系统性红斑狼疮

中图分类号：

UDC：

学校代码： 10055 密级：

公开

硕 士 学 位 论 文

白介素-6在小鼠系统性红斑狼疮模型中的作用 The Role of Interleukin-6 in a Mouse Model of Systemic Lupus

Erythematosus

论文作者 伍云云 指导教师 尹芝南 教授 申请学位 理学硕士 培养单位 生命科学学院 学科专业 微生物 研究方向 基础免疫 答辩委员会主席 评 阅 人

南开大学研究生院 二○一四年五月

南开大学学位论文使用授权书

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作者暨授权人签字：

20 年 月 日

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注：限制★2年(可少于2年);秘密★10年(可少于10年);机密★20年(可少于20年)

Abstract

摘 要

目的：

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种自身免疫病，主要以自身抗体的形成，导致免疫复合物沉积，最终导致终末器官的损害为特征。系统性红斑狼疮可以累积全身各个器官，包括神经系统、消化系统、呼吸系统、血液系统、皮肤黏膜、骨骼肌肉、肝脏、肾脏等，其中以肾脏为主。SLE的致病原因非常复杂，包括基因和环境因素。由于SLE发病机制复杂，目前尚无有效方法根治SLE。在SLE中免疫系统紊乱，涉及天然免疫和适应性免疫。白介素-6（Interleukin-6，IL-6）是一种促炎性细胞因子，在炎症反应中发挥重要作用。已有研究报道在多种自身免疫疾病中，血清中的IL-6水平升高。本研究构建小鼠SLE模型，研究IL-6在SLE发病机制中的作用。 方法：

（1） 用ConA刺激C57小鼠脾脏淋巴细胞，提取淋巴细胞活化的DNA

（activated lymphocyte derived DNA ,ALD-DNA）。用ALA-DNA免疫C57小鼠，检测SLE发病相关标志：血清中dsDNA抗体的含量、尿蛋白的含量、肾脏病理切片。

（2） 按照上述方法免疫IL-6敲除小鼠，检测SLE发病相关标志。

（3） 在体内，ELISA检测免疫小鼠血清中抗dsDNA抗体、IL-6、IL-17和 TNF-a

的含量。在体外，用ALD-DNA刺激C57小鼠脾脏细胞，ELISA检测上清中dsDNA抗体、IL-6、IL-17和 TNF-a的含量。

（4） 取免疫小鼠脾脏和淋巴结细胞，流式细胞分析Foxp3+细胞含量和CD4+T

细胞活化状况。取免疫小鼠的脾脏细胞，做Treg和Th1的分化培养，流式细胞分析Foxp3+细胞含量。

（5） 取小鼠骨髓细胞做骨髓来源的树突状细胞（bone-marrow-derived dendritic

cells, BMDC）的分化培养，用ALD-DNA刺激BMDC细胞，检测上清中IL-6、TNF-a的含量。取C57小鼠脾脏细胞，用上清做Treg的分化培养，流式细胞分析Treg的含量。用IL-6、TNF-a抗体分别阻断，流式细胞分析Treg含量。

I

Abstract

结果：

（1） ALD-DNA免疫C57小鼠可以构建SLE模型，表现为血清中dsDNA抗体

的含量升高、尿蛋白的含量升高、肾脏病理切片损伤。 （2） ALD-DNA免疫的IL-6敲除小鼠不发病。

（3） 在体内，ALD-DNA免疫的C57小鼠可以产生大量的dsDNA抗体、IL-6；

在体外，ALD-DNA也可以刺激小鼠脾脏细胞产生大量dsDNA抗体、IL-6、IL-17和 TNF-a。

（4） ALD-DNA免疫的C57小鼠相对于IL-6敲除小鼠和对照小鼠，Treg细胞

含量较低，而CD4+T细胞活化程度增高。

（5） ALD-DNA可以刺激BMDC产生大量IL-6、TNF-a，上清共培养可以抑制

Treg的分化。阻断IL-6后Treg的含量升高，而阻断TNF-a后Treg含量无明显变化。 结论：

在ALD-DNA免疫小鼠构建的SLE模型中，BMDC可产生IL-6，且IL-6可以抑制Treg的分化，从而促进疾病的发展。IL-6的研究不仅加深了我们对SLE致病机制的理解，并且提供了SLE的检测和治疗位点。

关键词：SLE、 IL-6、Treg、BMDC

II

Abstract

Abstract

Purpose:

Systemic lupus erythematosus (SLE) is a complex antoimmune disease characterized by the production of anti-double-stranded DNA (anti-dsDNA) antibodies, which can form immune complexes and deposit in tissues, causing inflammation and organ damage. SLE can affect multiple organs, including nervous system, digestive system, respiratory system, blood system, mucocutaneous, musculoskeletal, livers, kidneys, etc., mainly kidneys. The cause of the disease includes both genetic and environment factors. Because the pathogenesis of SLE is complex, there is no effective way to cure SLE.The immune system dysregulation in SLE involves both adaptive and innate immunity. Interleukin-6 (Interleukin-6, IL-6) is a proinflammatory cytokine, which plays an important role in the inflammatory response. Previous studies in a variety of autoimmune diseases have reported elevated serum IL-6 levels. Here, we Constructed a mouse model of SLE, to study the role of IL-6 in the SLE pathogenesis. Methods:

(1) Spleen lymphocytes from C57 Wt mice were stimulated by ConA, activated lymphocyte derived DNA (ALD-DNA) was extracted. Immunized C57 Wt mice with ALD-DNA and detected SLE associate indicators, including the anti-dsDNA antibodies, proteinuria, renal biopsy.

(2) Immunized IL-6KO mice as described above and detected SLE associate indicators.

(3) In vivo, measured the anti-double-stranded DNA antibodies, IL-6, IL-17 and TNF-a in immunized mice with ELISA . In vitro, stimulated Spleen lymphocytes from C57 Wt mice with ALD-DNA and measured the anti-dsDNA antibodies, IL-6, IL-17 and TNF-a in supernatants

(4) The Spleen and lymph nodes lymphocytes from immunized mice were isolated,

III

Abstract

the percentages of regulatory T cells (Treg) and activation of CD4+T cells were analyzed by flow cytometry. Spleen lymphocytes from immunited mice were cultured under Treg and Th1 differentiation condition, and the percentages of Treg and Th1 were analyzed by flow cytometry.

(5) Bone marrow cells from normal C57 mice were cultured under bone marrow-derived dendritic cells (BMDC) differentiation condition, stimulated BMDC with ALD-DNA, measured the IL-6 and TNF-a in supernatants. Spleen lymphocytes from normal C57 mice were cultured under Treg differentiation condition with the supernatants, the percentages of Treg were analyzed by flow cytometry. Blocking IL-6 or TNF-a with Anti-IL-6 or anti- TNF-a antibodies, the percentages of Treg were analyzed by flow cytometry. ?? Results:

(1) ALD-DNA can induce SLE in C57 Wt mice, with the production of anti-dsDNA antibodies, proteinuria, renal pathological damage.

(2) IL-6KO mice were resistant to the development of SLE, which suggested that IL-6 is crucial for SLE.

(3) ALD-DNA immunized C57 Wt mice produced high level of anti-dsDNA Abs, IL-6 in serum and in vitro ALD-DNA can induce the production of anti-dsDNA Abs, IL-6 , IL-17and TNF-a.

(4) ALD-DNA immunized C57 Wt mice had higher activation of CD4+ T cells and lower expression of Foxp3+ than IL-6KO immunized mice and control mice. (5) ALD-DNA stimulated DC could produced high levels of IL-6 and TNF-a. ALD-DNA stimulated DC could suppress FoxP3 expression via IL-6. Conclusion:

IL-6 secreated by BMDC can promote the progression of SLE by suppressing Treg. The knowledge on IL-6 not only fosters our understanding of the disease, but also provides insights in devising biomarkers and targeted therapies.

Key Words: SLE、 IL-6、Treg、BMDC

IV

目录

目录

摘 要 ........................................................................................................ I Abstract .................................................................................................. III 目录 ........................................................................................................ V 第一章

前言 ....................................................................................... 1

第一节 系统性红斑狼疮 ....................................................................................1

1.1.1 系统性红斑狼疮的病理表现 ............................................................................. 1 1.1.2 系统性红斑狼疮的致病原因 ............................................................................. 4 1.1.3 系统性红斑狼疮的治疗 ..................................................................................... 6

第二节 系统性红斑狼疮的研究现状 ................................................................8

1.2.1 IL-6与系统性红斑狼疮 ...................................................................................... 9 1.2.2 Treg与系统性红斑狼疮 ................................................................................... 11 1.2.3 DC与系统性红斑狼疮 ...................................................................................... 12 1.2.4 CD4 +T细胞与系统性红斑狼疮（图1.9） ..................................................... 17

第三节 本实验研究 ..........................................................................................18

1.3.1 研究目的和意义 ............................................................................................... 18 1.3.2 研究方法和内容 ............................................................................................... 19

第二章 实验材料和方法 .................................................................. 20

第一节 实验材料 ..............................................................................................20

2.1.1 实验小鼠 ........................................................................................................... 20 2.1.2 实验试剂 ........................................................................................................... 20 2.1.3 实验仪器 ........................................................................................................... 21

V

目录

第二节 实验方法 ..............................................................................................22

2.2.1 DNA的制备 ....................................................................................................... 22 2.2.2 小鼠系统性红斑狼疮模型的构建.................................................................... 23 2.2.3 dsDNA抗体的检测 ........................................................................................... 24 2.2.4 尿蛋白的检测 ................................................................................................... 25 2.2.5 肾脏病理切片的制作 ....................................................................................... 26 2.2.6 ELISA检测.......................................................................................................... 27 2.2.7 小鼠脾细胞体外刺激 ....................................................................................... 28 2.2.8 小鼠CD4+T细胞活化状态的染色 ................................................................... 29 2.2.9 小鼠Treg细胞染色 .......................................................................................... 30 2.2.10 小鼠脾细胞Treg的分化培养和染色 ............................................................ 30 2.2.11 小鼠Th1细胞的分化培养和染色 ................................................................. 31 2.2.12 小鼠BMDC细胞分化培养、刺激和共培养 ................................................. 32

第三章 实验结果 ............................................................................... 35

第一节 构建系统性红斑狼疮模型 ..................................................................35

3.1.1 dsDNA的检测 ................................................................................................... 35 3.1.2 尿蛋白的检测 ................................................................................................... 35 3.1.3 肾脏病理切片的检测 ....................................................................................... 36

第二节 IL-6敲除的小鼠不发病 ......................................................................37

3.2.1 dsDNA的检测 ................................................................................................... 37 3.2.2 尿蛋白的检测 ................................................................................................... 37 3.2.3 肾脏病理切片检测 ........................................................................................... 38

第三节 ALD-DNA对于dsDNA抗体和细胞因子产生的影响 .....................39

3.3.1 体内：ALD-DNA免疫小鼠血清中dsDNA和细胞因子的检测 ....................... 39 3.3.2 体外：ALD-DNA刺激小鼠脾细胞上清中dsDNA和细胞因子的检测 ........... 40

第四节 ALD-DNA免疫小鼠中CD4+T细胞活化状态 .................................41

3.4.1 脾脏中CD4+T活化状态的检测 ....................................................................... 41 3.4.2 淋巴结中CD4+T活化的检测 ........................................................................... 42

VI

目录

第五节 ALD-DNA免疫小鼠Foxp3+表达状态 ..............................................43

3.5.1 脾脏Foxp3+表达状态的检测 ........................................................................... 43 3.5.2 淋巴结中Foxp3+表达状态的检测 ................................................................... 44 3.5.3 Treg分化状态检测 ........................................................................................... 45 3.5.4 Th1分化状态的检测 ........................................................................................ 46

第六节 BMDC ..................................................................................................47

3.6.1 ALD-DNA对BMDC分泌IL-6、TNF-a的影响 ................................................ 47 3.6.2 ALD-DNA 刺激的BMDC对Treg分化的影响 ............................................... 48

第四章 讨论 ....................................................................................... 50

第一节 主要研究结果和创新之处 ..................................................................50 第二节 不足之处和未来展望 ..........................................................................51

4.3.1 TNF-a .................................................................................................................. 51 4.3.2 IL-17 ................................................................................................................... 52 4.3.3 Treg与Th17 ...................................................................................................... 53 4.3.4 unALD ................................................................................................................. 55

参考文献 ............................................................................................... 56 致谢 ....................................................................................................... 63 个人简历 在学期间发表的学术论文与研究成果 ............................... 64

VII

第一章 前言

第一章 前言

第一节 系统性红斑狼疮

1.1.1 系统性红斑狼疮的病理表现

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种多系统的自身免疫病，主要以自身抗体的形成，导致免疫复合物沉积，最终导致终末器官的损害为特征。系统性红斑狼疮可以累积全身各个器官，包括神经系统、消化系统、呼吸系统、血液系统、皮肤黏膜、骨骼肌肉、肝脏、肾脏等，其中以肾脏为主。

由于SLE的症状复杂，现在尚且不能精确统计发病率。估计世界范围内发病率是52:100000，其中以加勒比黑人Afro-Caribbean的发病率最高159:100000。在美国非洲血统的发病率是欧洲血统的2.6倍，这预示疾病的发病机制和种族有关。据统计女性的发病率比男性高9倍，这预示疾病的发病机制和性染色体有关。且SLE的发病率和年龄有关，多发于育龄女性，儿童和老人较少发病[1]。 SLE的临床症状非常复杂，不同的SLE患者临床症状也会有差别。（图 1.1） （1）全身症状：早期表现发热尤以低烧常见，易疲劳，体重减轻等。 （2）皮肤和粘膜：约40％患者有面部典型红斑叫做蝶形红斑，15~20％患者有雷诺现象，12%的患者会出现口腔溃疡。此外还有脱发、荨麻疹样皮疹、盘状红斑等。

（3）骨骼肌肉：关节炎、关节痛、关节畸形、肌肉酸痛、肌无力等症状常见。 （4）肾脏：约50%的SLE患者会患有肾脏疾病，肾脏疾病是最危险的危及生命的并发症。肾脏受累的特点是蛋白尿（> 0.5 g/24小时）。相对于正常人群，SLE肾炎患者的寿命缩短了10年左右。

（5）心脏：约10~50％患者出现心脏病变，包括心包炎、心肌炎、心内膜及瓣膜病变等。临床表现有胸闷、胸痛、心悸、心电图异常、充血性心力衰竭等。 （6）肝脏：SLE引起的肝损害主要表现为肝肿大、黄疸、肝功能异常。其中，肝肿大约占10%－32%，多在肋下2-3cm，少数可明显肿大。红斑狼疮引起黄疸

1

第一章 前言

的原因很多，主要有溶血性贫血、合并病毒性肝炎，胆道梗阻及急性胰腺炎等。约30%－60%的红斑狼疮患者可有肝功能试验异常，主要表现为转氨酶水平升高、血清白蛋白水平降低、球蛋白水平及血脂水平升高等。

（7）消化系统：如恶心、呕吐、消化道出血，少数患者会有肠系膜血管炎、蛋白丢失性肠病或假性肠梗阻等。

（8）神经系统：神经精神性狼疮（neuropsychiatric systemic lupus erythematosus, NPSLE）大约占20％的比例，多提示病情危重。大脑损害可出现精神障碍，如兴奋、行为异常、抑郁、幻觉、强迫观念、精神错乱等癫痫样发作。NPSLE通常是难以做出诊断，没有单一简单的诊断测试。在许多情况下，脑活检将是唯一的明确的测试，但是很少进行。

（9）呼吸系统：胸膜炎是最常见的，约30%~50%SLE患者会并发此症。狼疮性胸膜炎的诊断，需要排除胸腔积液的其它原因，如感染，肺栓塞，肝脏疾病，心脏疾病，癌症。

（10）血液系统：几乎所有的患者都会有一定的血液系统异常，如贫血、白细胞减少、血小板减少等。血细胞减少是狼疮患者常见症状，还有和脏器损伤及疾病活动密切相关的淋巴细胞减少。

针对SLE患者，现在已经有一些有效的实验室检查。

（1）自身抗体的检测：SLE患者以产生大量自身抗体为特征，如抗核抗体（anti-nuclear antibodies, ANAs）、抗细胞浆抗体、抗细胞膜抗体、抗球蛋白抗体等。其中ANAs是常用的实验室检查，其敏感性高达95%，而特异性较低为65%。ANAs又包括抗DNA抗体（抗单链DNA抗体、抗双链DNA抗体）、抗组蛋白抗体、抗非组蛋白抗体（抗Sm抗体、抗RNP抗体、抗SSA抗体、抗SSB抗体等）、抗核仁抗体、抗其它成分抗体（抗中性粒细胞浆抗体、抗核小体抗体）。抗dsDNA抗体石SLE的标志抗体，是唯一和SLE的活动性有关的抗体。其特异性为95%，敏感性为70%。抗Sm抗体也是SLE的标志抗体，但是和SLE的活动性无关。其特异性高达99%，但是敏感性只有25%。抗核小体抗体、抗SSA抗体、抗SSB抗体的特异性不高。抗核小体抗体的特异性高。抗组蛋白抗体多见于药物性狼疮。还可以检测其它一些自身抗体，如抗磷脂抗体、抗血小板抗体、抗神经元抗体等。

（2）肾活检：肾脏是SLE组要累积器官，肾功能衰竭为主要死亡原因。活动性病变：肾小球坏死、细胞新月体、透明血栓、肾间质炎症浸润、坏死性血

2

第一章 前言

管炎。性病变：小球硬化、纤维新月体、间质纤维化、小管萎缩等。

（3）与SLE相关的检测：血尿异常：血液系统与肾受损。ESR增快：预示疾病活动。低补体血症： C3、C4在疾病活动时下降。

（4）X线及影像学检查：有助于早期发现器官损害。包括超声心电图、头颅CT等。

结合SLE的临床表现以及实验室检查，1982年美国风湿病学会修订的SLE诊断标准11条，符合4条可诊断，其特异性为98％，敏感性为97％[2]。（图1.2）

图 1.1 一个系统性红斑狼疮患者

3

第一章 前言

图 1.2 系统性红斑狼疮诊断标准

1.1.2 系统性红斑狼疮的致病原因

系统性红斑狼疮的发病与基因和环境有关[3]。

基因：SLE遗传学报道了至少20种与SLE相关的基因和它们的染色体位点（表1.1）。

（1）1号染色体：1q23编码的Fcγ受体FCGR2A和FCGR3A，对IgG及其亚基具有不同的亲和力。这个基因的变异会导致循环中免疫复合物的清除缺陷，从而导致免疫复合物在肾脏和血管中的沉积[4]。蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型22（prorein tyrosine phosphatase nonreceptor 22, PTPN22），位于1p13，被认为是除

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第一章 前言

了主要组织相容性复合体（major histo-compatibility complex, MHC）之外，与人类自身免疫病最相关的危险基因。PTPN22编码一个淋巴特异性磷酸酶（lymphoid speci?c phosphatase, LYP），其通过Csk激酶抑制T细胞受体（TCR）[5]。其它1号染色体上和SLE相关的基因还有蛋白酪氨酸磷酸酶、IL-10、C1q。

（2）2号染色体：程序性细胞死亡基因（PDCD1），位于2q37，它在T细胞激活中被上调，抑制TCR信号和T/B细胞的存活[6]。细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4, CTLA4），位于2q33，是一种负向的共刺激分子，可以抑制T细胞的活化，并且有助于抑制炎症条件下T细胞反应。基因2q32 编码的信号转导子和转录激活子4（signal transducer and activator of transcription 4, STAT4），介导淋巴细胞中的IL-12反应，并且调节辅助性T细胞的分化[7]。

（3）6号染色体编码MHC、补体系统的C2和C4、肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor, TNF），所有这些基因都和SLE相关[8]。

（4）7号染色体：干扰素调节因子5（interferon regulatory factor 5, IRF5 ），位于7q32 ，是干扰素α（interferon-α, IFN-α）途径中一个重要基因。2个单核苷酸多态性位点的改变可以导致选择性剪接和IRF5基因表达的稳态水平。此外这个基因在外显子6上还有一个插入和缺失位点，有助于形成IRF5不同的异构体。IRF5是一个转录因子，调节促炎性细胞因子，特别是其中的I型干扰素[9]。 （5）最近发现两个和SLE相关的新的基因位点：染色8上的一个启动子等位基因与降低B淋巴酪氨酸激酶（B lymphoid tyrosine kinase, BLK）表达和增加C8orf13的表达有关。染色体16上一个变异与整合素αM（integrin alpha M , ITGAM/CD11b）和整合素αX（integrin alpha X, ITGAX）有关[10]。

表 1.1 与SLE有关的基因及它们的潜在功能

抗原提呈：HLA DR/DQ

清除（凋亡物质，免疫复合物）：C1q; CRP; MBL; FCγR2A/3A/3B 免疫细胞功能：BLK, CTLA4; Stat 4; PDCD1, PTPN22, FCγR2B, TCRδ 天然免疫：IRF3, IRF5; TYK2

细胞因子：Cytokines: IL6; IL10; TNF-α 能量产生：ITPR3

白细胞和内皮粘附：ITGAM

5

第一章 前言

环境：加勒比黑人和亚洲的SLE发病率是欧洲的八倍，而奴隶的起源地西非发病率却非常低，这说明系统性红斑狼疮的发病和环境有关。一方面一些环境因素可以调节机体的免疫应答，使机体不易发系统性红斑狼疮，例如疟疾和寄生虫感染[11]。另一方面一些环境因素可以引发系统性红斑狼疮，例如病毒性感染。B19微小病毒和巨细胞病毒在SLE患者中常见，预示这些病毒感染是SLE的可能触发因素[12,13]。一些病毒蛋白与自身抗原类似，因此特异性免疫应答可与自身抗原反应，例如EB病毒蛋白EBNA- 1与自身抗原RO可发生交叉反应，是SLE中抗体的共同目标[14]。紫外线、吸烟、各种环境毒素也可能是致病原因[15]。最近的研究表明开始关组SLE中激素的影响，性别的影响机制至今存在争议，有研究表明在SLE中催乳素有助于疾病的发展[16]。

1.1.3 系统性红斑狼疮的治疗

SLE是一种复发与缓解交替的自身免疫病，目前尚且不能完全根治，只能通过治疗缓解病情。主要原则是在急性期通过治疗控制，在稳定期通过治疗维持，努力减少生命危险。

SLE的一般治疗包括避免日晒和紫外线照射，预防和治疗感染，根据病情调整心情增强锻炼。

药物治疗主要包括非甾体类抗消炎药、抗疟药、糖皮质激素、免疫抑制剂、生物抑制剂等。（1）糖皮质激素是一类甾体激素，是目前治疗SLE最重要最常用的药物。糖皮质激素按照半衰期的长短可分为短效、中效和长效。短效的有可的松、氢化可的松，中效的有泼尼龙、泼尼松龙、甲泼尼龙、曲安西龙，长效的有地塞米松、倍他米松。根据SLE疾病程度的不同使用不同剂量的糖皮质激素，轻度无重要脏器受损一般不使用糖皮质激素或使用小剂量糖皮质激素，中度有一个重要脏器受损一般使用中剂量糖皮质激素先诱导缓解再维持治疗，重度有多个脏器受损一般使用大剂量甚至冲击糖皮质激素。但是糖皮质激素具有很大的副作用，如严重的毒性破坏代谢平衡，损害心血管系统， 眼睛，骨骼等。（2）免疫抑制剂的作用是辅助糖皮质激素的使用，帮助糖皮质激素减量。目前常用的有环磷酰胺 (CTX)、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、环孢素、麦考酚酸酯 、长春新碱等。（3）生物抑制剂是随着生物学的发展开发的新的治疗药物，主要以SLE免疫反应中的一些细胞因子、T细胞、B细胞等为靶位点[17,18]（图1.3）

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第一章 前言

现在已经开发出多种有效的生物抑制剂（图1.4）。例如利妥昔单抗 (Rituximab)是人/鼠嵌合的抗 B淋巴细胞CD20的单克隆抗体，可以有效的清除异常增生的B淋巴细胞。贝利单抗（belimumab）是全人源化的抗B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator，BlyS)的单克隆抗体，与B细胞表面的刺激因子结合后阻止B细胞发育成熟，从而使产生自身抗体的B淋巴细胞凋亡。阿贝莫司（LIP-394）为人工合成的B细胞耐受原，由三乙烯乙二醇骨架连接4个核苷酸组成，与B淋巴细胞表面的抗dsDNA抗体交联，使特异性 B淋巴细胞对免疫无应答，使抗dsDNA抗体水平明显下降。

其他治疗如造血干细胞移植、血液净化、大剂量免疫球蛋白冲击等。造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）首先采用大剂量的化疗或放疗达到免疫清除，免疫清除可以清除机体内的病理性淋巴细胞，有利于机体的康复。其次新的造血干细胞可以刺激胸腺重建免疫系统，新建的免疫系统对自身物质产生免疫耐受，在重建过程中免疫细胞、免疫分子发生改变达到新的免疫平衡[19]。

图1.3 系统性红斑狼疮的生物治疗靶位点

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[20]

第一章 前言

图1.4 目前使用的治疗系统性红斑狼疮药物

第二节 系统性红斑狼疮的研究现状

SLE是一种复杂的疾病，疾病机制尚未阐明。它和天然免疫及适应性免疫都相关。涉及多种免疫细胞，如B细胞、T细胞、DC细胞、中性粒细胞、上皮细胞等，其中B细胞产生自身抗体的作用尤为重要。同时细胞因子的紊乱也是

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第一章 前言

SLE的重要原因，例如IL-6、 IL-10、IL-17、IL-2、IL-21、BLys、Type 1 Interferon(IFN)、TNF-a、IFN- γ等。（图1.5）

图1.5 系统性红斑狼疮病理机制

[21]

1.2.1 IL-6与系统性红斑狼疮

白介素6（IL-6）由单核细胞、成纤维细胞、内皮细胞分泌，T、B淋巴细胞也有助于它的产生。IL-6和其它细胞因子之间存在紧密的联系，IL-1、IL-2和TNF-a有助于它的产生，而IL-4、IL-10 和 IL-13不利于它的产生。

IL-6对多种细胞具有广泛的生物学功能。其中一个重要功能就是促进B细胞分化成为成熟的浆细胞并产生免疫球蛋白。IL-6同时可以促进T细胞和巨噬细胞的增值和分化。IL-6可以作用于骨髓干细胞的成熟，激活中性粒细胞，刺激巨核细胞分化产生血小板和破骨细胞的分化。IL-6是主要的肝细胞刺激因子，并且介导了急相反应蛋白的产生。

IL-6信号通过它的异聚体受体复合物介导，它由两个糖蛋白组成，IL-6的特异性结合链（IL-6R）和信号传导链（gp130）。IL-6的信号传导有两种途径。经典途径IL-6与IL-6R的结合触发gp130形成二聚体，导致JAK1激活和gp130的酪氨酸磷酸化，激活ERK/ MAPK 信号转导通路和p-STAT3-介导的途径。经

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第一章 前言

典途径需要膜结合的IL-6R，它只在肝细胞、一些上皮细胞和白细胞上表达。另一种叫反式信号通路，当IL-6与可溶性的IL-6R受体结合，gp130也可以被激活。

图1.6 IL-6信号传导

IL-6在小鼠中的作用：在MRL / lpr小鼠中，血清中IL-6、可溶性IL-6R表达增加和IL6R的异常表达和年龄有关。值得被强调的是，除了IL-6没有别的细胞因子可以直接介导抗DNA抗体的产生[22]。在NZB/W小鼠中，注射人源重组IL-6可以加速肾小球肾炎[23]。在IL-6缺陷MRL/lpr小鼠中，肾脏中浸润巨噬细胞大量减少，肾脏IgG和C3沉积减少，CD4+T细胞、CD8+T细胞萎缩；在MRL-Fas(lpr) IL-6 -/-小鼠中，肾脏中血管细胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1）的表达也减少[24]。在NZB/W小鼠中，阻断IL-6可以减少尿蛋白的产生，降低抗dsDNA抗体的水平，提高小鼠的存活率[25]。在B6.Sle1.Yaa小鼠中，IL-6水平增高，伴随着CD19+B细胞的减少和前B淋巴细胞的增多。IL-6同时可以增加B淋巴细胞的存活率，IL-6通过重组活化基因（Rag）影响B细胞的存活率，Rag是影响免疫球蛋白V (D) J重组的重要基因，IL-6有利于Rag的表达，因而可以从凋亡中拯救自身反应性B细胞[26]。

IL-6在人类SLE患者中的作用：在人类SLE患者中，血清中IL-6的水平和疾病的严重程度和抗DNA抗体水平正相关[27]。从SLE患者中分离的淋巴母细胞高表达IL-6，在体外阻断IL-6将会导致抗DNA抗体的减少[28]。从SLE患者中分离的B淋巴细胞会自发产生更多的免疫球蛋白，阻断IL-6可以显著抑制这些免疫球蛋白的产生[29]。狼疮患者分离的B淋巴细胞可以自发产生抗dsDNA抗

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第一章 前言

体，推测IL-6有助于帮助这些B淋巴细胞分化成为免疫球蛋白分泌细胞[30]。CD5的表达抑制SLE中BCR信号通路，IL-6可以通过DNA甲基化下调CD5的表达，因而有助于SLE患者中自身反应B淋巴细胞的增值活化[31]。

IL-6在SLE中的临床运用：IL-6和它的受体可以作为监测和治疗SLE疾病的生物位点。外周血单核细胞（PBMC）释放的IL-6和狼疮肾炎的疾病状态有关[32]。有研究发现，SLE患者外周淋巴细胞上的gp130含量和疾病状态有关[33]。用IL-6R拮抗剂托珠单抗（tocilizumab）治疗SLE患者的I期临床阶段，高达50%的患者的SLEDAI（系统性红斑狼疮活动指数）有所改善，抗dsDNA抗体和循环血中浆细胞的含量下降了47%[34]。IL-6直接治疗现在还没有在SLE人类患者中实施。

1.2.2 Treg与系统性红斑狼疮

调节性T细胞（Regulatory/suppressor T cells, Treg）是一种免疫抑制细胞，它可能是CD4、CD8甚至是自然杀伤细胞的亚群。Treg细胞可以分为天然产生的自然调节性T细胞（nTreg）和诱导产生的适应性调节T细胞（iTreg）。其中n Treg组成性表达叉头状/翅膀状转录因子（forkhead/winged helix transcription factor, Foxp3），主要以细胞接触的方式发挥免疫抑制作用。iTreg部分表达Foxp3，主要以细胞因子依赖的方式发挥免疫抑制作用。iTreg包括Tr1和Th3，Tr1可以分泌IL-10，Th3可以分泌转化生长因子（transforming growth factor -β, TGF –β）。

在小鼠的CD4 +细胞的约5%是表达Foxp3的调节性T细胞，在人类中只有2%的CD4+细胞的表达Foxp3。Foxp3不是人类Treg细胞特异性表达分子，因为活化的CD4+细胞可以瞬时共表达这个转录因子。n Treg和Foxp3 + i Treg具有类似的表型和功能。血液中的CD4 + CD25 + Foxp3 + Treg可能是这两种细胞的混合，现在还没有办法区分这两种细胞。

Foxp3 + Treg在抑制自身免疫病和保持免疫系统的稳态中具有重要作用。转录因子Foxp3不仅在Treg的分化中具有重要作用，而且阻止这些细胞向Th17炎性细胞转化。在SLE中，Foxp3 + Treg或许数量减少，或许功能受到抑制。在小鼠中敲除Foxp3 + Treg会导致大量的淋巴细胞增生和迅速的致命的多系统自身免疫病。Foxp3的突变也会导致严重人类自身免疫病。IL-2和TGF –β对于维持Foxp3 + Treg的存活具有重要作用，而在SLE中已经发现这两种细胞因子的

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第一章 前言

减少。

Treg在小鼠中的作用：敲除(NZB x NZW)F1杂交小鼠的CD4 + CD25 +细胞会加速新生小鼠患肾小球肾炎[35]。在BWF1和SNF1小鼠患肾小球肾炎之前CD4 + CD25 + Foxp3 +细胞数目减少[36]。将CD4 + CD25 +细胞从年轻SLE易感的小鼠身上转移可以一定程度减轻疾病的发展[37]。用耐受性多肽免疫BWF1和SNF1小鼠，可以导致分泌TGF-β的Foxp3 + CD4 + 和 Foxp3 + CD8 +Treg细胞产生，并且抑制了疾病的发展[38]。

Treg在人类SLE患者中的作用：在二十世纪七八十年代，抑制细胞被主要认为是CD8+细胞，因而普遍认为Treg细胞的数量减少或功能受损是导致SLE中T、B细胞过度活化的重要原因。随着注意力从CD8 +Treg转移到CD4+Treg，在已发表的人类系统性红斑狼疮研究中CD4+Treg的作用已经出现明显矛盾。CD4 + CD25 highTreg在人类SLE中数量减少[39]、不变[40]、随着疾病的治疗增多

[41]

都有文献报道。CD4 + Foxp3 +Treg在人类SLE中数量减少[42]、不变[43]、增

多[44]也都有文献报到。

1.2.3 DC与系统性红斑狼疮

1868年Langerhans首先发现了树突状细胞（Dendritic cells），由于其细胞表面有许多树突状突起故命名为树突状细胞。

DC分布于全身各个器官，在天然免疫和适应性免疫中都发挥重要作用。首先，DC是已知功能最强大的抗原提成细胞。未成熟的DC低表达MHC Ⅱ类分子、共刺激分子和粘附分子，高表达FcR、CR、TLR等。成熟的DC高表达MHC Ⅱ类分子、共刺激分子和粘附分子，不表达FcR、CR、TLR等。未成熟的DC可以通过吞噬和胞饮作用摄取抗原，通过输入淋巴管进入局部淋巴结，分化成成熟的DC，提呈抗原激发T细胞免疫，并分泌一些细胞因子如IL-6 和TNF-α。其次，DC参与中枢和外周免疫耐受。一方面胸腺中的DC通过清除自身反应性T细胞诱导中枢耐受。另一方面DC可以通过多种方式调节外周耐受，例如外周淋巴结中未成熟的DC不提供T细胞活化的信号使T细胞无能，DC提呈死亡相关的信号从而清除T细胞，DC诱导产生免疫抑制细胞从而阻断T细胞的功能等。除此之外DC细胞还具有调节B细胞的功能，诱导T细胞亚群的分化，参与固有免疫等多种功能。

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第一章 前言

DC细胞起源于造血干细胞，根据来源可以分为两群，一群是髓样干细胞在GM-CSF的刺激下分化的髓样树突状细胞（myelid dendritic cells,mDC），一群是淋巴样干细胞分化的淋巴样树突状细胞（lymophiod dendritic cells,lDC）也称为浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells,pDC）。在SLE中，mDC的重要功能是可以摄取凋亡和坏死的细胞物质并提呈给T细胞。而pDC不能够摄取凋亡和坏死的细胞物质，当这些物质和自身抗体结合形成复合物时，pDC就可以摄取复合物并产生大量的I IFN（主要是IFN-α）。在SLE中发现大量的IFN-α，证明pDC参与SLE。

DC细胞可以被很多物质刺激成熟。例如微生物、免疫复合物、免疫细胞、死亡细胞核、死亡细胞释放的物质。如果刺激物是微生物，其通过病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)与DC细胞上的病原识别受体（pathogen recognition receptors, PRRs)结合，PRRs中研究最清楚的就是Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs)。TLRs不是由单独的PAMP的刺激，而且也通过内源理性的TLR配体，它可以从死亡细胞释放和被称为危险相关分子模式（danger-associated molecular patterns, DAMPS）。TLRs的表达和DC的亚型及种族有关。mDC表达大部分已知的TLRs，pDC组成型表达TLR7和TLR9。

在SLE模型中，有过多的凋亡物质沉着。这主要是由于不正常的细胞凋亡和凋亡物质清除不彻底导致的[45,46]。未被有效清除的凋亡物质在组织中聚集，从而导致了二次坏死和炎性细胞因子的释放。凋亡小泡，含有聚集的自身抗原在凋亡细胞表面形成，若凋亡细胞未被有效清除，则凋亡小泡从其表面释放出来。（图1.7）

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第一章 前言

图1.7 凋亡小泡和凋亡物质形成示意图

[47]

过多的凋亡物质沉着导致了异常自身抗原的形成。 [48]。凋亡物质是导致自身免疫疾病有两种可能的途径。一种途径是mDC将正常自身抗原提呈给逃逸了中枢和外周免疫耐受的自身反应性T细胞，自身反应性T细胞活化后有助于自身反应的B细胞活化。另一种途径是B细胞摄取了异常自身抗原之后，提呈来自于异常自身抗原的多肽在细胞表面。mDC将异常自身抗原提呈给T细胞使T细胞活化，活化的T细胞可以识别B细胞表面异常的多肽从而有B细胞的活化，产生针对异常自身抗原的抗体。由于B细胞的免疫耐受不像T细胞那样严格，所以提呈正常的自身抗原的自反应性的B细胞随后产生，T细胞识别异常自身抗原或者正常自身抗原都可以激活B细胞，最终导致了自身抗体的产生。我们倾向于第二种途径，一开始是产生针对异常自身抗原的抗体，最后才产生了自身抗体。

异常自身抗原激活DC。

（1）当凋亡细胞未被及时清除的时候，就会诱发二次凋亡，将会释放大量DAMPS。DAMPS和凋亡小泡、异常自身抗原都可以刺激DC成熟[49]。最近我

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第一章 前言

们发现凋亡小泡可以促使mDC成熟产生大量的IL-6，而剩余凋亡细胞体没有这种功能[50]。很多可以激活DC的内源物质都在凋亡小泡中发现了，例如RNA、DNA、HMGB1。

（2）在异常细胞凋亡和凋亡物质清除不彻底的情况下，凋亡物质将会被DC细胞以一种更具有免疫原性的方式呈递给T细胞。一个广泛被认知的就是HMGB1，它可以通过TLR2，TLR4和RAGE激活DC[51]。HMGB1-核小体复合物可以通过TLR2激活DC细胞，不同于正常细胞的核小体，凋亡细胞的核小体可以导致正常小鼠产生自身抗体[52]。别的TLR2、TLR4内源性配体有热休克蛋白、硫酸乙酰肝素[53]。双链和单链的RNA通过TLR3 和TLR7/8，双链DNA通过TLR9介导DC细胞的成熟。当含有DNA的染色体和自身抗体结合之后，可以通过TLR9依赖的方式介导DC的成熟[54]。但是，也有报道发现染色体-免疫球蛋白复合物、核小体也可以通过TLR9不依赖的方式激活DC[55,56]。

（3）MyD88是TLR的一个重要适配器，MyD88缺陷的狼疮易感小鼠不易患自身免疫性肾炎，这证明了TLR在SLE病理中发挥作用[57]。因此，SIGIRR（TLR的一个负调控因子）缺陷的狼疮易感小鼠加速SLE的病情[58]。在TLR9缺陷的狼疮易感小鼠中，抗DNA、抗染色体的自身抗体的形成受损[59]。然而，在动物模型中我们也发现了TLR9具有保护作用[60]。在人类中TLR9的基因变异和SLE易感之间的关系还未能被证实[61]。TLR7在SLE中的作用在小鼠模型中尤为明显。识别含有RNA的抗原的自身抗体的产生被证明和TLR7有关[62]。TLR7的过度表达导致DC调节紊乱，导致了大量炎性因子的释放例如IL-6 、TNF-α，血清中自身抗体的产生和致命的全身性自身免疫病[63]。但是在SLE患者中没有发现增多的TLR7。当依赖于TLR3、TLR7、TLR9的信号同时被阻断之后，狼疮易感小鼠的抗核抗体的产生和疾病症状明显减轻[64]。Baccala和他的同事提出假设，在 SLE的病情发展中中，TLR的作用是变化的。初始阶段TLR刺激DC的成熟与凋亡物质和核酸有关，当自身抗体形成之后，TLR刺激DC的成熟主要与核酸免疫复合物有关[65]。

SLE中DC与T细胞的分化有关。被异常细胞凋亡和未被彻底清除的凋亡物质激活的DC可以促进T细胞不同亚群的分化[66,67]。当成熟的DC以免疫耐受的方式提呈自身抗原的时候，自身反应性T细胞被清除，Treg细胞被激活，Treg的激活主要和TGF-β有关。当成熟的DC以免疫原的方式提呈自身抗原的时候，自然杀伤性T细胞和辅助性T细胞被激活。IL-6可以阻碍Treg的分化，而且抑制它的免疫抑制功能。IL-6和TGF-β可以促进Th17的分化，IL-23、IL-21可以

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第一章 前言

阻碍Th17的分化。mDC与核小体、凋亡小泡共培养，mDC分化成熟，而且会产生高浓度的IL-6。另外我们发现，由凋亡小泡刺激成熟的DC和异体淋巴细胞混合培养时，会促进脾细胞产生IL-17[50]。

总结：在SLE中，异常细胞凋亡和未被有效清除的凋亡物质会导致凋亡核小体和凋亡小泡等物质。这些物质被mDC摄取，使其成为成熟的mDC。成熟的mDC表达一些共刺激分子并且分泌一些细胞因子如IL-6。IL-6抑制了Treg的分化和功能，IL-6和TGF-β促进了TH17的分化，一些细胞因子同时也促进了Th亚群Th1、Th2的分化。分化的Th细胞辅助B细胞的活化，产生自身抗体。自身抗体和凋亡物质形成复合物，pDC就可以摄取复合物并产生大量的I IFN（主要是IFN-α），IFN-α有助于自身抗体的产生和抗体亚型的转换，起到一个放大作用。复合物可以和多器官的基底膜结合，造成炎症反应，形成不同的临床症状，例如肾小球肾炎。而这些组织损伤又会造成更多的细胞凋亡，从而形成一个正反馈。（图1.8）

图1.8 DC细胞在系统性红斑狼疮中的作用

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第一章 前言

1.2.4 T细胞与系统性红斑狼疮（图1.9）

本实验研究T细胞的分化分为三个时期。在分化早期，T细胞既不表达CD4也不表达CD8的双阴性细胞；随着在胸腺内的分化成熟，T细胞既表达CD4也表达CD8的双阳性细胞，最后经过二次选择成为表达CD4或者CD8的单阳性细胞。T细胞可以分为CD4 +T细胞和CD8 +T细胞，CD8+T细胞为细胞毒性T细胞，CD4+T细胞为辅助性T细胞，CD4+T又可以根据细胞因子的不同分化成不同亚型。

CD8 +T细胞和双阴性细胞：在SLE病人中CD8+T细胞数量增多[68]，敲除CD8+T细胞会导致SLE[69]。同时在SLE病人中双阴性细胞扩增，这些双阴性细胞可能是由CD8+T受到抗-CD3-TCR 自身抗体和抗原刺激后脱去CD8分子产生的。这些双阴性细胞可以浸润靶器官，导致炎症反应，促进B细胞产生抗体[66]。

Th1和Th2细胞： Th1主要分泌IFN-γ、IL-2、TGF-β，主要参与细胞免疫，。Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10，主要参与体液免疫。在SLE中由于细胞因子分泌异常导致Th1和Th2细胞平衡异常。部分研究发现在SLE病人中Th1分泌的细胞因子显著增高，而也有研究发现发现SLE中Th2分泌的细胞因子显著增高，更有研究发现Th1 、Th2 型细胞因子水平均升高。或许在SLE中Th1 、Th2处于动态变化中。

Th17细胞：Th17是新发现的一类辅助性T细胞，TGF-β、IL-6 或者 IL-21有助于Th17的分化，它可以产生细胞因子IL-17A, IL-17F, IL-21, and IL-22，表达转录因子RORγt、RORα。有大量报道发现在SLE中，Th17细胞增多，血清中IL-17增多[67,70,71]。

TFH 细胞：滤泡辅助性T细胞是由 Schaerli和 Breitfeld在2000年几乎同时发现的一类新型CD4、CXCR5 双阳性辅助性T细。这类细胞位于淋巴结滤泡中，在CXCR13 的趋化下被募集到淋巴滤泡并与B细胞共定位和相互作用，并同时高表达 ICOS 、Bcl-6 、CD40L和PD -1 ，分泌IL-21，刺激B 细胞的增殖成熟和诱导免疫球蛋白类别转换。Tfh 细胞能促使生发中心（GC ）中缺乏自身反应性 、具有抗原高亲和力的B细胞分化为高亲和力的浆细胞和对感染起长期保护作用的记忆性 B 细胞 ，在促进 GC 的形成 、维持长时间的体液免疫应答等方面也发挥关键性的作用。在SLE患者的外周血中，CD4+CXCR5+双阳性细胞数量增加，其表型类似于Tfh 细胞，高表达T细胞共刺激分子ICOS和

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第一章 前言

程序性死亡分子PD-1[72]。同时在易患SLE的小鼠中，疾病的发展伴随着Tfh 细胞细胞数量的增多，并且发现了滤泡外辅助性T细胞（在自体免疫的小鼠滤泡外生发中心中发现的一类类似细胞）[73]。另外，引进妨碍Tfh 细胞和滤泡外辅助性T细胞的基因缺陷，对小鼠患SLE具有保护作用[74]。IL-21受体缺陷的小鼠不易患SLE[75]，而在SLE患者的血清中也发现了高表达的IL-21[76]。

图1.9 T细胞在系统性红斑狼疮中的作用

第三节 本实验研究

1.3.1 研究目的和意义

系统性红斑狼疮是一种多系统自身免疫疾病，可累及全身各个器官，严重危害人类的生命健康和生活质量。由于其病理机制非常复杂，至今未被阐明。现在对于系统性红斑狼疮的治疗主要是一些免疫抑制药物，但是这些药物具有明显的副作用，且不能从根本上治愈疾病。本实验通过小鼠系统性红斑狼疮模型的构建，研究其IL-6在系统性红斑狼疮中的致病机理，为开发IL-6及其受体的药物治疗系统性红斑狼疮具有重要作用。

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第一章 前言

1.3.2 研究方法和内容

本实验首先用建立了一个小鼠SLE模型：用ConA在体外刺激小鼠脾脏细胞7天，提取ALD-DNA。然后用ALD-DNA免疫小鼠建立SLE模型，具体表现为血清中dsDNA抗体含量增多、尿蛋白含量增多、肾脏病理切片损伤加重。其次，我们发现IL-6敲除的老鼠用ALD-DNA免疫后不易患SLE，这证明IL-6在SLE中可能起到促进疾病的作用。在体内，我们用ELISA检测ALD-DNA免疫小鼠的血清，发现大量IL-6、dsDNA抗体 。在体外，我们用ALD-DNA刺激小鼠脾脏细胞，ELISA检测发现上清中含有大量的IL-6、dsDNA抗体、IL-17和 TNF-a。这进一步说明了ALD-DNA可以介导IL-6的产生，因而在SLE中发挥作用。然后我们研究了IL-6在小鼠SLE中可能影响的细胞是Treg和CD4+T细胞，IL-6抑制了Treg的分化，而且促进了CD4+T细胞的活化。我们用流失细胞分析仪检测ALD-DNA免疫的小鼠脾脏和淋巴结细胞，发现Treg的含量减少，而活化的CD4+T细胞的数量增加。最后，我们研究了在小鼠SLE模型中，IL-6细胞的来源一部分是DC细胞。我们取小鼠的骨髓细胞进行DC细胞的分化培养，然后用ALD-DNA刺激培养1天，ELISA检测上清发现了大量的IL-6和 TNF-a。随后我们用这个上清做小鼠脾脏淋巴细胞向Treg的分化培养，流式细胞分析发现Treg的数量减少。这证明IL-6和/或TNF-a 可以抑制Treg的分化。随后我们用抗体分别阻断IL-6和TNF-a，发现阻断IL-6可以部分缓解对Treg的抑制，而阻断TNF-a对Treg的分化产生微小影响。最终我们得出结论，在ALD-DNA免疫建立的小鼠SLE模型中，DC分泌大量的IL-6，IL-6可以抑制Treg的表达，从而对SLE具有促进作用。

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第二章 实验材料很方法

第二章 实验材料和方法

第一节 实验材料

2.1.1 实验小鼠

6-8周B6雌性野生型小鼠从军事医学科学院（北京，中国）研究院购，IL-6KO小鼠购自Jackson实验室（缅因州巴港）购买。在我们的实验中使用的所有小鼠均为雌性。所有动物保持控制温度和湿度下的无特定病原体（SPF）的条件下进行（恒温24~26℃，恒湿45~55%，置于层流超净架内，12h光照和12h黑暗交替，自由进食SPF级颗粒饲料及饮水）。所有动物的饲养按照医学实验室动物护理和使用（卫生部，中国）和南开大学生命科学学院机构动物护理和使用委员会条例执行。（恒温24~26℃，恒湿45~55%，置于层流超净架内，12h光照和12h黑暗交替，自由进食SPF级颗粒饲料及饮水）。

2.1.2 实验试剂

RPMI-1640：Hyclone laboratories ,logon,UT FBS：Gibco,Renfrewshire,UK 红细胞裂解液：Sigma-Aldrich ConA： Sigma (St. Louis, MO) PBS：Solarbio

Tween20：Sigma-Aldrich 弗式完全佐剂（CFA）、弗式不完全佐剂（IFA）：Dingguo Co.,Beijing 0.5%的硫酸鱼精蛋白：Sigma-Aldrich

S1核酸酶处理后的小牛胸腺dsDNA：Sigma-Aldrich 羊血清：Yuanhen Jinma Co,Beijing 羊抗鼠IgG-HRP：Southern Biotech

2mol/L的H2SO4：天津市化学试剂批发公司

APC标记的CD4+的抗体：(clone GK1.5) Sungene Biotech (Tianjin, China) PercP标记的CD44抗体：(clone IM7) Sungene Biotech (Tianjin, China) PE标记的Foxp3+抗体：(clone MF-14) Sungene Biotech (Tianjin, China) FITC标记的CD62L抗体：(clone MEM-14) Biolegned (San Diego, CA)

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第二章 实验材料很方法

FITC标记的IFN-γ抗体：(clone XMG1.2) Biolegned (San Diego, CA) Fixation、Perm：eBioscience (San Digeo,CA) anti-CD3： anti-CD28：

IL-2：R&D Systems (Minneapolis,MN) TGF-β：PeproTech (Rocky Hill, NJ) IL-12 ：PeproTech (Rocky Hill, NJ) anti-IL-4 ：

anti-IL-6: (clone MP5-20F3) Biolegned (San Diego,CA) anti-TNF-a: (clone XT3.11) Biolegned (San Diego,CA). Golgi-plugBecton Dickinson(San Jose, CA) 甲醛溶液：天津市大茂化学 Saponin溶液：Sigma-Aldrich

GM-CSF：PeproTech (Rocky Hill, NJ) LPS、CpG：InvivoGen (San Diego, CA)

2.1.3 实验仪器

Cell Strainer 40μm Nylon：BD Falcon 15ml 离心管、50ml 离心管： BD Falcon 细胞培养板：BD Falcon 细胞培养皿：BD Falcon 细胞培养瓶：BD Falcon

HEPA Class 100 CO2细胞培养箱：Thermo 超净工作台：ESCO 制冰机：Scotsman 移液枪：Eppendorf

水平转头台式离心机Centrifuge 5810R：Eppendorf 小型高速离心机Centrifuge 5418 ：Eppendorf MultiScan MK3酶标仪：Thermo 倒置荧光显微镜CKX32：Olympus -80℃超低温冰箱：Thermo -20℃低温冰箱：海尔 4℃冰箱：海尔

1ml注射器、2.5毫升注射器：洪达

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第二章 实验材料很方法

毛细管：华西医科大学仪器厂 酶标板：Nunc,Denmark 流式管：BD Falcon

流式细胞仪FACSCalibur：BD MLS-3750 高压灭菌锅：SANYO 电子天平BT 125D：Sartorius

Milli-Q Biocel-A10 纯水系统：Millipore

第二节 实验方法

2.2.1 DNA的制备

2.2.1.1 小鼠脾脏单细胞悬液的制备（除第一步外，其余在超净工作台无菌环境中进行）

（1） 取10只左右C57BL/6小鼠脱臼处死，取脾脏置含有30ml 左右RPMI-1640

的50ml离心管中。（注意取脾脏时小心去除黏连的其它组织）

（2） 用玻片将脾脏研碎于细胞培养皿中。（每次用玻片切割一小块脾脏组织，

碾磨充分以尽可能获得脾脏细胞，用力不要过大防止破坏细胞结构） （3） 用细胞过滤网过滤至新的50ml离心管中。 （4） 离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清。

（5） 加入红细胞裂解液重悬，3ml/脾脏，室温放置10min。（可先加1ml红细

胞裂解液将沉淀吹打混匀，再加入其余红细胞裂解液，颠倒混匀） （6） 用细胞过滤网过滤至新的50ml离心管中。 （7） 离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清。 （8） 加入30ml左右含10?S的RPMI-1640重悬 2.2.1.2

ConA刺激小鼠脾脏单细胞悬液（超净工作台无菌环境中进行）

（1） 细胞计数，调整细胞浓度至2×106/mL。（细胞计数可以将脾脏单细胞悬液

稀释50倍再计数，防止细胞浓度过大，视野中细胞数量过多。细胞浓度=（对角线2个16格细胞总数/2×104×稀释倍数）/ml）

（2） 将脾脏单细胞悬液均等分为2份，分别用和不用ConA(5μg/mL)刺激。用

ConA刺激的为脾脏单细胞悬液提取出来的是ALD-DNA，不用ConA刺

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第二章 实验材料很方法

激的脾脏单细胞悬液提取出来的是unALD-DNA） （3） 加入细胞培养瓶中，置细胞培养箱中培养7天。 2.2.1.3 DNA的提取

（1） 收集上述细胞至50ml离心管中，离心（4℃，1500rpm，7min），弃上清。 （2） 用30ml PBS重悬，离心（4℃，4000rpm，5min），弃上清。

（3） 加入1ml PBS将沉淀吹打混匀，加入细胞裂解液24 mL/管、蛋白酶K

240μL/管、Rnase 160μL/管，包好封口膜，置37℃水浴中12～24小时。（加入细胞裂解液后，脾脏单细胞悬液变得粘稠，应尽力多吹打几次，使细胞充分裂解）

（4） 加入等体积的平衡酚，混匀，离心（4℃，10000rpm，15min），转移上

层水相。（转移上层水相时，枪头应尽量沿着液面缓慢向下移动，尽量不要吸到下层）

（5） 重复用平衡酚抽提1次。

（6） 加入等体积的氯仿/异戊醇混合液（体积比24/1配制），混匀，离心（4℃，

10000rpm，15min），转移上层水相。

（7） 加入1/10体积的乙酸钠（3mol/mL，pH5.2）和2～2.5倍体积的无水乙

醇，用力混匀。（混匀后可以看见DNA呈絮状）

（8） 置-20℃冰箱中冻存至少1个小时 （时间长有利于DNA析出）。 （9） 离心（4℃，10000rpm，15min），弃上清。

（10） 沉淀转移至1.5ml离心管中，加入1ml 75%乙醇洗涤，混匀，离心（4℃，

10000rpm，15min），弃上清。

（11） 重复乙醇洗涤一次，室温自然晾干。（晾干时间一般为3小时左右） （12） 沉淀溶于1ml的含RNA酶(20μg/mL)的无菌水中，-20℃保存。 （13） 用Nano-drop检测其在260nm的吸光度（A）以计算其浓度，并且A260/280

应大于1.8。

2.2.2 小鼠系统性红斑狼疮模型的构建

2.2.2.1 DNA-佐剂乳化液的制备

（1）等体积的DNA和弗式完全佐剂（CFA）或弗式不完全佐剂（IFA）混合，用1ml注射器反复抽吸混匀。

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第二章 实验材料很方法

（2）滴一滴在水中，若形成“油包水”状不散开则乳化完成，乳化时间一般需要4小时左右。 2.2.2.2 小鼠的免疫

（1）初次免疫DNA-弗式完全佐剂乳化液，DNA（50μg/mice），200?L每只小鼠，背部皮下注射。

（2）第二周和第四周再次免疫，DNA溶液与弗式不完全佐剂乳化液，DNA（50μg/mice），200?L每只小鼠。 （3）对照组小鼠每次注射等计量的PBS。 2.2.2.3 小鼠发病状况的检测

（1）每两周小鼠眼静脉取血制备血清检测ds-DNA含量。（血清的制备：一毛细管约100?L血液，置于1.5ml离心管中；4℃过夜或者室温0.5h；离心（3800rpm，15min），取上清；离心（3800rpm，5min），取上清）

（2）每两周小鼠取尿检测尿蛋白含量。（取尿时应注意，要迅速抓住小鼠，将其放在一张锡箔纸上，小鼠由于害怕会产生拍尿反应，若小鼠无尿则可以用手轻轻按压腹部促进拍年反应）

（3）14周后处死小鼠取肾脏做病理切片。

2.2.3 dsDNA抗体的检测

2.2.3.1 溶液的配制

（1）PBST：PBS+0.5%Tween-20 （2）封闭液：PBST+5%羊血清

（3）稀释液：PBST+5%羊血清+10%小牛血清 （4）羊抗鼠IgG-HRP：用稀释液稀释1：2000稀释 （5）底物TMB：A液和B液等量混合 （6）终止液：28ml浓硫酸加入500ml水中 2.2.3.2 实验步骤

（1）酶标板处理：酶标板用0.5%的硫酸鱼精蛋白处理，100μL/孔，37℃震荡1h。用300?L PBST洗涤1次，控干。（洗涤时先将溶液弃去，然后在吸水纸上拍打几次；使用排枪时应注意观察每个枪头内溶液的液面是否一致）

（2）包板：S1核酸酶处理后的小牛胸腺dsDNA按50μg/mL作为包被抗原，100μL/

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第二章 实验材料很方法

孔，37℃震荡2h，置于4℃冰箱过夜。PBST洗涤3次，控干。

（3）封闭：加封闭液，100μL/孔，37℃震荡1h。PBST洗涤1次，空干。 （4）待测物：加待测物，100μL/孔，37℃震荡2h。PBST洗涤3次，控干。（如果是血清用稀释液1:50稀释，如果是细胞培养上清则不用稀释。加样时应避免错漏孔，加样完毕尽快记录加样顺序）

（5）加检测抗体：加羊抗鼠IgG-HRP，100μL/孔，37℃震荡1h。PBST洗涤4次，控干。

（6）显色：加配好的底物TMB，100μL/孔，37℃震荡30min。 （7）终止反应：加入终止液，50μL/孔。37℃温箱中30min。 （8）检测：用酶标仪检测其在450nm处OD值。

2.2.4 尿蛋白的检测

按照TIANGEN公司BCA蛋白质定量试剂盒（PA115）说明书进行操作 2.2.4.1 实验原理：蛋白质分子中的肽键结构在碱性环境下能与Cu2+生成络合物，并将Cu2+还原成Cu+，BCA可以特异性的与Cu+结合生成有颜色的化合物，并在562nm处有最大吸光度，吸光度的大小与蛋白质的浓度成正比。 2.2.4.2 溶液配制

（1） 稀释标准品：用与样品相同缓冲体系的稀释液按下表稀释BSA标准品。

表2.1 标准品稀释浓度配制表

管号 A B C D E F G H I 稀液体积（μL） BSA体积（μL） BSA终浓度（μg/ml） 0 125 325 175 325 325 325 400 400 300（母液） 375（母液） 325（母液） 175（B） 325（C） 325（E） 325（F） 100（G） 0 2000 1500 1000 750 500 250 125 25 0 （2） 配制BCA工作液：依样品数量计算所需体积，将试剂A和试剂B按照体

积比1:50配制，充分混匀。

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第二章 实验材料很方法

2.2.4.3 实验步骤

（1）分别取25μL标准品稀释液和待测样品加入到96孔板中。 （2）加入200μLBCA工作液，充分混匀。

（3）37℃孵育30min后，冷却至室温或者室温放置2h。 （4）用酶标仪检测其在562nm处的吸光度。 （5）根据标准曲线计算样品中蛋白质的浓度。

2.2.5 肾脏病理切片的制作

（1）取材：小鼠脱臼处死，取肾脏，切取中间组织，既要包括皮质也要包括髓质。组织应尽量保持新鲜，最好在处死小鼠30min以内。刀锋应保持锋利，避免来回切割，损坏组织。组织的大小应适宜，厚度在05mm左右，大小不要超过15mm×15mm。

（2）固定：将肾脏放入含有10ml 4%多聚甲醛的15ml离心管中，固定24h。固定可保持组织细胞内的蛋白质、糖、脂肪等物质保持原有形态；使组织块变硬有利于后续操作；防止组织自溶和细菌的腐蚀；对于一些传染性的标本杀灭病原体防止传染。

（3）冲洗：流水冲洗12-24h。冲洗可洗去固定液，组织中的固定液会妨碍染色。 （4）脱水：70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、100%无水乙醇、100%无水乙醇，每步2h，此补步骤可以在脱水机中完成。经过冲洗后的组织块含有大量水分，水不溶于石蜡妨碍包埋，乙醇可以与水以任意比例互溶，故用从低浓度到高浓度的乙醇置换组织块中的水分。

（5）透明：二甲苯与无水乙醇等体积混合液中1h，4℃二甲苯中1h，室温二甲苯中1h。无水乙醇步溶于石蜡妨碍包埋，二甲苯即溶于无水乙醇又溶于石蜡，故用二甲苯将组织块中的无水乙醇置换出来。

（6）浸蜡：二甲苯与石蜡等体积混合液中1h，石蜡中1h，石蜡中1h，温度应该比石蜡的熔点高3℃的恒温箱中，一般石蜡的熔点为52-56℃。用石蜡替换组织块中的二甲苯，二甲苯会产生结晶，使组织在切片时产生断裂。

（7）包埋：调整组织块在包埋盒中的位置，置于石蜡中包埋。包埋时石蜡温度不宜过高，否则会使组织变脆变硬，妨碍后续切片甚至诊断

（8）切片、展片、捞片、烤片：用切片机将组织块切成5-10μm，用镊子将其放

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第二章 实验材料很方法

倒温水上展开，待其完全展开后使其粘附到载玻片上，然后置60℃温箱中30min。 （9）HE染色：脱蜡、脱苯、复水、染色、脱水、透明、封固。苏木精是一种碱性染料，可与细胞中的酸性物质如细胞核中的脱氧核糖核苷酸结合，呈蓝色。依红是一种酸性染料，可与细胞中的碱性物质如细胞质中的蛋白质结合，呈红色。

（10）镜下照相。

2.2.6 ELISA检测

按照Biolegned (San Diego, CA)的ELISA试剂盒说明书进行操作

2.2.6.1 实验原理：抗体（抗原）吸附在固相载体上，加待测抗原（抗体）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗体（抗原）－待测抗原（抗体））－酶标记抗体（抗原）的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物，酶标仪检测的吸光度与待测抗原（抗体）量成正比。 2.2.6.2 溶液配制

（1）包被缓冲液：用去离子水把5×包被缓冲液稀释成1×。一个96孔板配制12ml，2.4ml 5×包被缓冲液加入9.6ml去离子水中。

（2）稀释液：用PBS把5×稀释液液稀释成1×。一个96孔板配制50ml，10ml 5×稀释液加入40ml去离子水中。

（3）标准品：储存：买的标准品粉末首先溶于0.2ml的稀释液中，一个96孔板用量分装一个八连管小管中，置于-80℃中保存。使用：将存储液拿出，按照不同检测物的说明书要求，配制1ml 浓度为500pg/ml的最高浓度溶液，再倍比稀释6管至浓度为7.8pg/ml。

（4）包被抗体：用包被缓冲液1:2000稀释。一个96孔板配制12ml，60μL包被抗体加入11.94ml包被缓冲液中。（在15ml离心管中加入12ml包被缓冲液，弃去60μL包被缓冲液后，再加入60μL包被抗体）

（5）检测抗体：用稀释液1:200稀释。一个96孔板配制12ml，60μL检测抗体加入11.94ml包被缓冲液中。

（6）Avidin-HRP的配制：用稀释液1:1000稀释，一个96孔板配制12ml，12μL Avidin-HRP加入11.99ml稀释液中。

（7）底物TMB：A液和B液等量混合。一个96孔板配制12ml，6ml A液加6ml

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第二章 实验材料很方法

B液。（加A、B液时一定要记得换枪头，加完混合后置于暗处） （8）终止液： 2.2.6.3 操作步骤：

（1） 包板：加入包被抗体100μL/孔，4℃过夜。PBST洗涤4遍，控干。 （2） 封闭：加入稀释液200μL/孔，室温震荡1h。PBST洗涤4遍，控干 （3） 加入标准品和待测物：100μL/孔，室温震荡2h。（如果是血清用稀释液1:50

稀释，如果是细胞培养上清则不用稀释）PBST洗涤4遍，控干 （4） 加入检测抗体：100μL/孔，室温震荡1h。PBST洗涤4遍，控干 （5） 加入Avidin-HRP： 100μL/孔，室温震荡30min。PBST洗涤5遍，控干 （6） 显色：加入TMD100μL/孔，置暗处显色15-30min。 （7） 终止反应：加入终止液100μL/孔

（8） 检测：紫外分光光度计检测其在450nm处的吸光度 （9） 计算：根据标准曲线计算待测物的浓度

2.2.7 小鼠脾细胞体外刺激

2.2.7.1 制备小鼠脾脏单细胞悬液

（1） 小鼠脱臼处死，取脾脏置含有10ml 左右RPMI-1640的15ml离心管中。 （2） 用玻片将脾脏研碎于细胞培养皿中。 （3） 用细胞过滤网过滤至新的15ml离心管中。 （4） 离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清。

（5） 加入红细胞裂解液重悬，3ml/脾脏，室温放置10min。 （6） 用细胞过滤网过滤至新的15ml离心管中。 （7） 离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清 （8） 加入3ml左右含10?S的RPMI-1640重悬 2.2.7.2 体外刺激

（1）细胞计数，调整细胞浓度至5×106个/ml。

（2）ALD-DNA(50 μg/ml)、unALD-DNA(50 μg/ml)、none刺激脾脏细胞 （3）将细胞悬液加入细胞培养板24孔板，1ml/孔，同一个条件做6个复孔，置细胞培养箱中培养6天。

（4）每天收取6个复孔中的1孔上清，ELISA检测细胞因子和dsDNA抗体

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第二章 实验材料很方法

2.2.8 小鼠CD4+T细胞活化状态的染色

2.2.8.1 制备小鼠脾脏单细胞悬液

（1） 小鼠脱臼处死，取脾脏置含有3ml 左右PBS的流式管中。 （2） 用玻片将脾脏研碎于细胞培养皿中。 （3） 用细胞过滤网过滤至新的流式管中。

（4） 离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清。（先倒去上清，然后将管口倒置

在吸水纸上，不可反复震动流式管防止将细胞弃去） （5） 加入红细胞裂解液重悬，3ml/脾脏，室温放置10min。 （6） 离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清。 2.2.8.2 制备小鼠淋巴结单细胞悬液

（1） 小鼠脱臼处死，取腹股沟及腋下淋巴结，置含有3 ml 左右PBS的平皿中。

（用75%酒精先喷湿小鼠体表，用剪刀和镊子从中央剪开小鼠腹部皮肤，小心用手撕拉皮肤置腹股沟及腋下，可见淋巴结，用镊子小心夹取淋巴结，不可用力过大否则淋巴结破碎）

（2） 用玻片研磨碎。（淋巴结相对于脾脏比较好研磨，轻轻研磨几下就可以） （3） 用细胞过滤网过滤置流式管中。 （4） 离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清。 2.2.8.3 表面染色

（1）加入50μL PBS重悬。

（2） 加入0.25μL APC标记的CD4+的抗体、0.25μLμLPerCP标记的CD44抗体、0.25μL FITC标记的CD62L抗体，混匀。设置一个空白管不加抗体，一个单染管只加APC标记的CD4+的抗体，一个单染管只加PerCP标记的CD44抗体，一个单染管只加FITC标记的CD62L抗体。4℃染色30min。（加入抗体时由于体积非常小，要注意观察枪头内是否吸到抗体，抗体是否加入细胞悬液中，且加抗体时不要反复吹吸，否则容易导致抗体残余在枪头内无法加入。使用抗体前，应将抗体离心后使用）

（3）加入3ml PBS重悬，离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清。 （4）样品管用200μLPBS重悬，空白管和单染管用300μLPBS重悬。 2.2.8.4 流式细胞仪检测

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第二章 实验材料很方法

2.2.9 小鼠Treg细胞染色

2.2.9.1 制备小鼠脾细胞单细胞悬液 2.2.9.2 制备小鼠淋巴细胞单细胞悬液 2.2.9.3 小鼠Treg染色

（1）加入500μLFixation重悬，避光4℃打孔30min。

（2）加入2ml Perm重悬，离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清。 （3）Perm重复洗涤一次。

（4）加入0.25μLAPC标记的CD4+的抗体和0.25μL PE标记的Foxp3+抗体。设置一个空白管不加抗体，一个单染管只加APC标记的CD4+的抗体，一个单染管只加PE标记的Foxp3+抗体。避光4℃染色30min。 （5）Perm洗涤一次 （6）PBS洗涤一次

（7）样品管用200μLPBS重悬，空白管和单染管用300μLPBS重悬。

2.2.10 小鼠脾细胞Treg的分化培养和染色

2.2.10.1 制备小鼠脾脏单细胞悬液 2.2.10.2 分化培养

（1）包板：用anti-CD3 （10ug/ml） 包被96孔板，50μL/孔，37℃ 2h或者4℃过夜。（anti-CD3（10ug/ml）用RPMI-1640稀释）

（2）细胞计数，调整细胞浓度至2.5×106个/ml。（细胞用含10?S的RPMI-1640重悬稀释）

（3）细胞悬液中加入细胞因子anti-CD28 （1 ug/ml）、IL-2 （2 ng/ml）、TGF-β（5 ng/ml）

（4）将细胞悬液加入细胞培养板，200μL/孔，置细胞培养箱中培养。（包被的细胞培养板在使用时要用RPMI-1640洗涤1遍）

（5）2天后换液转孔：小心弃去原培养基，加入新的含有IL-2 (2 ng/ml)的新培养基，重悬细胞至新的96孔板中，置细胞培养箱中培养。

（6）3天后换液分孔：显微镜下观察细胞生长状态，根据细胞生长状态确定分

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第二章 实验材料很方法

孔比例。（一般为1:2，即96孔板一孔转入48孔板一孔）小心弃去原培养基，加入新的含有IL-2 (2 ng/ml)的新培养基，重悬细胞至新的48孔板中，置细胞培养箱中培养。

（7）5天后收集细胞：弃去培养基，用PBS重悬细胞至流式管中，离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清 2.2.10.3 Treg染色 2.2.10.4 流式细胞仪检测

2.2.11 小鼠Th1细胞的分化培养和染色

2.2.11.1 制备小鼠脾细胞单细胞悬液 2.2.11.2 分化培养

（1）包板：用anti-CD3 （10ug/ml） 包被96孔板，50μL/孔，37℃2h或者4℃过夜。

（2）细胞计数，调整细胞浓度至2.5×106个/ml。

（3）细胞悬液中加入细胞因子anti-CD28 （1 ug/ml）、IL-2 （2 ng/ml）, IL-12 （5 ng/ml） 和anti-IL-4 （10 ug/ml）。

（4）将细胞悬液加入细胞培养板，200μL/孔，置细胞培养箱中培养。 （5）2天后换液转孔：小心弃去原培养基，加入新的含有IL-2 （2 ng/ml）的新培养基，重悬细胞至新的96孔板中，置细胞培养箱中培养

（6）3天后换液分孔：显微镜下观察细胞生长状态，根据细胞生长状态确定分孔比例。小心弃去原培养基，加入新的含有IL-2 （2 ng/ml）的新培养基，重悬细胞至新的48孔板中，置细胞培养箱中培养。

（7）5天后再刺激：anti-CD3 （10ug/ml）预包板，50μL/孔，37℃2h或者4℃过夜。（anti-CD3（10ug/ml）用RPMI-1640稀释）弃去原培养基，加入含有anti-CD28 （1 ug/ml）、IL-2（2 ng/ml）的新培养基，重悬细胞至新的包被板中，细胞培养箱中培养4h。

（8）阻止蛋白分泌：加入Golgi-plug（1μL/mL），细胞培养箱中培养2h。 （9） 收集细胞：弃去培养基，用PBS重悬细胞至流式管中，离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清 2.2.11.3 染色

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第二章 实验材料很方法

（2）固定：用PBS配制的2%的甲醛溶液重悬，2ml/管，室温30min。离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清。

（3）洗涤：加入3mL PBS，离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清。 （4）再洗涤：加入3mL PBS，离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清。 （5）打孔：用PBS配制的0.5%的Saponin溶液重悬，2ml每管，避光室温打孔30min。离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清。（Saponin溶液的配制：先在50ml离心管中加入3ml的PBS，然后称量所需的Saponin粉末倒入50ml离心管中，补加入所需的PBS，将其放在冰上等其自然溶解，不可以摇晃否则会产生大量泡沫。且由于Saponin是有毒物质，又呈粉末状，配制时应该带上口罩，防止吸入鼻腔和口腔内对身体造成危害）

（6）染色：加入0.25μL APC标记的CD4+的抗体和0.25μL FITC标记的IFN-γ抗体，另准备一个空白管，一个单染管只加APC标记的CD4+的抗体，一个单染管只加FITC标记的IFN-γ抗体。避光4℃染色30min。

（7）Saponin溶液洗涤：加入用PBS配制的0.5%的Saponin溶液重悬，2ml每管，离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清。 （8）Saponin溶液洗涤再洗涤一次。 （9）PBS溶液洗涤一次。

（10）样品管用200μLPBS重悬，空白管和单染管用300μLPBS重悬。

2.2.12 小鼠BMDC细胞分化培养、刺激和共培养

2.2.12.1 小鼠BMDC细胞的分化培养（除了第一步其余应在超净工作台无菌环境下进行）

（1）小鼠脱臼处死，取两个后肢，包括股骨、胫骨和腓骨，置含有3ml左右PBS的平皿中。（用75%酒精喷湿小鼠体表，用剪刀和镊子从中央剪开腹部皮肤，小心用手撕拉皮肤至脚部，用剪刀剪除皮肤，从下剪除脚掌，注意不要剪断胫骨和腓骨，从上剪断股骨处，注意不要剪断股骨）

（2）用剪刀去除腿上的大部分肉，再使用的Kimwipe纸尽可能清洁骨上残余的肉，然后把骨头放在含有3ml左右PBS的平皿中 。

（3）剪刀剪开骨的两端，用2.5毫升注射器冲洗骨髓至含有10ml左右PBS的15ml离心管中。

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第二章 实验材料很方法

（4）离心（4℃，1800rpm，7min），弃上清。 （5）加入3ml红细胞裂解液重悬，室温放置10min。 （6）离心（4℃，1800rpm，7min），弃上清。

（7）10ml RPMI-1640重悬，细胞过滤器过滤置新的15ml离心管中。 （8）离心（4℃，1800rpm，7min），弃上清。 （9）10ml含5?S的RPMI-1640重悬。 （10）加入GM-CSF（10 ng/ml），混匀。 （11）加入细胞培养皿中，置细胞培养箱中培养。

（12）2天后换液换皿：从细胞培养箱中小心取出培养的细胞，显微镜下观察细胞生长状态。小心弃去7ml上清（注意倾斜细胞培养皿，枪头贴着侧壁小心吸取培养基，不要扰动下层细胞）。在新的细胞培养皿中加入5ml新配置的含有GM-CSF（10 ng/ml）和5?S的RPMI-1640培养基。用枪将剩下的3ml培养基（由于细胞培养箱中的蒸发，实际剩余体积肯能小于3ml）轻轻吹打细胞培养皿上的细胞，转移至新的细胞培养皿中。用2ml新配置的含有GM-CSF（10 ng/ml）和5?S的RPMI-1640培养基冲洗一下残余细胞并转移至新的细胞培养皿中。 （13）4天后换液不换皿：从细胞培养箱中小心取出培养的细胞，显微镜下观察细胞生长状态，小心弃去7ml上清（注意倾斜细胞培养皿，枪头贴着侧壁小心吸取培养基，不要扰动下层细胞），加入7ml新配置的含有GM-CSF（10 ng/ml）和5?S的RPMI-1640培养基（注意加培养基是枪头贴着培养皿侧壁，缓慢加入，不要扰动下层细胞）。 （14）6天后换液不换皿。

（15）7天后收细胞：显微镜下观察细胞可见细胞有的呈圆形，有的呈树突状。BMDC细胞是半贴壁细胞，用枪轻轻吹打细胞培养皿底部，转移至15ml离心管中。离心（4℃，1400rpm，7min），弃上清。 2.2.12.2 小鼠BMDC的体外刺激

（1）3ml左右含有GM-CSF（10 ng/ml）和5?S的RPMI-1640培养基重悬，细胞计数，调整细胞密度至2×106/mL。

（2）ALD-DNA （50ug/ml）、unALD-DNA （50ug/ml）、LPS （100 ng/ml）、CpG （10 ug/ml）、None刺激BMDC细胞。

（3） 将细胞悬液加入细胞培养板24孔板，1ml/孔，置细胞培养箱中培养24h。 （4）收取上清，ELISA检测细胞因子和dsDNA抗体

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第二章 实验材料很方法

2.2.12.3 刺激的BMDC的上清做小鼠脾细胞向Treg的分化培养

（1）上述收取的不同条件刺激的BMDC的上清100μL和100μL含10?S的RPMI-1640培养基混合，做小鼠脾细胞向Treg的分化培养。

（2）每个条件做3个复孔，一个不加、一个加anti-IL-6抗体、一个加anti- TNF-a抗体。

（3）收取细胞，流失细胞分析Treg细胞的分

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第三章 实验结果

第三章 实验结果

第一节 构建系统性红斑狼疮模型

3.1.1 dsDNA的检测

取6-8周的雌性C57小鼠10只，分为实验组和对照组，每组5只；分别用ALD-DNA和PBS免疫小鼠；在2、4、6、8、10、12、14周静脉取血，测量血清中的dsDNA的含量。结果可见，ALD-DNA免疫的小鼠较对照组PBS免疫的小鼠，血清中含有更多的dsDNA（图3.1）。

0.4OD4500.30.20.10.02C57 ALDC57 PBS***46*81214weeks post stimulate图3.1 ALD-DNA免疫小鼠血清中dsDNA抗体的含量

3.1.2 尿蛋白的检测

实验组ALD-DNA免疫的小鼠和对照组PBS免疫的小鼠，在2、4、6、8、10、12、14周取尿，检测尿蛋白的含量。结果可见ALD-DNA免疫的小鼠较对照组PBS免疫的小鼠尿蛋白的含量增多（图3.2）。

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第三章 实验结果

urine protein (mg/ml)150100500**p=0.0023C57 ALDC57 PBS

图3.2 ALD-DNA免疫小鼠尿蛋白含量

3.1.3 肾脏病理切片的检测

上述小鼠在14周的时候脱臼处死，取肾脏制作病理切片。结果可见ALD-DNA免疫的小鼠较对照组PBS免疫的小鼠肾脏损伤更严重（图3.3）。

图3.3 ALD-DNA免疫小鼠肾脏病理切片

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第三章 实验结果

第二节 IL-6敲除的小鼠不发病

3.2.1 dsDNA的检测

取6-8周雌性C57小鼠5只、IL-6敲除小鼠5只、4-8周雌性C57小鼠5只、，分别用ALD-DNA、ALD-DNA、PBS免疫小鼠；在2、4、6、8、10、12、14周静脉取血，测量血清中的dsDNA。结果可见ALD-DNA免疫的IL-6敲除小鼠血清中dsDNA，明显少于ALD-DNA免疫的C57小鼠，与PBS免疫的C57小鼠含量几乎一样（图3.4）。

0.3OD4500.20.10.0********A:C57 ALDD:C57 PBSE:IL-6KO ALD24681214weeks post stimulate图3.4 ALD-DNA免疫的IL-6敲除小鼠血清中dsDNA的含量

3.2.2 尿蛋白的检测

上述小鼠在2、4、6、8、10、12、14周取尿，检测尿蛋白的含量。结果可见ALD-DNA免疫的IL-6敲除小鼠尿蛋白的含量，少于ALD-DNA免疫的C57小鼠，高于PBS免疫的C57小鼠。我们推测IL-6敲除可以部分阻碍小鼠患系统性红斑狼疮（图3.5）。

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第三章 实验结果

urine protein (mg/ml)150100500***p=0.0003*p=0.0141*p=0.0128 C57 ALD IL-6KO ALDC57 PBS

图3.5 ALD-DNA免疫的IL-6敲除小鼠尿蛋白的含量

3.2.3 肾脏病理切片检测

上述小鼠在14周时脱臼处死，取取肾脏制作病理切片。结果可见ALD-DNA免疫的IL-6敲除小鼠较ALD-DNA免疫的C57小鼠肾脏损伤较轻，而与PBS免疫的C57小鼠类似（图3.6）。

图 3.6 ALD-DNA免疫的IL-6敲除小鼠肾脏病理切片

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第三章 实验结果

第三节 ALD-DNA对于dsDNA抗体和细胞因子产生的影响

3.3.1 体内：ALD-DNA免疫小鼠血清中dsDNA和细胞因子的检测

上述小鼠，14周后摘眼球取血，检测血清中的dsDNA抗体和IL-6, TNF-a，IL-17的含量。结果可见，ALD-DNA免疫的C57小鼠较ALD-DNA免疫的IL-6敲除小鼠和PBS免疫的C57小鼠可以产生更多的dsDNA抗体，而ALD-DNA免疫的IL-6敲除小鼠较PBS免疫的C57小鼠可以产生稍微多量的dsDNA抗体。ALD-DNA免疫的C57小鼠较PBS免疫的C57小鼠可以产生更多的IL-6。三组小鼠血清中TNF-a的含量没有明显区别。ALD-DNA免疫的IL-6敲除小鼠较PBS免疫的C57小鼠可以产生大量的IL-17（图 3.7）。

图3.7 ALD-DNA免疫小鼠血清中dsDNA抗体和细胞因子

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第三章 实验结果

3.3.2 体外：ALD-DNA刺激小鼠脾细胞上清中dsDNA和细胞因子的检测

取6-8周雌性C57小鼠脾细胞，ALD-DNA(50 μg/ml)、unALD-DNA(50 μg/ml)、none刺激6天后收集上清，检测上清中dsDNA抗体和IL-6, TNF-a，IL-17的含量。结果可见，ALD-DNA可以刺激脾细胞产生更多的dsDNA和IL-6, TNF-a和稍微多量的IL-17（图 3.8）。

图3.8 ALD-DNA刺激小鼠脾细胞上清中的dsDNA抗体和细胞因子

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