各种DNA提取方法

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一，基因组DNA提取方法

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等

试验步骤： 1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。 2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。 3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl0.1mol/LEDTAo.5%SDS)混匀。 4、加入25ul 蛋白酶K使终浓度达到100ug/ml 混匀，50℃水浴3h 5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相 6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL混匀，冰浴，10min.。 7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。2500rpm离心10min。弃上清。 8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。 9、12000r/min室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。

二，外周血DNA提取技术

分离外周血白细胞提取方法： 试验步骤： 1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。 2、小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml 离心管中。 3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。 4、2500rpm离心10min，弃上清。 5、加入10ml 溶血液，摇匀，冰浴15min。 6、3000rpm离心10min，弃上清。 7、倒置离心管，去掉残液。 8、得白细胞，－80℃冻存。 试验要求： 血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶。

三，氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA：

试验试剂：Ligsisbuffer： 133mM NH4Cl NHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml；最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。ACD抗凝剂：__________柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄

糖5.15g；最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。 提取缓冲液（Extractionbuffer）：10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最后灭去离子水至100ml， 高压灭菌 试验步骤： 1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。 2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。 3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h。 4、加入8μl 的蛋白酶K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。 5、每管加入450μl 饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。 6、取上清，每管加入250μl 饱和酚和250μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。 7、取上清，每管加入500μl 氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。 8、取上清，每管加50μl 的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。 9、以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。 10、加入50μl 灭菌去离子水，转弹，混匀。

四，NaI提取法提取外周血白细胞基因组：

实验步骤： 1、取外周抗凝血（全血）100ul 于eppendorf管中，12000rpm离心12min。 2、弃上清，加双蒸水200ul 溶解，摇匀20s。 3、混匀后加6MNaI溶液200ul，摇匀20s。 4、加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。 5、取上层液350ul，加入另一新eppendorf管中，加0.6倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm离心12min，使沉淀紧贴eppendorf管壁。 6、弃异丙醇，加70％乙醇1ml（不振动），以15000rpm离心12min。 7、弃乙醇，敞开eppendorf管盖，烘干（37℃恒温箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

五，常用的外周血白细胞基因提取方法：

试验原理： 苯酚/氯仿提取DNA是利用岘_Q______酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA 从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，

蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl 存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。

试验步骤： 1、将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml 离心管中，加入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500rpm离心15min倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用0.7mlDNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h。 2、将上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后，加入1mg/ml 蛋白酶K0.2ml 至终浓度为100-200ug/ml 上下转动混匀，液体变粘稠。50℃水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。 3、反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿﹕异戊醇（24﹕1），上下转动混匀，5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。 4、加入1/5体积的3mol/LNaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一1.5ml 离心管中，加70%乙醇0.2ml，以5000rpm离心5min。洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul 溶解DNA置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

六，真核细胞DNA的制备

一般真核细胞基因组DNA 有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则： 1、防止和抑制DNase对DNA的降解。 2、尽量减少对溶液中

DNA

的机械剪切破坏。试剂准备： 1、

。

2

、

TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0)

TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl。 3、裂解缓冲液：250mMSDS;使用前加

入蛋白酶K至100mg/ml。 4、20%SDS 5、2mg/ml 蛋白酶K 6、Tris饱和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿 7、无水乙醇、75%乙醇 试验步骤： 材料处理： 1、新鲜或冰冻组织处理： 1)取组织块0.3-0.5cm3剪碎，加TE0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。 2)将匀浆液转移到1.5ml 离心管中。 3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混匀。 4)60 C水浴1-3hr。 2、培养细胞处理：1)将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。 2)离心4000g 5min，去除上清液。 3)加10倍体积的裂解缓冲液。 4)50-55 C水浴1-2hr。 DNA提取： 1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。 2、离心5000g 10min，取上层水相到另一1.5ml 离心管中。 3、加等体积饱和酚，混匀，离心5000g 10min，取上层水相到另一管中。 4、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g 10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。 5、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g 10min，取上层水相到另一管中。 6、加1/10体积的3M醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。 7、待絮状物出现后，离心5000g 5min，弃上清液。 8、沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g 3min，弃上清液。 9、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜。

七，细菌DNA的提取方法

针对一些不易于提取的细菌的方法: 试验试剂： 抽提缓冲液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)

（

去

色

素

）

100mMTris-HCl(pH8.0)

25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl 10MliCl 2MliCl DEPC-water（抑制RNA酶活性） 3MNaAc(pH5.2) 96%乙醇 70%乙醇 试验步骤： 1、抽提缓冲液65℃预热__________。 2、加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min。 3、加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，以12000rpm，离心10min。 4、取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，以12000rpm，离心10min。 5、重复再作一次步骤4。 6、加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－20C下沉淀。 7、以2000rpm，离心10min。 8、弃上清，以70％乙醇条洗沉淀，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml 水中。

十，较为常用的细菌DNA提取方法：

实验步骤： 1、将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。 2、取1.5ml 培养物12000rpm离心2min。 3、沉淀中加入567ul 的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，

加入30ul10%SDS和15ul 的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h. 4、加入100ul5mol/LNaCl 充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl 溶液，混匀后再65℃温育10min。 5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。 6、沉淀用1ml 的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇．

十一，真菌DNA提取总结的两种方法：

第一种方法： 试验步骤： 1、取真菌菌丝0.5g在液氮中迅速研磨成粉。 2、加入4mL提取液，快速振荡混匀。 3、加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚）。 4、以4℃，1000rpm，离心5min。 5、上清再用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。以4℃，10000rpm，离心5min。 6、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷的异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀混匀静置约30min。 7、用毛细玻棒挑出絮状沉淀用75%乙醇反复漂洗数次再用无水乙醇漂洗1次吹干，重悬于500ulTE中。 8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃下处理1h。 9、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10000rpm，离心5min。 10、取上清，加入1/10倍体积的3MNaAc2.5 倍体积的无水乙醇-70℃沉淀30min以上。 11、沉淀用75%乙醇漂洗，风干溶于200ulTE中，-20℃保存备用。DNA提取液：0.2MTris-HCl（pH7.5），0.5MNaCl，0.01MEDTA，1％SDS， 3MNaAc。 第二种方法： 试验步骤： 1、真菌菌丝0.5-1g在液氮中迅速研磨成粉。 2、加入3mL65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30min期间混匀2-3次。 3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。 4、等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10000rpm，4℃离心5min）。 5、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇混匀静置约30min。 6、用毛细玻棒挑出絮状沉淀用75%乙醇反复漂洗数次再用无水乙醇漂洗1次吹干，重悬于500ulTE中。 7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃处理1h。 8、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10000rpm，离心5min。 9、取上清，1/10V3MNaAc2.5V体积的无水乙醇-70℃沉淀30min以上。 10、沉淀用75%乙醇漂洗，风干溶于200ulTE中，-20℃保存备用。

十二，石蜡包埋DNA提取试验方法

试验原理： 从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而业。Goelz 等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术，是用机械

的方法破碎组织，切除多余的石蜡，进入含SDS和高浓度蛋白酶K（１mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分了生物学实验。Dubeau 等（1986）在上述方法上作了改进。首先通过组织切片和二甲苯和脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA小段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA分子，从而提DNA质量，适于做Sorthern印迹杂交分析。 试验试剂： 配方：3mol/lNacl，0.3M柠檬酸三钠 2H2O，用HCL调PH值至7。0石蜡消化液：150nmol/lNacL：15mmol/l 柠檬酸钠，1%SDS，PH7.0。 试验步骤：1、取蜡块切片15-20张（8μm），置于eppendorf管中，加入1ml 的二甲苯，37℃作用3h，以10000rpm，离心3min，倾去二甲苯。重复3-4次，观察管壁是否光滑。如果仍有蜡质残存，需继续脱蜡。 2、剃度酒精水化：加入100%乙醇1ml，室温下放置30min，以10000rpm离心3min，去上清；再依次分别加入95%；75%；50%的乙醇重复上面的步骤。

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