毕福钧,RRLC法与HPLC法在红参和西洋参人参皂苷含量测定中的分析比较,药物分析杂志,2010p

红参和西洋参人参皂苷含量测定中的分析比较

RRLC法与HPLC法在红参和西洋参人参皂苷含量测定中的分析比较

毕福钧,钟顺好,顾利红

1

2

1*

(1.广州市药品检验所,广州510160;2.天祥(广州)技术服务有限公司,广州510730)

摘要 目的:应用超高速液相色谱(RRLC)法、常规高效液相色谱(HPLC)法和MerckC18整体柱HPLC法测定红参、西洋参中人参皂苷Rg1、Re和Rb1含量的分析比较。方法:分别采用AgilentZorbaxEclipseXDB-C18(50mm 4 6mm,1 8 m)色谱柱、DiamonsilC18(200mm 4 6mm,5 m)色谱柱和MerckC18(100mm 4 6mm,2 m)整体柱,以乙腈-水(红参)和乙腈-0 1%磷酸溶液(西洋参)为流动相,梯度洗脱,流速1 0mL min-1,检测波长203nm,以外标法进行定量。结果:RRLC法和MerckC18整体柱的应用与常规C18柱的HPLC法相比,对红参、西洋参中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的含量测定结果差异不大,但可显著缩短分析检验时间。结论:RRLC法和MerckC18整体柱HPLC法简便快捷,分离度好,结果准确,重复性好。关键词:超高速液相色谱;高效液相色谱;人参皂苷Rg1;人参皂苷Re;人参皂苷Rb1;红参;西洋参中图分类号:R917

文献标识码:A

文章编号:0254-1793(2010)09-1720-05

ComparisonbetweenRRLCandHPLCfordeterminationof

ginsenosideRg1,ReandRb1inRadixetRhizomaGinsengRubra

andRadixPanacisQuinuefolii

BIFu-jun,ZHONGShun-hao,GULi-hong

1

2

1*

(1.GuangzhouInstituteforDrugContro,lGuangzhou510160,China;2.IntertekTestingServices,Guangzhou510730,China)

Abstract Objective:Tocomparearapidresolutionliquidchromatography(RRLC)andtwoHPLCmethodsfordeterminingthecompoundsginsenosideRg1,ReandRb1inRadixetRhizomaGinsengRubraandRadix

PanacisQuinuefoli.iMethods:TheseparationwasperformedonAgilentZorbaxEclipseXDB-C18(50mm 4 6mm,1 8 m)column,DiamonsilC18(200mm 4 6mm,5 m)columnandMerckmonolithicC18col umn(100mm 4 6mm,2 m)bygradientelution.Themobilephaseconsistedofacetonitrile-waterforRa dixetRhizomaGinsengRubraoracetonitrile-0 1%phosphoricacidforRadixPanacisQuinuefoli.iTheflow

-1

ratewas1 0mL minwithdetectionwavelength203nm.Results:ThecontentsofRg1,ReandRb1deter minedbythedevelopedmethodsshowednodifferences,buttheanalysistimewasgreatlyshortened.Conclu sion:ThedevelopedRRLCandHPLCwithMerckC18columnmethodsarerapid,accurateandreproducibleforqualitycontrolofRadixetRhizomaGinsengRubraandRadixPanacisQuinuefoli.i

Keywords:RRLC;HPLC;ginsenosideRg1;ginsenosideRe;ginsenosideRb1;RadixetRhizomaGinsengRubra;RadixPanacisQuinuefolii

红参(RadixetRhizomaGinsengRubra)为五加科植物人参PanaxginsengC.A.Mey.的栽培品经蒸制后的干燥根及根茎,具有大补元气、复脉固脱、益气摄血的作用;西洋参(RadixPanacisQuinuefolii)为五加科植物西洋参PanaxquinquefoliumL.的干燥根,具有补气养阴、清热生津的作用

[1]

有人参皂苷Rg1、Rc、Rd、Re和Rb1等活性成分三者作为红参和西洋参的定量指标

[1]

[2]

,

中国药典2005年版一部以人参皂苷Rg1、Re和Rb1

。然而高效

液相色谱法采用常规C18色谱柱进行含量测定时,分

析周期比较长,完成1个样品的分析通常需要2h,不仅消耗大量的溶剂,而且不利于提高分析检验的

。两者均含

*通讯作者 Te:l(020)26282368-335;E-mai:lgulh@

红参和西洋参人参皂苷含量测定中的分析比较

效率,所以建立一个快速测定人参皂苷Rg1、Re和

Rb1含量的方法,对于药品检验分析具有重要的意义。本文旨在采用MerckC18整体柱替代常规C18色谱柱的高效液相色谱法和超高速液相色谱法快速测定红参和西洋参中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的含量,并比较3种方法在系统适用性和人参皂苷含量测定结果中的差异。

1 仪器与试药

Agilent1200高效液相色谱仪和Agilent1200SL超高速液相色谱仪(美国安捷伦公司)。

人参皂苷Rg1(批号110703-200424)、人参皂苷Re(批号110754-200320)和人参皂苷Rb1(批号110704-200318)均由中国药品生物制品检定所提供,供含量测定用;红参和西洋参样品均为市场商品,由广州市药品检验所中药室刘柏英老师鉴定;乙腈为色谱纯,甲醇、正丁醇为分析纯,水为超纯水。2 红参中人参皂苷Rg1、Re和Rb1含量测定2 1 对照品溶液的制备按中国药典方法,精密称取对照品人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1适量,加甲醇制成每1mL分别含0 5mg、0 3mg、0 5mg的混合溶液,摇匀,即得。2 2 供试品溶液的制备

按中国药典方法

[1][1]

相为乙腈(A)-水(B),梯度洗脱(0~9min,19%

A;9~12min,19%A 29%A;12~13min,29%A;13~20min,29%A 40%A),流速1 0mL min,检测波长203nm,柱温25#,进样量2 5 L。2 5 系统适用性试验在上述3种色谱条件下,理论板数按人参皂苷Rg1峰计,均不低于6000,人参皂苷Rg1与人参皂苷Re以及人参皂苷Rb1与相邻组分色谱峰均达到完全分离,分离度大于1 5。表明3根色谱柱在上述各自的色谱条件下均可用于红参中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的含量测定,结果见图1、表1。2 6 重复性试验

精密称取同一批(0807)样品6份,

每份约1g,照 2 2%项下方法制备供试品溶液,按 2 3%项下条件二进样测定。结果人参皂苷Rg1+Re的平均含量为0 58%,RSD=2 8%;人参皂苷Rb1的平均含量为0 61%,RSD=2 0%。按 2 4%项下条件测定,人参皂苷Rg1+Re的平均含量为0 56%,RSD=2 3%;人参皂苷Rb1的平均含量为0 62%,RSD=2 5%。结果表明2种色谱条件下的重复性良好。2 7 样品含量测定按 2 2%项下方法制备供试品溶液,分别按 2 3%、 2 4%项下色谱条件进样测定,以外标法计算红参样品中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1含量,结果见表2。表明3根色谱柱在上述各自的色谱条件下测得红参中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的含量结果差异很小,但MerckC18(100mm 4 6mm,2 m)整体柱和AgilentZorbaxEclipseXDB-C18(50mm 4 6mm,1 8 m)色谱柱的分析时间较常规液相色谱柱明显缩短。3 西洋参中人参皂苷Rg1、Re和Rb1含量3 1 对照品溶液的制备 按中国药典方法,精密称取对照品人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1适量,加甲醇制成每1mL含人参皂苷Rg10 1mg、人参皂苷Re0 4mg、人参皂苷Rb11mg的溶液,即得。3 2 供试品溶液的制备 按中国药典方法

[1][1]

-1

,取

本品粉末(过4号筛)约1g,精密称定,置索氏提取器中,加三氯甲烷约100mL,加热回流3h,弃去三

氯甲烷液,药渣挥干溶剂,连同滤纸筒移入具塞锥形瓶中,精密加入水饱和正丁醇50mL,密塞,放置过夜,超声(250W,40kHz)处理30min,滤过,弃去初滤液,精密量取续滤液25mL,置蒸发皿中蒸干,残渣加甲醇溶解并转移至5mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2 3 HPLC色谱条件条件一:采用DiamonsilC18(200mm 4 6mm,5 m)色谱柱,流动相为乙腈(A)-水(B)

[1]

,梯度洗脱(0~35min,19%A;35~

55min,19%A 29%A;55~70min,29%A;70~

[1]-1

100min,29%A 40%A),流速1 0mL min,检测波长203nm,柱温30#,进样量10 L。条件二:采用MerckC18(100mm 4 6mm,2 m)整体柱,流动相为乙腈(A)-水(B),梯度洗脱(0~6min,16%A;6~8min,16%A 19%A;8~16min,19%A;16~20min,19%A 29%A;20~25min,29%A;25~30min,29%A 40%A),流速1 0mL min,检测波长203nm,柱温25#,进样量10 L。2 4 RRLC色谱条件

采用AgilentZorbaxEclipse

XDB-C18(50mm 4 6mm,1 8 m)色谱柱,流动

-1

[1]

,取

本品粉末(过3号筛)约1g,精密称定,置锥形瓶中,精密加入水饱和的正丁醇50mL,称定重量,置

水浴中加热回流提取1 5h,放冷,再称定重量,用水饱和正丁醇补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液25mL,置蒸发皿中,蒸干,残渣加50%甲醇适量使溶解,并转移至10mL量瓶中,加50%甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

3 3 HPLC色谱条件 条件一:采用DiamonsilC18(200mm 4 6mm,5 m)色谱柱,流动相为乙腈

[1]

(A)-0 1%磷酸溶液(B),梯度洗脱(0~44min,

红参和西洋参人参皂苷含量测定中的分析比较

图1 对照品(A、C、E)和红参样品(B、D、F)图谱Fig1

Chromatogramsofreferencesubstances(A,C,E)andRadixetRhizomaGinsengRubrasample(B,D,F)

A、B.HPLC(DiamonsilC18) C、D.HPLC(MerckC18) E、F.RRLC(AgilentZorbaxEclipseXDB-C18)1.人参皂苷Rg1(ginsenosideRg1) 2.人参皂苷Re(ginsenosideRe) 3.人参皂苷Rb1(ginsenosideRb1)

表1 系统适用性比较

Tab1 Comparisonofsystemsuitability

tR/min

方法(method)

色谱柱(column)

人参皂苷Rg1(ginsenosideRg1)

HPLC

DiamonsilC18MerckC18

RRLC

AgilentZorbaxEclipseXDB-C18

47 114 97 5

人参皂苷Re(ginsenosideRe)

48 115 98 0

人参皂苷Rb1(ginsenosideRb1)

79 926 215 7

分离度(resolution)

人参皂苷Rg1与人参皂苷Re(ginsenosideRg1andginsenosideRe)

1 551 571 86

人参皂苷Rb1与相邻组分(ginsenosideRb1andclosetogethercomponent)

1 811 592 07

理论板数(按人参皂苷Rg1峰计)(numberofthetheoreticalplate,calculatedwithreferencetothepeakofginsenosideRg1)

72214100469988

表2 红参样品含量测定结果

Tab2 DeterminationresultofRadixetRhizomaGinsengRubrasamples

含量(content)/%

方法(method)

Rg1+Re

LotNo.0806

HPLC

DiamonsilC18MerckC18

RRLC

AgilentZorbaxEclipse

XDB-C18

0 410 410 41

LotNo.0807

0 590 580 56

LotNo.0806

0 450 440 46

Rb1

LotNo.0807

0 570 610 62

分析时间(analysistime)

/min1203125

溶剂用量(volumeofsolventconsumption)/mL

1203125

19%A 20%A;44~60min,20%A 40%A;60~90min,40%A 55%A;90~100min,55%A 60%A),流

速1 0mL min,检测波长203nm,柱温40#

-1[1][1]

,

进样量10 L。条件二:采用MerckC18(100mm

红参和西洋参人参皂苷含量测定中的分析比较

4 6mm,2 m)整体柱,流动相为乙腈(A)-0 1%磷酸

溶液(B),梯度洗脱(0~4min,16%A 19%A;4~15min,19%A 20%A;15~17min,20%A 29%A;17~28min,29%A 40%A;28~29min,40%A 55%A;29~31

-1

min,55%A 60%A);流速:1 0mL min;柱温:25#;检测波长:203nm;进样量:10 L。3 4 RRLC色谱条件

采用AgilentZorbaxEclipse

XDB-C18(50mm 4 6mm,1 8 m)色谱柱,流动相为乙腈(A)-0 1%磷酸溶液(B),梯度洗脱(0~7 5min,19%A 20%A;7 5~8min,20%A 26%A;8~

12min,26%A 38%A;12~17min,38%A 60%A;

17~19min,60%A;19~19 5min,60%A 19%A;19 5~22min,19%A),流速1 0mL min;柱温:25#;检测波长:203nm;进样量:2 5 L。

3 5 系统适用性试验 在上述3个色谱条件下,理论板数按人参皂苷Rg1计,均不低于5000,人参皂苷Rg1与人参皂苷Re,以及人参皂苷Rb1与相邻组分色谱峰均达到完全分离,分离度大于1 5。表明3根色谱柱在上述各自的色谱条件下均可用于西洋参中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的含量测定,结果见图2、表3

。

-1

图2 对照品(A、B、D、E、G、H)及西洋参样品(C、F、I)色谱图Fig2

Chromatogramsofreferencesubstances(A,B,D,E,G,H)andRadixPanacisQuinuefoliisample(C,F,I)

A、B、C.HPLC(DiamonsilC18) D、E、F.HPLC(MerckC18) G、H、I.RRLC(AgilentZorbaxEclipseXDB-C18)1.人参皂苷Rg1(ginsenosideRg1) 2.人参皂苷Re(ginsenosideRe) 3.人参皂苷Rb1(ginsenosideRb1)

表3 系统适用性比较

Tab3 Comparisonofsystemsuitability

tR/min

方法(method)

色谱柱(column)

人参皂苷Rg1(ginsenosideRg1)

HPLC

DiamonsilC18MerckC18

RRLC

AgilentZorbaxEclipse

XDB-C18

49 912 96 4

人参皂苷Re(ginsenosideRe)

50 813 86 8

人参皂苷Rb1(ginsenosideRb1)

61 222 511 8

分离度(resolution)

人参皂苷Rg1与人参皂苷Re(ginsenosideRg1andginsenosideRe)

1 521 951 65

人参皂苷Rb1与相邻组分(ginsenosideRb1and

close

together

component)

1 951 762 76

理论板数(按人参皂苷Rg1峰计)(numberofthetheo reticalplate,calculatedwithreferencetothepeakofgin senosideRg1)

818671314913004

红参和西洋参人参皂苷含量测定中的分析比较

3 6 重复性试验精密称取同一批(0807)样品6

份,每份约1g,照 3 2%项下方法制备供试品溶液,按 3 3%项下条件二进样测定。结果人参皂苷Rg1、Re、Rb1的平均总含量为3 8%,RSD=0 5%;按 3 4%项下条件测定,人参皂苷Rg1、Re、Rb1的平均总含量为3 6%,RSD=0 5%,结果表明2种条件下的重复性良好。3 7 样品测定结果

按 3 2%项下方法制备供试

Tab4

方法(method)

品溶液,分别按 2 3%、 2 4%项下色谱条件进样测

定,以外标法计算红参样品中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1含量,结果见表4。表明3根色谱柱在上述各自的色谱条件下测得西洋参中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的含量结果差异很小,但MerckC18(100mm 4 6mm,2 m)整体柱和AgilentZorb axEclipseXDB-C18(50mm 4 6mm,1 8 m)色谱柱的分析时间较常规液相色谱柱明显缩短。

表4 西洋参样品含量测定结果

DeterminationresultofRadixPanacisQuinuefoliisamples

Rg1+Re+Rb1含量(content)/%

LotNo.20080302

HPLC

DiamonsilC18MerckC18

RRLC

AgilentZorbaxEclipseXDB-C18

4 64 74 4

LotNo.07114 44 44 2

LotNo.08073 83 83 6

LotNo.200807013 73 73 5

分析时间(analysistime)/min

1203522

溶剂用量(volumeofsolventconsumption)/mL

1203522

44 1

讨论

中国药典2005年版一部附录高效液相色谱

[1]

4 3

:除固定相种类、流动相组成、检测

中国药典2005年版一部采用常规液相色

谱和色谱柱来测定红参和西洋参中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的含量,分析时间偏长。而采用MerckC18整体柱高效液相色谱法和超高速液相色谱法可以快速测定人参皂苷Rg1、Re和Rb1的含量,测定结果与常规液相色谱法差异不大,但分析时间缩短3~5倍,溶剂消耗量也相应减少3~5倍,不仅大大降低实验成本,而且有利于提高分析检验的效率。

参考文献

1 ChP(中国药典).2005.Vol&(一部):105,87,附录332

XIEPei-shan(谢培山).ChromatographicFingerprintofChineseMedicine(中药色谱指纹图谱).Beijing(北京).People sMedicalPublishingHouse(人民卫生出版社),2005.3683

ANRong(安蓉),BOMei-ping(薄美萍).Ultra-performanceliq uidchromatographycoupledwithmassspectrumdetectortechnol opy:!Dramaticallyimprovethequalityofresultonresiduesandtheirmetabolitiesanalysisinfoodandagro-products[超高效液相色谱(UPLCTM)与质谱联用技术:!改善药残和代谢物分析的结果质量].ModSciInstr(现代科学仪器),2006,16(1):20

(本文于2009年12月10日收到)

法项下规定

器类型不得改变外,其余如色谱柱内径、长度、固

定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组成比例,梯度洗脱程序中的时间长度、柱温、进样量、检测器的灵敏度等,均可适当改变,使具体的色谱条件符合系统适用性试验的要求。因此,超高速液相色谱法、MerckC18整体柱替代常规C18色谱柱的高效液相色谱法和常规高效液相色谱法测定红参和西洋参中人参皂苷含量所采用的分析方法均是在中国药典2005年版一部各自品种项下方法的基础上改进的。4 2

MerckC18整体柱是采用完全不含金属杂质的合成硅胶材料和新型的溶液胶技术制备得到的,是一种高度多孔的整体化硅棒,具有孔度高,渗透性好,柱压低及传质速度快的优点,适合于复杂样品的快速色谱分析。超高速液相色谱是用细粒径填料(sub-2 m)、细内径柱子获得柱效高达10万~30万的液相色谱技术。其具有超快速、超高分离度和灵敏度等优点,可以极大地缩短分析时间以及提高分析的质量

[3]

。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/qfsm.html