和细胞周期的专一性物质。在已经发现的近10

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000种微生物来源的生物活性物质中，约有2/3是由放线菌所合成的各种次生代谢产生（郭小芳等，2008）。放线菌是人们研究最早并应用到农业生产中的生防微生物，从放线菌中已经筛选到10多种有生防价值的链霉菌,这些种类在植物病害的防治中发挥了巨大的作用。

放线菌一般通过两种途径对靶标致病菌发挥生防作用，它能够在寄主植物组织内诱发其产生抗性或者产生抑菌物质，影响病原菌的繁殖、生长，最后导致靶标致病菌死亡，也可以通过抗生作用、竞争作用、捕食和重寄生作用，降低病原菌的致病性、侵染效率以及接种体密度，导致病原菌群体密度以及致病性下降。

1.7 利用放线菌开发抗生素的意义

化学药剂防治植物病害虽然能起到一定的作用，但是长期大量的施用化学药剂容易使细菌产生抗药性，引起土壤质地的变化，造成环境污染和药剂残留，严重影响人体健康，相比之下生物防治以其无残留无污染、不杀伤天敌、不会（或较少）产生抗药性、有利于人畜安全及环境保护、成本低、兼防兼治、增产增收而受到国内外研究者的广泛重视。在生物防治领域，使用农用抗生素类药物进行病害防治发展最快，广大研究人员一直不断的寻求新型抗生素来防治各种农业病害。

放线菌是抗生素等一系列生物活性物质的重要生产者，所产生的抗生素应用范围较广，数量也较多（COOK R J，1993）。目前世界药物市场上有67%的抗生素产品来自微生物，其中2/3又是放线菌产生（刘志恒，2004），因此通过研究放线菌来寻找新型抗生素的前景非常广阔。 从突尼斯土壤放线菌中分离得到的尼达霉素和天青菌素对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌有较强的抑制作用。采用核酸序列分析技术对该两种抗生素的产生菌放线菌U S24 进行鉴定，结果发现U S24 菌株为链霉菌（M ellouliL等，2003）。Ryan AD 等（2004）研究发现，产生抗生素的链霉菌对由疮痂链霉菌引起的马铃薯疮痂病有潜在抑制作用。A gbessiS等(2003)分离得到一株链霉菌EF276 产生格尔德霉素。Sam ac DA 等（2003）研究发现大多数产生抗生素的链霉菌菌株对苜蓿疫霉属的不同菌株的生长有抑制作用。链霉菌201 的培养上清滤液中得到一种新的有生

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物活性的复合物对尖孢镰孢菌、串珠镰刀菌和立枯丝核菌有明显的抑制作用（GojenN Bordoloi等，2002）。Kim Beom Seok 等（1999）用不同的层析方法从链霉菌中分离出有很高拮抗活性的抗生素A s1A。Sacramento DR等（2004）从巴西热带地区土壤中分离出链霉菌菌株606，该链霉菌产生抗病原细菌和抗病原真菌的活性物质，也有很强的抗病毒的生物活性。

1.8 放线菌的抗生作用机理

抗生的发生主要依赖于生防菌抗生素的产生，一般单株生防放线菌可以合成多种抗生素。抗生素的作用机理主要是：⑴ 广谱抗生素的抗菌机制:某些抗生素能抑制微生物共同的代谢途径，如蛋白质和核酸的合成，则可抑制许多不同种类微生物的生长。⑵ 除了干扰代谢作用外，有时也可影响病原菌的形态结构。⑶ 抑制微生物细胞代谢的某些环节或代谢中的某些酶系统。微生物重要代谢环节被抑制，生长发育出现障碍，甚至死亡。

1.9 利用放线菌开发抗生素过程中存在的问题及解决途径

用放线菌生产农用抗生素，进行植物病害生物防治，具有防效好、

作用谱广、功能多等优点。但大量单一使用抗生素会破坏自然界微生物的平衡，造成自然选择压力，人为地选择抗性病原菌，给控制该菌增加一定难度。在有效控制了优势致病类群的同时，又可能筛选出次要的致病类群，使其发展成优势种群。另外，抗生素的大量使用也会对人类造成一定的危害，例如黄单胞杆菌（Xathomonas）在人体上是非致病细菌，但由于抗生素的大量使用，它的某些种已成为人体病原菌。现在世界上许多国家在医学领域限制使用抗生素，现有的农用抗生素在不久的将来势必也会受到限制，所以进一步发掘放线菌中新的抗菌成分，缩短某一种抗生素的使用年限，努力实现防治同一种病害的抗生素资源的多样化会避免由于同种抗生素的大量长期应用所带来的弊端，同时在抗生素的生产工艺上改进发酵技术，选择合适的培养基质，改进生产工艺，

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进一步提高放线菌拮抗次生代谢物的分离纯化效率。以上措施的顺利实施，会使抗生素依然保持广阔的市场前景。

1.10 生物农药与农用抗生素的关系

生物农药传统意义上讲是指以可用来防治病、虫、草等农业有害生物的生物活体为原料制的生物制剂。近些年随着研究的深入以及对农业病虫害生物防治理论的进一步理解，对生物农药有了更加精确的定义：以防治病、虫、草等有害生物的微生物活体及其代谢产物和转基因产物为原料的生物源制剂都称为生物农药（张子明，1996）。在生物农药中，当前发展最快的是农用抗生素类药物，约占生物农药份额的90%。农用抗生素是微生物在其生命活动过程中产生的次级代谢产物，能在低浓度下选择性破坏其它微生物的生长，后来人们将具有抗病毒、抗癌、抑制酶活性的微生物产生的活性物质也归入其中（邓洪渊，2005）。

1.11化学农药的问题和抗生素类农药具有的优点

1.11.1 化学农药的问题

化学农药在自然界中不易分解，残留药物积累，最终会危害人类的健康；病原菌抗药性迅速上升，导致农药施用效果下降，防治成本大幅升高；杀菌选择性差，使植物体内外环境的微生物种群平衡遭到破坏，甚至导致病原菌成为优势菌群，间接加剧了病害的暴发流行。

1.11.2 抗生素类农药具有的优点

活性高，使用剂量低；选择性较高；环境相容性好（Cheng XC，

等）；化学结构复杂；生产原料大多为农副产品，资源广、经济，适于大规模的工业生产（黄大昉，2001）。

1.12 国外农用抗生素的研究进展

农用抗生素的发展起步较医用抗生素要晚一些，20世纪

40年代，美

国、英国、日本等国的科学家最早把链霉素（Streptomycin）、土霉素（Oxytertracyline）、灰黄霉素（Griseofulvin）等医用抗生素应用在植物

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放线菌菌株Y23活性物质的分离纯化及理化性质的初步研究

病害的防治上（Casteel P等，1989），此后如放线菌酮

（Cycloheximide）、抗霉素A（Actimycin A）等一批农用抗生素被相继报道出来。这一时期的农用抗生素并未表现出对化学农药的竞争优势，研究投入少，发展缓慢。1958年，日本Setsuo等研制出杀稻瘟菌素-S（Blasticidin-S）（沈寅初，1981），并在1961年成功的大面积推广用于防治真菌病害稻瘟病，基本上取代了有机汞在当时稻瘟病防治上的应用。杀稻瘟菌素-S是世界上第一种真正意义上的农用抗生素产品，农用抗生素的研究应用从此进入了一个崭新的时期。此后，春日霉素（Kasugamycin）、多氧霉素（Polyoxins）、有效霉素（Validamycin）等众多高效低毒抗菌农药新品种相继问世，投产并推广使用。20世纪80年代发现了最有影响力的新的杀虫抗生素avermectin和除草抗生素phthoxazollin，90 年代发现了最有影响力的新的杀虫抗生素spinosad和杀菌抗生素strobilurin。其中avermectin被美国默克等公司开发成目前世界上最好的产品；phthoxazollin被作为先导化合物合成出目前最好的除草剂—草甘膦系列；spinocad和strobilurin已经成为优秀的生物杀虫剂和杀菌剂（邱德文，2007）。

现在，国外农用抗生素的研究主要集中于以下几类： 大环内酯类：日本东京研究组从近海海泥分离到的链霉菌

（Streptomycin griseus）SS－20，能产生大环内酯APlasmomycins A－C，其化学结构有1对称环，中心为硼原子，经x射线测定，其结晶属于多烯离子载体物质，能抑制革兰氏阳性细菌。

醌类：由南加利福尼亚海沉积物中分离的放线菌CNB－632，得到倍

半萜萘醌酮化合物Marinone和去溴－Marinone，具有抑菌活性。从河口一株海洋放线菌CNH－370分离获得芳香类化合物Luisols A和B，其中Luisols A为蒽醌类抗生素，属黏菌素类。OKAZAKIT等在沙漠湾浅海泥分离的钦氏菌（Chainia purpurogena），可产生SS－228Y，是一种新型的苯丙蒽醌类 （Benzanthraquinone）抗生素，具有抗革兰氏阳性菌活性。同时也是一种多巴胺—B—羟化酶抑制剂。Dijksterhuis 等(1999)报道了多粘类芽孢杆菌能产生抗生素

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氨基糖苷类：冈见吉朗从日本Tenjin岛近海海泥中分离到一株链霉菌（Streptomycin tenjimariensis），产生一种氨基糖苷类化合物天神霉素（istamycins），主要组分为Istamycin A、B，具有强烈的抑制革兰氏阳性菌和阴性菌的作用，包括那些对原有的氨基糖苷类抗生素有抗性的菌种，其中组分B的抑菌活力是A的2—4倍（吴文伟等，2007）。

小环内酯类：海洋沉积物中的海洋芽孢杆菌（Bacillus sp.），产生一种新的异构香豆素 PM9128，这种碱基被取代的异构香豆素

（Isocopmarins）具有抗真菌和抗癌活性。Diane等从加利福尼亚海峡软珊瑚（Pacifigorgia sp.）表面上获得的一株链霉菌，提取到Octalactin A和B，为8员环内酯，具有抑菌活性。

蛋白及酶类：Weis发现乌贼体内共生的发光细菌（Vibrio cheri）能够产生过氧化酶，该酶具有同哺乳动物嗜中性粒细胞产生的抗菌活性的髓过氧化物酶相似的生化性质。

多肽类：佛罗里达珊瑚礁水母体附生放线菌，产生L—氨基酸形成的环肤SalinamideA和B，具有新的内酯环肽骨架，能选择性地抑制革兰氏阳性菌。Imada等从交替单胞菌（Alteromonass P.）分离得到一种低分子量多肽，称为Marinostatins，是一种广义的蛋白水解抑制剂，可抑制真菌甲壳质水解酶的活性。

杂环类:长臂虾（Palaemon nmacrodactylus）的共生海洋细菌 （Aheromonas sp.）能产生2，3—二氢吲哚二酮（2，3-indalinediane）或靛红（Istatin），对病原真菌（Logaridium callinectes）具有很强的抑制作用（张宁波，2006）。

1.13 国内农用抗生素研究进展

我国农用抗生素的研究，开始于50年代初期。我国老一辈植病学家

尹萃耘先生（1953）从陕西径阳的老苜蓿根土中分离到“5406菌株”，对棉花黄（桔）萎病有一定防治效果，揭开了我国农用抗生素研究的序幕。到60年代后期，中国科学院微生物所宋大康等先生相继筛选出灭瘟素、春雷霉素、多抗霉素产生菌，为我国农用抗生素事业作出了重大贡献。1970年国务院下发了《要积极推广微生物农药》的重要指示，进一

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放线菌菌株Y23活性物质的分离纯化及理化性质的初步研究

步促进了我国农用抗生素的发展。1973年上海农药所筛选出井冈霉素产生菌，经多次诱变筛选出高产菌株，并在我国多家农药厂投产，每年使用面积达1亿亩以上，为我国农用抗生素的研发积累了丰富的经验。20世纪80年代上海农药研究所开发的一种杀螨抗生素，它对哺乳动物几乎无毒.是一种安全的生物农药，和有机磷及氨基甲酸酯类化合物复配能明显提高它的生物活性（朱昌雄，2000）。20世纪90年代以来，国内先后报道筛选了一些具有自主知识产权的新农抗品种，其中杀虫抗生素有戒台霉素、梅岭霉素，杀菌抗生素有宁南霉素、波拉霉素、抑霉菌素等，但目前已实用化的品种仅宁南霉素1种。我国目前杀虫、杀菌抗生素类农药29 种，120个产品，生产厂家约100个，年产制剂80 000t以上，是生产农用抗生素的大国，但具有自主知识产权实用化的有影响力的新农抗品种少。我国“九五”期间登记的宁南霉素是一种新结构抗生素，对番茄等作物病毒病和青枯等细菌病害表现出良好防效。但其发酵工艺尚需进一步完善。“八五”期间研制成功的中生菌素，对水稻白叶枯等多种细菌性病害防效显著，目前尚只有水剂和可湿性粉剂两种，还不能满足不同作物和不同生态环境应用需要。

1.14 农用抗生素的开发模型

1.14.1构建农用抗生素开发模型的必要性

新型农用抗生素的开发，一方面集中在新领域微生物资源的开发，另一方面则集中在开发模型的建立上（尹苹耘，1983）。实践证明，一种有效的农用抗生素的出现与其开发模型有关，开发模型越先进越完善，发现新抗生素的概率也越高，研制新农药的速度也就越快，因此，选择合适的抗生素开发模型，对于新型抗生素的研发具有十分重要的意义。

1.14.2 开发模型

农用抗生素作为一种生物农药，经过多年的发展，逐渐形成了自己固定化的开发模式（图1）（顾觉奋，2000）:

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图 1 抗生素筛选 Fig 1 screening of antibiotic

1.15 农用抗生素的分离纯化

1.15.1 农用抗生素的分离纯化特点

生化产品的分离和纯化具有生物学的特点，因此有其特殊的要求。例如，生物合成的发酵液（或反应液）是很复杂的多相体系。它含有微生物细胞、代谢产物、末用完的培养基等，杂质含量较高；有的还具有非常相似的化学结构及理化性能；有的具有生理活性物质，极不稳定，遇热或遇某些化学试剂极易失活或分解等。因此，从发酵液中提取、分离、纯化抗生素是一项极其复杂的工艺，主要有以下几个特点（孙彦，1998）：

⑴ 生物物质的生理活性大多是在体内的温度和条件下发挥作用的，对温度、pH值和化学试剂非常敏感,常因环境条件的变化而降低活性或失活，因此对分离纯化提出了较为苛刻的要求。

⑵ 生物产品—农用抗生素一般与人类生命息息相关，因此要求分离纯化的过程必须除去原料中含有的热源及具有免疫性的异源蛋白等对人

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体有害的物质，并防止这类物质在操作过程中从外界混入，但允许无害的少量杂质存在，要根据目标产物的使用目的，完全除去妨碍其性能发挥的杂质，但不像电子材料和无机材料要求得非常高的纯度。

⑶ 原料液中常存在可降解目标产物的杂质，如可水解目标产物的蛋白酶，因此要采用快速的分离纯化方法除去影响目标产物稳定性的杂质。

⑷ 生物大分子常存在着分子式或分子结构相同、理化性质极其相似的分子及异构体，造成了常用方法难于分离的混合物，因此要用特殊的高效分离技术纯化目标产物。

⑸ 分离纯化困难，不少生物产品，由于没有开发出技术上先进、经济上可行的提取方法或提取收率太低、成本过高而不能投产。

⑹ 原料中目标产物的浓度一般都很低，有时甚至是极其微量的，这样就有必要对原料进行高度浓缩，因此下游加工过程的成本显著增大，如酒精的浓度最高为10%，氨基酸为1%～5%，抗生素为0.1%～3%，工业酶为0.01%～0.1%，单克隆抗体为0.0001%～0.01%，而医疗用酶只有10-9左右，通常产品的成本和售价同产品的原始浓度成反比，资料表明，生物产品分离纯化费用通常占制造总成本的40%～60%。

1.15.2 农用抗生素分离纯化技术

目前的分离、纯化技术,按生产过程一般分为以下4个阶段：（1） 预处理和固液分离。（2） 提取（初步分离）。（3） 精制（高度纯化）。（4）成品制作。

1.15.2.1 预处理和固液分离

主要技术有过滤和离心,目的是去除高价无机离子和蛋白质以及发酵液中的不溶性固形物杂质和菌体细胞（沈寅初，2000）。过滤和离心相比，无论是投资费用还是运转费用都要小的多，因而首选方法应是过滤。但因发酵液中的不溶性固形物和菌体细胞均是柔性体，细胞个体很小，特别是细菌，过滤时形成的滤饼均是高度可压缩性的，所以容易造成过滤困难。离心是指利用装有固体颗粒悬浮液的容器迅速旋转产生离心加速度，使颗粒沉降的过程。离心有离心沉降和离心过滤之分，根据离心要求，选择不同的转速和离心时间，可以达到满意的离心效果。

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对抗生素发酵液进行预处理，一方面在于分离菌丝、除去杂质；另一方面还可以利用滤液性质的变化，尽可能使目标物转入便于操作的一相，以利于后面步骤的操作，保证成品的质量。例如用高浓度甲醇、乙醇或丙酮溶液浸提发酵液，既可以沉淀出大部分不溶性多糖和蛋白杂质又可以降低发酵液粘稠度，有利于过滤、色谱分离等进一步处理（Cohen B E等，1986）。再如采用有机溶剂乙醇∶丙酮（1∶1）的混合液可以很好的除去红树林放线菌发酵液中的的蛋白等杂质，有利于活性物质的分离纯化（廖文彬等，2004）。 1.15.2.2 提取(初步分离)

提取的目的是除去与产物性质差异较大的杂质，为后道精制工序创造有利条件。提取操作中，通常是目的产物要求有较大浓缩比的过程,根据原理不同抗生素的提取方法一般分为沉淀法、溶媒萃取法、吸附法等。

沉淀法：利用了抗生素和某些酸碱形成不溶性的盐而沉淀，且此沉淀在改变条件后，可以使沉淀物重新溶解的特性。对于碱性和两性的抗生素可用不同种类的酸作为沉淀剂，酸性抗生素可和有机碱形成盐而沉淀。如红霉素可与草酸或乳酸成盐而沉淀，四环素在碱性条件下能和钙、镁等金属离子或某些季胺碱形成复合物而沉淀。对于多肽类抗生素等两性化合物，通过盐析或适当调节溶液pH值可使被分离物沉淀出来，再经过其他方法收集处理，也可起到纯化的目的。例如应用硫酸铵分级盐析法提纯枯草杆菌BS-98分泌的抗真菌蛋白，30%和70%两级饱和度，先经30%饱和度下盐析沉淀出蛋白杂质，再在70%饱和度下盐析提取活性蛋白（胡剑等，1997）。

溶媒萃取：利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同，使溶

质选择性的从一种溶剂转移到另一种溶剂中而得到纯化或浓缩的方法。所选用的溶媒对目的抗生素应有较大的溶解度和选择性，用量较少就能将其从发酵液中完全提取，两种溶媒尽量不能混溶或部分混溶，以便能形成两相分开。

尽管选择性更高、分离度更好的现代分离技术和方法不断出现，但还是不能完全替代溶媒萃取法。溶媒萃取法作为一种传统的分离技术，目前

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仍然在广泛应用于在抗生素工业生产中，螺旋霉素、林可霉素、青霉素等都采用溶媒萃取法提取（Yong M M，1985）。

吸附法：吸附法是利用吸附剂与抗生素之间的分子引力而将抗生素吸附在吸附剂上。常用的吸附剂有大孔吸附树脂、氧化铝、活性炭等。大孔吸附树脂是当前微生物天然产物分离技术领域发展最迅速、最活跃的分支之一，目前它已逐渐取代活性炭和氧化铝等吸附剂，在抗生素工业中显示出越来越重要的地位。大孔吸附树脂适合于吸附各种抗生素，它不仅可吸附脂溶性化合物，而且可以吸附水溶性化合物（Dutta M等，1999）。对于一些属于弱电解质或非离子型的抗生素，现在可考虑用大孔吸附树脂法提取（顾觉奋，1991）。 1.15.2.3 精制(高度纯化)

目的是除去与产物的物理化学性质比较接近的杂质。发酵滤液经粗提后，须进一步精制。目前抗生素精制还主要是借助色谱技术。其基本原理是由于混合物中的各个单一组分对两相不同的亲和力和向两相不均匀扩散的可能性而导致在固定相和移动相之间的不均匀分配。色谱法有不同的分类根据，按照分离机理，色谱法可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和排阻色谱；按使用频率，最常用的有薄层色谱、硅胶柱色谱、高效液相色谱等常见色谱方法。本文主要介绍常用色谱。

⑴ 薄层色谱法：它是以涂布在玻璃板等载体上的硅胶、微晶纤维素等基质为固定相，以液体展层剂为流动相的一种色谱方法，当流动相流过加有样品的固定相时，由于各组分在两相间的浓度比不同，就会以不同速度移动而分离开来。固定相的种类很多，不同性质的固定相适用范围不同，分离亲脂性化合物常选择有氧化铝、硅胶、乙酰化纤维素等；而硅藻土、纤维素、聚酰胺等则适合分离亲水性物质（Roy K等，1987）。在各类抗生素分离纯化研究中，硅胶是最常采用的固定相，90%以上的薄层色谱分离工作都可使用硅胶。李德顺，苏中锐等（2004）分离山东链霉菌产抗真菌活性物质，采用硅胶G薄板以正丁醇∶乙酸∶水（V/V/V）=3:1:1为展层剂进行操作，经生物显影，只有1个抑菌圈，其Rf值为0.487，说明该抗生素为单一组分，通过硅胶G薄板可以达到分离的目的，并为硅胶柱层析选择溶剂系统提供了参考。

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薄层色谱具有分离时间短，操作方便，比移值Rf受外界影响小，灵敏度高等优点，因此在抗生素少量样品的制备、纯化及分析鉴定等方面应用非常广泛。它是一个开放体系，所以可以直接观察被分离物质的状态，这一点其他色谱方法都不具备，进而切割色带回收样品较柱层析等方法较为方便。观察薄层色谱分离效果、定位分离目的物主要靠紫外荧光法、化学显色法以及应用生物自显影技术，其中生物自显影将薄层层析的分离功能和生物活性显现集于一体，当不同的成分经过TLC分开，同时结合抗菌筛选，快速准确的找到活性物质在薄层层析板上的位置，极大的提高了寻找目的产物的效率。

⑵ 硅胶柱色谱法：该方法的特点是进样量大，可用于用大量制备，但一次性获得样品的纯度不高，需通过多次重复使用才可得到较高纯度的样品，在实际研究中更多的是作为高效液相色谱法等精制方法的前提步骤。它是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱状的一种色谱方法。其分离过程，实质上是吸附、解吸、再吸附的连续过程。在硅胶柱色谱法中，分离效果的好坏很大层度上取决于所使用的洗脱剂，由于该法与薄层色谱在原理上具有相似性，所以在硅胶柱色谱洗脱剂的选择上通常的做法是以薄层色谱来对洗脱剂初步筛选，这样就节省了大量的时间和实验成本。但值得注意的是，由于柱色谱流动相流速快，各组分与硅胶还没达到吸附平衡就被流动相带走，降低了塔板分离效率，而且扩散作用的影响要比薄层色谱大一些，所以在实际应用中硅胶柱色谱所采用的洗脱剂的极性要比薄层色谱的展层剂小一些，并且多采用极性低一些的洗脱剂并配合梯度洗脱，以达到较好的分离效果。MotooKoitabashi等（2004）采用硅胶吸附柱，以正己烷—乙烷为流动相，体积比100:1至30:1梯度洗脱，成功的从真菌菌株Kyu-W63发酵液浓缩物中分离出两种脂溶性抗真菌组分PTF和PDF。

⑶ 高效液相色谱法（HPLC）：上世纪60年代以后，随着流动相输送和被分离物质检测技术的进步和柱色谱填料的改进，高效液相色谱技术迅速发展起来。它对样品的适用性广，不受样品的挥发性和热稳定性限制，有分离效果好、灵敏度高、分析速度快和操作方便等优点，具适

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放线菌菌株Y23活性物质的分离纯化及理化性质的初步研究

宜于各种类型抗生素分离分析（Arai N等，2000）。目前，HPLC已成为应用最为广泛的高精度色谱技术。

按分离检测任务及特点，HPLC分为分析型HPLC和制备型HPLC来两种。分析型HPLC的色谱条件和结果是抗生素鉴定和检测的重要依据，而制备型HPLC则常被用于抗生素的最后精制。

HPLC中最常用的检测器是紫外检测器，其所能检测的物质必须具有吸收紫外光的生色团，而相应的流动相在检测波长下应当是无紫外吸收的。由于抗生素等大多数天然产物都具有一个或多个特征紫外吸收波长，因此紫外检测器能够满足大多数此类物质的检测需要。孙宇晖等（2002）采用高效液相色谱法同时分离测定聚醚类抗生素—南昌霉素和十六元大环内酷类抗生素—梅岭霉素，流动相为乙睛水溶液，其梯度洗脱程序为57％乙腈（30min）-70%乙腈（2min）-80％乙腈（2min）-90％乙腈（16min），检测波长为234nm，得到的回收率分别为98.63%和97.63%，保留时间的RSD分别为0.45和0.36。对于那些没有紫外吸收的分析样品，可通过衍生化反应对其结构进行修饰，使之具备特征紫外生色团予以解决。

HPLC流动相的选择是整个分离、分析过程能否成功的关键，通常以高极性的水与相对低极性的甲醇、乙腈等水溶性高的机溶剂搭配组成，通过调节水与有机溶剂的比例及流动相的流速来达到最分离效果。而对于无法通过上述条件的选择达到理想效果的，可以在水中加入某些弱酸或弱酸盐，通过对流动相离子强度、pH值的调节，优化HPLC分离效果。

1.15.2.4 成品制作

最后的精制成品需干燥。干燥的方法很多，如真空干燥、冷冻干燥、红外线干燥等（扶教龙等，2002）。另外，成品形式与产品的最终用途有关，有液态产品也有固态产品。

一般工艺流程和单元操作（图2，（苏蕾，2007））：

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图2 分离纯化工艺流程

Fig 2 The purification process of antibiotic

1.15.3农用抗生素分离纯化的发展趋势

目前，农用抗生素分离纯化常用的过程有沉降、离心、过滤、萃取、

吸附、离子交换、结晶等，其中沉降、离心、过滤是大多数生物加工过程所共有的操作，而液相制备色谱法分离提纯农用抗生素是最近几年发展最快的技术，该技术可有效地简化和缩短生物制品分离纯化过程，有效地提高产品纯度和加工收率，代表着现代农用抗生素分离纯化的一个发展趋势。

随着生物技术的高速发展，新的分离纯化技术不断涌现：粗分离技术中使用球磨、压力释放及冷冻加压释放等细胞破碎方法以分离胞内产物；沉淀技术采用絮凝剂，使细胞或溶解的大分子聚结成较大的颗粒，加大沉降速率易于过滤，强化菌体分离；萃取在原有基础上，发展了多级连续萃取、双水相萃取、超临界萃取、液膜萃取、反胶团萃取等新技术；膜分离新技术发展迅速，高强度、抗污染的各种膜不断出现，其中又以超滤膜发展较快，可根据膜孔度将分子量大小不同的分子进行分离，推出了平板、板框、中空纤维和螺旋型等多种型式的成套超滤器，无机膜微滤（平均孔径一般为0.2～2μm）也已开发出成套膜组件，以管式居多，成功地用于分离微小细胞、酒类、饮料、口服液的澄清过滤，

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生化产品的错流过滤及空气除菌净化等，反渗透装置也日益增多；离子交换树脂、大孔网状离子交换树脂及大孔网状吸附树脂用于纯化蛋白质及多种活性物质等；针对生物制品的干燥技术也取得了相当的进展，如喷雾干燥、气流或流化床干燥、冷冻干燥等。此外，凝胶过滤介质、新型琼脂糖系列介质等均已实现规模生产。

1.16 农用抗生素的发展前景

目前，全世界每年新研制成功和登记注册的生物农药品种正以4%的速度递增；预计到2015年，生物农药占所有农药的份额将由现在的2%～3%增加到5%（朱昌雄，2003）。我国农用抗生素的研制目前还存在低水平重复的问题，因此，今后我国农用抗生素的研究重点主要集中在以下几个方面：

⑴ 加强农用抗生素的菌种诱变选育工作，进而丰富抗生素的品种，使产量和品质得到进一步的提高和改进。

⑵ 利用计算机信息技术将筛选出来的抗生素的几项主要数据输入后与数据库进行比对，迅速得知是否具有新的抗性或属于哪种抗生素类型，提高工作效率。

⑶ 利用发酵工程技术研究农用抗生素发酵代谢规律，旨在创制出有利于提高生产抗生素水平的发酵控制关键技术，获得大幅度提高发酵水平的新工艺，分析不同抗生素的结构和特性，选择高效安全的生物化工制剂。

⑷ 重点改造一些天然的农用抗生素以增加其用途或提高其药效。采用基因工程手段构建只能合成单一杀虫活性组分的工程菌，开发广谱、高效、安全、无残留、无副作用和无环境污染的农用抗生素。

二十一世纪是一个崭新的世纪，是生物农药在农药领域全面发展的世纪。农用抗生素作为第三代农药的主力军，正在更加广泛的领域发挥着它的作用，随着分子生物学及细胞生物学、微生物学等相关学科的发展，生物工程技术和工业发酵控制技术正逐渐变得成熟完善，这必将促进农用抗生素筛选、抗生素合成、品种改造及更新的全面发展。相信在不远的将来将会有更多的农用抗生素品种被开发用于农业生产。另外，

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对农用抗生素、病原物及植物之间相互作用机理研究得深入，必将在更深层次上使人们认识农用抗生素，使农用抗生素在更加广泛领域发挥它的作用，为全世界农业的发展做出更大的贡献。

1.17 多糖

多糖是由许多单糖分子以糖苷键结合而成的高分子碳水化合物，可用通式(CH2O)n表示。组成的单糖可以是相同的也可以是不同的。由相同的单糖组成的多糖称为均一多糖，如淀粉、纤维素和糖原；以不同的单糖组成的多糖称为杂多糖，如阿拉伯胶是由戊糖和半乳糖等组成。

多糖具有各种各样的生物功能，如多糖的糖链能控制细胞的分裂与分化，调节细胞的生长与衰老，能增强机体的免疫功能等。20世纪70年代，对多糖生物活性的研究领域日趋广泛，相继发现糖类物质具有抗炎、抗病毒、抗辐射、降血脂、抗水肿、抗消化性溃疡、诱导干扰素产生、促进蛋白质、核酸生物合成等功能。80年代后，发现一些天然的或人工合成的硫酸酯化多糖对艾滋病病毒有明显的抑制作用，这引起了人们极大的关注与兴趣。

随着对多糖生物活性和药理作用进一步研究，现已确证，炎症和自身免疫疾病、老化、癌细胞的异常增生和转换、病原体感染、植物和病原体相互作用、植物与根瘤菌共生等生理和病理过程都有糖的介导（张树正，1999）；糖类作为信息分子在受精、发育、分化、神经系统和免疫系统衡态的维持等方面亦起着重要作用（宋绍富等，2004）。

传统的天然多糖和化学合成的高分子化合物都有其局限性，微生物发酵生产胞外多糖则克服了它们各自的缺点。微生物多糖生产周期远低于植物和海藻多糖，而且产品产量、质量和价格受季节和气候影响不大（Giavasis I等，2000；Dornish M等，1996）。与高分子化合物相比，微生物多糖可以安全地应用并容易被微生物降解，不会对环境造成污染（Li Z.J等，2000）。它是微生物在生长代谢活动中分泌到细胞壁外的多糖或多糖混合物，尤其是粘液多糖，易于与菌体分离，因而大多具有应用价值（Costerton等，1984）。微生物多糖开发中最重要的一点即发酵生产。在发酵培养过程中，培养基中无机离子的类型和浓度对微生物胞外

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放线菌菌株Y23活性物质的分离纯化及理化性质的初步研究

多糖的合成有重要影响，尤其是金属离子，它可能参与胞外多糖合成酶系的转录与翻译的调节或激活某些酶（Vuyst等，1987；Martins L O，1990；Vuyst L D，1994）。

在生物活性研究领域中，被广泛认可的微生物多糖大都为胞内多糖及其复合物，如裂褶菌多糖（Kojima E，1986）、云芝多糖（单友亮等，1998）、香菇多糖（方积年等，1997）等；而被成功应用的微生物胞外多糖尚不多见，目前报道的仅有热凝多糖（Susanne A等，2000）、乳酸菌胞外多糖（胡东良，1997）等少数几种。

多糖的应用领域目前主要集中在医药、食品工业、石油工业等领域。在医药领域的应用研究主要集中在多糖成分的生物活性功能、药理作用与免疫保健作用。如硫酸香菇多糖等（王长云等，2000）具有抗病毒活性；能促进核酸和蛋白质的生物合成，如灵芝多糖、黄芪多糖等（王克夷等，1984；王道苑等，1984）。微生物多糖在食品工业中的应用比较广泛，可以用作食品添加剂、抗凝剂，保鲜剂等，已经获得工业应用的有结冷胶（应恺，2004；金丰秋等，2003）、黄原胶（宋国安等，1997；聂凌鸿等，2003）和热凝胶（詹晓北，2001）等。目前用于石油开采的微生物多糖主要有黄原胶等，其中黄原胶可改善注水井吸水剖面，提高注入水的利用率和油藏的注水采收率（杨建雨等，2001）。

1.18本研究的立题依据和目的意义

生物防治的基础是获得高效拮抗菌（BERGJ等，2000）。本实验室从山东临沂烟田发病烟株的原位土壤中筛选到了一株拮抗放线菌，编号Y23。前期研究表明，放线菌菌株Y23对烟草青枯病菌具有很强的拮抗作用，其发酵液对烟草植株无害且具有一定的促生效果（张薇，2009）。但对该菌产生的次生代谢物的生物活性及其分离提纯条件还知之甚少。因此探明其发酵活性成分的生物活性及分离纯化条件成为本文研究的重点。

本文从以下几个方面对放线菌Y23的抑菌活性物质开展研究： ⑴ 对Y23菌株发酵液的抑菌活性进行测定，初步判断其研究价值。

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⑵ 对抑菌活性物质的稳定性进行研究，主要从热稳定性、酸碱稳定性、紫外线稳定性等几个方面入手研究。

⑶ 分离提纯活性物质。选择适宜的分离提纯方法，得到较高纯度的抑菌活性物质。

⑷ 对抑菌活性物质的精提物进行理化性质研究，确定抑菌活性物质的离子特性，初步判断它的类别，获得该物质的部分检测特征参数，为后续的研究奠定基础。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 发酵菌株

Y23菌株是从山东临沂、日照主产烟区烟田采集病株的根围土壤中

分离纯化得到的一株放线菌（Streptomyces sp.）。

2.1.2供试病原菌

供试真菌：烟草黒胫病菌（Phytophthora parasitica var.

nicotianae）、烟草炭疽病菌（Collettrichum nicotianae ）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、苹果炭疽病菌（Glomerella cingulata）、小麦赤霉病菌（Gibberella zeae）、甘薯黑斑病菌（Ceratocystis fimbriata）、烟草赤星病菌（Alternaria alternata)、禾谷镰刀菌（Fusarium

graminearum）、苹果轮纹病菌（Physalospora piricola）、玉米弯孢霉叶斑病菌（Curvularia iunata）、黄瓜炭疽病菌(Gloeosporium orbiculare)、

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放线菌菌株Y23活性物质的分离纯化及理化性质的初步研究

辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）、小麦根腐病菌（Bipolaris sorokinana）、玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）、大麦条纹病菌（Drechslera graminea），以上病原真菌均由山东农业大学农业微生物重点实验室植物病害诊断与防治研究室提供。

供试细菌： 枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtills）、青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum) 、软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora），以上病原细菌均由山东农业大学农业微生物重点实验室植物病害诊断与防治研究室提供。

2.1.3 培养基

固体培养基 PDA培养基（蔗糖

10g，琼脂粉10g，马铃薯200g，蒸

馏水1 000mL，pH ≈7）、高氏一号培养基（可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，MgSO4·7H2O 0.5g，琼脂粉10g，蒸馏水1 000mL，pH ≈7）。所有培养基在0.1MPa下灭菌30 min 备用。

发酵培养基 可溶性淀粉

10g，酵母浸出粉4g，K2HPO4 0.25g，蒸馏

水1000mL，pH ≈7，该发酵培养基由本实验室筛选取得。

2.1.4 试剂

蔗糖（天津市永大化学试剂开发中心）、琼脂粉（日本曹达株式会社）、可溶性淀粉（天津市凯通化学试剂有限公司）、KNO3（上海市化工厂）、NaCl（天津市凯通化学试剂有限公司）、FeSO4·7H2O（天津市凯通化学试剂有限公司）、MgSO4·7H2O（北京五七六〇一化工厂）、薄层层析用硅胶（青岛海洋化工厂）、柱层层析硅胶（青岛市基亿达硅胶试剂厂）、石油醚（天津市北方天医化学试剂厂）、乙醚（天津市恒兴化学试剂制造有限公司）、苯（天津市凯通化学试剂有限公司）、氯仿（天津市凯通化学试剂有限公司）、乙酸乙酯（天津市凯通化学试剂有限公司）、分析级甲醇（天津市巴斯夫化工有限公司）、色谱级甲醇（天津市凯通化学试剂有限公司）、异丙醇（天津市凯通化学试剂有限公司）、羧甲基纤维素（CMC）北京化学试剂厂、茚三酮（上海创业中心精细化工研究所）、蒽酮（国药集团化学试剂有限公司）、正丁醇（天津市凯通化学试剂有限公司）、对甲苯磺酸（天津市英博试

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剂有限公司）、乙酸（天津市凯通化学试剂有限公司）、六氢吡啶（天津市凯通化学试剂有限公司）、苯（天津市凯通化学试剂有限公司）、甲醇（天津市凯通化学试剂有限公司）、NaCl（天津市凯通化学试剂有限公司）、NaSO4（天津市德恩化学试剂有限公司）、Na2HPO4·2H2O（兖州化工厂）、柠檬酸（天津市永大化学试剂开发中心）、NaOH（济南天桥精细化学品公司）、无水CuSO4（天津市凯通化学试剂有限公司）。

2.1.5 实验仪器

SIGMA1-14型台式高速离心机、Eppendorf 5804R型台式冷冻离心、LRH-250生化培养箱、SPEG AIR TECH超净工作台、Agilent 1200型高效液相色谱仪、Heidolph4002型旋转蒸发仪、WD一9403C型紫外分析仪、 UV-2800型紫外可见光分光光度计、302型电热鼓风干燥箱。

2.2 实验方法

2.2.1菌种发酵培养

菌种斜面培养：无菌操作环境下，以接种环将菌株

Y23孢子涂布于

PDA斜面培养基上，27℃培养7天，保藏备用。

发酵培养：采用摇瓶发酵培养法。在250mL三角瓶中装入50mL发酵培养基，接种量2%（V/V），摇床转速为200 r/min，发酵温度为26℃，发酵时间为96h。

2.2.2 发酵液预处理

将发酵液以10 000r/min的速度离心10min去除发酵液中的菌丝体等固体，取上清液，微孔滤膜（0.22μm）抽滤除去上清液中悬浮的细小杂质。

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2.2.3抑菌活性测定

抑制生长速率法：取

Y23菌株发酵液15mL与150mL冷却到45℃的

PDA培养基迅速混匀，平均倒入10个无菌培养皿内，冷却后在每个培养皿平面放入1个供试菌的菌饼（直径为5mm）反接于培养皿中央（培养皿直径为90mm），置26℃培养72h，以无菌水处理作为对照，重复3次。采用十字交叉法测定菌落直径，计算抑制率(刘晓妹，2003)。

菌丝生长抑制率= （对照菌落直径–处理菌落直径） (对照菌落直径–5)×100 ⑴

琼脂扩散法 以董锡文等（2008）的方法为基础进行改进，取1mL细菌菌悬液（张薇等，2007）与150mL已融化冷却到45℃的PDA培养基迅速混匀，平均倒入10个无菌培养皿内，待培养基凝固后用打孔器（直径5mm）在每个培养皿内打孔两个，一个注入发酵液30μL，另一个以无菌水作对照，每个处理重复3次，取平均值。置于26℃的恒温箱中进行培养，24h后测量抑菌圈直径。

抑菌圈直径=测量值–5mm ⑵

2.2.4发酵液抑菌活性的贮藏稳定性

取发酵液50mL，平均分成两份，分别装入无菌的密封三角瓶中，分别在4℃冰箱和在室温条件下保存，在第3天、第7天、第15天、第30天测定抑菌生物活性，采用琼脂扩散法测定，试验重复3次，试验温度为室温，以烟草青枯菌为指示菌。

2.2.5 发酵液抑菌活性的pH稳定性

取30mL发酵液9份，用1mol/L的NaOH溶液和1mol/L的HCl溶液分别调pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、9.0、10.0、11.0，2h后调回自然pH值（pH≈7），以未经处理的发酵上清液（pH≈7）为对照，用滤纸片法（徐叔云，2002）进行抑菌活性测定。试验重复3次，试验温度为室温，以烟草青枯菌为指示菌。

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2.2.6发酵液抑菌活性的热稳定性

取30mL发酵液，分别置于50℃、60℃、70℃、90℃、100℃下水浴中处理30min后，以未处理的发酵上清液为对照，以琼脂扩散法测定不同处理的发酵液的抑菌圈直径，根据抑菌圈直径来确定其热稳定性，试验重复3次，试验温度为室温，以烟草青枯菌为指示菌。

2.2.7发酵液抑菌活性的光稳定性

2.2.7.1发酵液抑菌活性的紫外光稳定性

将发酵液置于无菌培养皿中，然后将盛满发酵液的培养皿放在距离紫外灯30cm的位置，打开紫外灯照射，在第1h、3h、6h、9h分别取1mL放入无菌试管中，以不作处理的发酵上清液为对照，以琼脂扩散法测定不同处理的发酵液的抑菌圈直径，根据抑菌圈直径来确定其紫外光稳定性，试验重复3次，试验温度为室温，以烟草青枯菌为指示菌。 2.2.7.2 发酵液抑菌活性的日光稳定性

将发酵液置于无菌培养皿中，然后将盛满发酵液的培养皿放在日光下照射，在第1h、3h、6h、9h分别取1mL放入无菌试管中，以不作处理的发酵上清液为对照，以琼脂扩散法测定不同处理的发酵液的抑菌圈直径，根据抑菌圈直径来确定其日光稳定性，试验重复3次，试验温度为室温，以烟草青枯菌为指示菌。

2.2.8有机溶剂对发酵液活性物质的萃取实验

2.2.8.1 萃取剂的选择

取20mL发酵上清液5份，分别加入等体积石油醚、乙醚、苯、氯仿和乙酸乙酯，装在250mL三角瓶后封口放入摇床上震荡，转速为50r/min，温度为26℃，震荡2h，取出后放入分液漏斗静置分层1h，分别收集有机相和水相，以烟草青枯病菌为指示菌，以相应的有机溶剂为对照，测定各个有机相的抑菌活性，试验重复3次。 2.2.8.2 萃取比例的选择

取

6份乙酸乙酯各20mL，分别与体积为5mL、10mL、20mL、

40mL、60mL和80mL的发酵上清液混合后装入250mL三角瓶后封口放入摇床上震荡，转速为60r/min，温度为26℃，震荡1h，取出后放入分

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液漏斗静置待其分层，分别收集有机相和水相，以烟草青枯病菌为指示菌，以有机溶剂为对照，测定各个有机相的抑菌活性，试验重复3次。 2.2.8.3 萃取次数的选择

取20mL发酵上清液5份，分别用等体积的乙酸乙酯萃取1-5次，取样进行抑菌活性检测，以烟草青枯病菌为指示菌，以有机溶剂作对照，试验重复3次。

2.2.9 粗分离

将发酵液滤液用乙酸乙酯萃取3次，合并后萃取液于43℃下减压蒸馏得到褐黄色油状物，用甲醇溶出，4℃冰箱储存待用。

2.2.10 硅胶柱色谱

2.2.10.1 硅胶薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）对硅胶柱色谱起始洗脱条件的选择实验 2.2.10.1.1 薄板的制备

称取

5gCMC—Na溶于1000mL蒸馏水中，加热搅拌使之溶解，制成

0.5%CMC—Na水溶液，再称取100g薄析硅胶G放入研钵中不断加入冷却后的上述CMC—Na溶液300mL，反复研磨成均匀的浆状物，取约10mL涂到20cm×10cm的玻璃板上，振荡铺平，自然风干。硅胶薄层厚度约为0.5mm。使用前将硅胶薄板置于烘箱中105℃下活化30min。 2.2.10.1.2 样品制备

将通过粗分离得到的褐黄色油状物与甲醇充分溶解，用于硅胶薄层色谱上样。

2.2.10.1.3 展开系统的选择

本实验对以下几种溶剂系统进行了测试(V/V)： ⑴ 石油醚∶异丙醇（18∶1） ⑵ 石油醚∶异丙醇（16∶1） ⑶ 石油醚∶异丙醇（14∶1） ⑷ 石油醚∶异丙醇（12∶1） ⑸ 石油醚∶异丙醇（10∶1） ⑹ 石油醚∶异丙醇（8∶1） ⑺ 石油醚∶异丙醇（6∶1）

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⑻ 石油醚∶异丙醇（4∶1） 2.2.10.1.4点样

采用带状点样，点样处距离薄板下沿2.0cm，多次点样，吹风机干燥样品配合点样，使样品固定在点样处。 2.2.10.1.5展开与检测

将配好的展层剂加入展层缸中，密闭60min让缸中气液两相达到饱和状态。然后将点样后的硅胶薄板放入展层缸中，上行展开，保持缸的气密性。当展层剂前沿距离薄板前沿约1cm时，展层结束。取出硅胶薄板，晾干。

在254nm紫外灯下进行检测，观察带的位置和彼此之间的距离，标记并计算出比移值Rf。同时采用生物鉴定法，将硅胶薄板上各条带轻轻刮下，用甲醇浸提，离心、有机滤膜（0.22μm）抽滤除去硅胶，取上清液进行抑菌活性检测，并以甲醇为对照。

Rf = 条带中心至点样带中心的距离

溶剂前沿至点样带中心的距离 ⑶

2.2.10.2 硅胶柱色谱分离 2.2.10.2.1 样品制备

用甲醇溶解待用样品。

2.2.10.2.2 柱层析用硅胶的预处理

将柱层析用硅胶，用石油醚∶异丙醇=9∶1（V/V）的混合液洗涤，除去杂质后将硅胶自然晾干，而后将硅胶放入鼓风干燥箱110℃下活化60min，冷却后上样备用。 2.2.10.2.3 装柱与上样

湿法装柱：称取200～300目柱层层析硅胶200g（处理过的），以石油醚∶异丙醇=9∶1（V/V）的混合液与之充分混匀，除去气泡，混合物成悬液状；将搅拌均匀的硅胶缓缓加入到规格为400mm×16mm的层析柱内，静置过夜，待柱子沉降完全后，再用石油醚∶异丙醇=9∶1（V/V）的混合液冲柱1h，将柱子压实备用。

干法上样：将样品的甲醇溶解液拌入柱层层析硅胶[试剂级(粒度：200～300目）]，挥发干溶剂后上样，上样时小心加入到准备好的硅胶柱体上部，使上样硅胶层表面平整。

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2.2.10.2.4 洗脱和产物处理

依次用石油醚∶异丙醇9∶1、7∶3、5∶5、2∶8，4个梯度进行洗脱，流速为1mL/min，每5mL收集1管，采用琼脂扩散法以烟草青枯病菌为指示菌对各部分分别进行抑菌活性测定，合并活性部分后减压浓缩。

2.2.11 硅胶薄层色谱制备抑菌活性物质

2.2.11.1 硅胶薄层色谱展层条件筛选

按照

2.2.10.1.1中的方法制作硅胶薄板，以2.2.10.2.4中分离得到的

抑菌活性物质为上样样品，点状点样，展开剂依次选择石油醚∶异丙醇∶甲醇（V/V/V）为15∶1∶0.1、13∶1∶0.1、10∶1∶0.1、10∶1∶0.3、10∶1∶0.5、10∶2∶0.5进行测试以选出薄层层析的最佳展开剂。展开前将硅胶板两侧刮掉1cm以防止边缘效应，点样量为20μL，在密闭的层析缸中上行展层，254nm紫外灯下观察分离效果。 2.2.11.2 薄层色谱法制备抑菌活性物质

采用2.2.11.1中的方法，只是将点样量调整为100μL，以2.2.11.1中选出的最佳展开剂上行展层，观察斑点分离情况，并配合抑菌活性测定（周德庆，1986），以烟草青枯病菌为指示菌，将有抑菌活性的斑点刮下，合并多次薄层层析所得的活性斑点处的硅胶粉后，用甲醇浸提。于12000r/min离心10min，有机滤膜（0.22μm）抽滤，收集上清液后旋转蒸发并干燥，获得抑菌活性物质。

2.2.12高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)检测活性物质的纯度

2.2.12.1样品处理

用色谱甲醇溶解由2.2.11.2制备的待测样品，经配备有机微孔滤膜（0.22μm）的细菌过滤器过滤，备用。

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2.2.12.2活性物质的全波长紫外检测

将待上样样品用全波长紫外可见分光光度计在紫外光区(200nm至400nm)进行全波长紫外扫描，测定其最大吸收波长，根据全波长紫外扫描确定高效液相色谱的紫外检测波长。 2.2.12.3 高效液相色谱洗脱条件筛选

色谱柱：EclipseXDB_C18，5μm，4.6mm×150mm。流动相选择常用的甲醇（色谱级）—水（超纯水）系统，两溶剂先用微孔滤膜（0.22μm）抽滤，超声波脱气，流动相比例分别为20：80、40：60、50：50、60：40；柱温为30℃；流速1mL/min；以2.2.10.2.4中分离得到的抑菌活性物质为样品上样，进样量20μL；以2.2.12.2中得到的最大紫外吸收波长检测。

观察不同流动相色谱峰的数量、色谱峰峰形和基线平稳状况，根据基线平稳、色谱峰数、峰形状况等原则（李发美，1999），选择一个最佳流动相比例，作为高效液相色谱法检测抑菌活性物质纯度时的流动相。

2.2.12.4 高效液相色谱法检测纯度

以

2.2.12.3中选出的最佳流动相为洗脱流动相，将由2.2.11.2制备的

抑菌活性物质用甲醇（色谱级）溶解，经过0.22μm有机膜过滤后再经超声波脱气10min，在2.2.12.3的色谱条件下，以色谱级甲醇为对照，根据出峰的情况检测样品的纯度。

2.2.13捷克八溶剂系统纸色谱

捷克八溶剂系统（周德庆，1986）：①水饱和的正丁醇；②水饱和的正丁醇，内含2%对甲苯磺酸；③正丁醇∶乙酸∶水=2∶1∶1；④水饱和的正丁醇，内含2%六氢吡啶；⑤以正丁醇饱和的0.5mol/L、pH7的磷酸缓冲液；⑥正丁醇饱和的水，内含2%对甲苯磺酸；⑦苯∶甲醇=4∶1，所用滤纸先用0.5 mol/L pH7的磷酸缓冲液处理，晾干后使用；⑧甲醇∶水=3∶1，水中含3%氯化钠，所用滤纸先用5%硫酸钠处理，晾干后使用。

以分离纯化的菌株Y23拮抗产物为上样样品，层析完成后以烟草青枯病菌为指示菌，用生物学测定法确定活性物质分布位置。

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2.2.14 pH纸色谱

pH纸色谱（周德庆，1986）：用pH2～8的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液及pH9～10的甘氨酸－氢氧化钠缓冲液分别处理滤纸条，晾干后点样，分别在水饱和的正丁醇中展层。

以分离纯化的菌株Y23拮抗产物为上样样品，层析完成后以烟草青枯病菌为指示菌，用生物学测定法确定活性组分分布位置。

2.2.15官能团反应试验

对Y23菌株拮抗产物纯品的官能团反应试验：硫酸-蒽酮反应（李如亮，1998）、茚三酮反应（沈同等，1990）、双缩脲反应（李如亮，1998）。

3 结果与分析

3.1 抑菌活性测定

表1、表2分别为Y23菌株发酵液抑制真菌和抑制细菌的生测结果。从表1可以看出，Y23菌株发酵液在测定的15种不同供试真菌中，对禾谷镰刀菌、苹果轮纹病菌、大麦条纹病菌的抑制效果最好，菌丝生长抑制率均在55%以上；对玉米大斑病菌、甘薯黑斑病菌、玉米弯孢霉叶斑病菌的抑制效果最差，菌丝生长抑制率均在10%以下；对于所选择的其他供试真菌Y23菌株发酵液表现为一定的抑制菌丝生长的作用，其菌丝生长抑制率一般在15.0% ~ 35.0%之间，以上数据说明Y23菌株抑菌活性范围较广且对部分植物病原真菌有较好的抑制效果。从表2可以看

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出，Y23菌株发酵液在测定的3种供试细菌中，只对烟草青枯病原菌有抑菌效果，且抑菌圈直径为13mm，一般认为，抑菌圈在6~10 mm之间，为有抗药性；10 mm为轻度敏感；11~15 mm为中度敏感；16~20 mm为高度敏感（Ayakawam，1988），表2结果参照此理论可得出:Y23菌株在烟草青枯病的生物防治方面具有开发潜力。

表1 Y23菌株发酵液抑制真菌的生测结果

Table 1 Tests of fermentation products of Y23 against fungus 供试病原菌

烟草黒胫病菌 Phytophthora parasitica var. nicotianae

烟草炭疽病菌Collettrichum nicotianae 玉米大斑病菌 Exserohilum turcicum 苹果炭疽病菌 Glomerella cingulata

菌落直径（mm） Y23菌株 15.3 12.3 33.7 20.3

对照 19.7 15.3 36.0 22.7

菌丝生长抑制率（%）

29.9 29.1 7.4 13.6

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小麦赤霉病菌 Gibberella zeae 甘薯黑斑病菌Ceratocystis fimbriata 烟草赤星病菌 Alternaria alternata 禾谷镰刀菌 Fusarium graminearum 苹果轮纹病菌 Physalospora piricola 玉米弯孢霉叶斑病菌 Curvularia iunata 黄瓜炭疽病菌 Gloeosporium orbiculare 辣椒炭疽病菌 Colletotrichum capsici 小麦根腐病菌 Bipolaris sorokinana 玉米小斑病菌 Bipolaris maydis 大麦条纹病菌 Drechslera graminea

16.3 15.3 13.7 11.3 15.7 20 21.7 21.7 13.3 33.3 11.3

18.0 16.3 17.0 22.7 31.0 21.3 25 27 17.7 38.7 22.0

13.1 8.9 27.5 64.4 58.8 8.0 16.5 24.1 34.6 16.0 62.9

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/qgj3.html