MTT法活性筛选步骤

MTT法活性筛选步骤

材料 试剂：

二甲亚砜（DMSO）分析纯 灭菌PBS, pH 7.4

MTT储存液（5mg/mL）：配制于灭菌PBS，-20摄氏度保存 工作液MTT：储存液用灭菌PBS稀释5倍使用。

MTT法筛选步骤 一、接种细胞

1. 将培养在100mm培养皿的对数生长期细胞去掉培养基，用5ml灭菌PBS洗涤一次 2. 去掉PBS，用胰酶消化制成单细胞悬液

3. 用血球计数板计数细胞悬液浓度，根据需要接种细胞量，吸取相应体积细胞悬液，用

培养液稀释至相应体积，混匀，使细胞浓度为5×104/ml.

4. 向96孔细胞培养板中每孔加入100ul细胞稀释悬液，空白组加入等量培养液，未加细

胞悬液的孔加入等量PBS缓冲液。 5. 培养板放入37℃，5% CO2培养箱中培养24h。

接种前的细胞必须状态良好，且不能太密集。否则不能接种。

接种时要不时摇晃细胞悬液，保证接种密度均匀。接种密度不均匀是造成误差的主要原因。

二、药物准备、药物处理

实验前开紫外照射细胞间、超净台及配药用离心管。 1. 待测样品用DMSO配成浓度为50mg/ml母液。

2. 用培养液将配好的50mg/ml母液稀释至100ug/ml，再用100ug/ml药物稀释成不同浓

度（药物浓度梯度为0，6.25，12.5，25，50，75，100μg/ml）。 3. 细胞培养24h后将平板中培养液吸去。

4. 将各浓度药物混匀，加入到对应各个孔中，每孔加200ul。每个浓度设置4个平行孔。

加药时不可直接打到孔底，应沿着孔壁加入。 5. 将平板放入37℃，5% CO2培养箱中温育3d。 三、加MTT，

实验前开紫外照射细胞间、超净台 1. 吸去平板孔中培养液，包括空白组 2. 加入100ul 1mg/ml的MTT于每孔中。 3. 放入37℃，5% CO2培养箱中孵育4~8小时。孵育时间不得少于4小时，也不能大于8

小时。 四、OD值测定

1. 酶标仪开机预热15min。 2. 小心吸去平板孔中MTT。 3. 每孔加入150ul DMSO。 4. 振荡器上振荡10min。 5. 492nm波长下测吸光值。 6. 用SPSS计算IC50值

细胞增殖抑制率计算公式：

抑制率=[(Acontrol-Atest)/Acontrol]×100%。

所有的吸光度值都必须减去空白组的吸光度值。 附：细胞及药物浓度分布图 初筛

B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 C白色：PBS；蓝色：培养液；其他颜色：细胞

B：空白；C：对照，橙色为阳性对照（CDDP5ug/ml），黑色为阴性对照。1-9：待测样品。

IC50测定

B 0 6.25 12.5 25 50 75 100 +白色：PBS；蓝色：培养液；红色：细胞； B：空白；+：阳性对照（CDDP 5ug/ml）

25ug/ml50ug/ml AB

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