EPC-10膜片钳放大器的使用

EPC 10膜片钳放大器的使用

EPC 10膜片钳放大器的使用

一、概述

德国HEKA公司生产的EPC（Extracellular patch clamp）系列放大器的早期型号为EPC 5，这是世界上最早的膜片钳放大器。此后陆续升级为EPC 7、EPC 8、EPC 9和EPC 10，EPC 9和EPC 10为全电脑控制的膜片钳放大器。目前EPC放大器的最高版本为EPC 10膜片钳放大器（截至到2011年7月），有EPC 10 USB和EPC 10 Plus两大类机型。本文讲解EPC 10 USB的使用。

EPC 10 USB膜片钳放大器主要有如下应用：

? 单通道记录：可记录亚pA级的单离子通道电流。

? 低噪声全细胞膜片钳记录、电压钳/电流钳/低频电压钳（LFVC）记录：可记录全细胞膜各种离子

通道电流、细胞动作电位等。

? 传统细胞内记录：可记录动作电位、细胞放电等。

? 使用金属电极的场电位记录：如整体动物与脑片的诱发场电位记录。

? 突触长时程增强(LTP)/长时程抑制(LTD)记录：整体动物与脑片的LTP/LTD记录。

? 松散封接记录、人工脂膜离子通道、纳米孔等的记录：放大器探头有足够的大电流测量能力，最

大可测量2 μA的电流。

? 离子选择性测量：采用离子选择性电极检测溶液中某一离子浓度。 ? 电化学检测（伏安法/安培测量法）：如采用碳纤电极的细胞或膜片安培测量法，检测细胞某些物质

的释放。

? 细胞胞吞/胞吐或突触递质释放的研究：采用膜电容测定法，可测量因细胞胞吞、胞吐或突触递质

释放所引起的全细胞膜电容的微小变化。

EPC 10膜片钳放大器具有如下显著特点：

? 仪器面板的各个功能钮/键均为计算机控制，所有操作均在程序面板中通过鼠标与键盘进行。 ? 面板程序可在PC机（Windows 2000\\XP\\Vista操作系统）和苹果机（Mac OS 10.4 及以上版本操作

系统）上运行。

? 放大器本底噪声小于90 fA。

? 探头有三种反馈电阻，可测量的最大电流分别为200 pA (50 GΩ)、20 nA (500 MΩ)、2 μA (5 MΩ)，

测量范围满足绝大多数电生理实验信号的要求。

? 电极电容（快电容）和膜电容（慢电容）补偿可自动进行。

? 液接电位实现了自动校正，无需其他常见膜片钳放大器的手工计算与校正。

? 具有Lock-in放大器功能，可对膜电容微小变化进行精确检测，用于与膜面积有关的细胞分泌等的

研究。

? 通过软件扩展功能，可进行离子浓度荧光检测，实现光电联合检测。

EPC 10 USB主要具有如下四种机型：

1) EPC 10 USB：含有一个探头，为一台膜片钳放大器。

2) EPC 10 USB Double：含有两个探头，为两台组合在一起的EPC 10放大器。 3) EPC 10 USB Triple：含有三个探头，为三台组合在一起的EPC 10放大器。 4) EPC 10 USB Quadro：含有四个探头，为四台组合在一起的EPC 10放大器。

上述任何一种机型在机箱内都包含一个LIH 8+8 AD/DA转换器，提供4个DA输出通路，满足每个放大器同时输出刺激的需要；同时提供8个独立的AD通路，满足独立的放大器对电流、电压信号的输入。

对于含有多个放大器的EPC 10 USB机型，可通过放大器软件面板选择某一放大器，使其激活。被激活

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EPC 10膜片钳放大器的使用

的放大器可接受软件设置的命令，并在放大器面板上通过Digital Bus绿灯显示，当有软件命令输出给放大器时，Digital Bus灯会闪烁。未被激活的放大器不能接受命令信号，但只要选择上，仍然可随时被激活。

以下介绍的是EPC 10 USB。

二、探头

（一）探头特点

（1）EPC 10的探头呈狭窄长条形，体积较小，这样设计的目的是为了在有限的显微镜工作距离下，便于记录电极的操作。

（2）探头表面有探头的序列号，如果是Double机及以上机型，探头表面还有“Probe 2”等字样。

（3）底部有能固定在微操纵器上的塑料底座适配器，可与绝大多数类型的微操纵器直接进行匹配。在购置某些微操纵器时，要注意选择与探头匹配的适配器。

（4）探头内部有一个电流-电压转换器（Current-to-voltage converter），即摄入电流，输出电压。这与一般的微电极放大器探头不同，后者摄入和输出的均为电压。

（5）探头具有5 MΩ、500 MΩ和50 GΩ三种反馈电阻，分别用于记录双分子层膜、松散封接模式、大细胞等的大电流（～2 μA），一般的全细胞电流（～20 nA）和单通道电流（～200 pA）。

（二）探头连线

（1） 信号输入端口：用聚四氟乙烯（Teflon，白色）绝缘的BNC插口，与电极夹持器（Holder）直接连接。

（2）地线连接口（GND）：为黑色插孔，承载高质量接地信号，用于将浴池（参比）电极接地，也可用于将探头附近的物体（如显微镜）、屏蔽设施等接地。该接地口通过探头电缆线与放大器前面板上的信号地（Signal GND）相连通。

（三）探头使用注意事项

? 在放大器开启的情况下，应尽量避免用手直接触碰信号输入端口，否则可能由于手上带有静电而损伤探头内部电路！在更换玻璃电极时，若一定要触碰信号输入端口，请一定先除去手上的静电（通过触摸其他金属物体，如屏蔽网等），再触碰信号输入端口。

? 若由于探头损坏而更换探头，则需要在连接新探头后对放大器进行校正，方法为：开启EPC 10，预热30 min后，放大器与探头均处于正常工作的温度。打开Patchmaster软件的EPC 10_USB菜单，选择Test and Calibrate条目，即可对EPC 10放大器进行全方位校正。校正的内容包括放大器软件面板上所有的数码开关和控制按钮，这些结果仅是针对正在被校正的放大器的，不适用于其他EPC 10放大器。校正的结果可存储为Scale.epc文件。该校正应该每隔半年进行一次，如果发现放大器的频响不准确或者偏移比较明显时，应随时进行校正。校正过程耗时5-10 min，依计算机的速度而异。放大器校正后，再用Re-Initialize EPC10_USB功能对放大器进行初始化。

三、电极夹持器

为了获得低噪声记录，电极夹持器必须直接插入探头中。不推荐将电极夹持器屏蔽的做法，因这样可引入更多的随机噪声（背景噪声可增加1-2倍），这些随机噪声来自夹持器塑料材质（聚碳酸酯）的非理想化绝缘特性和液体水膜上的热电压波动。金属的屏蔽物质可使更多的噪声通过电容耦合方式进入放大器探头，尤其是单通道记录更不能屏蔽夹持器。聚碳酸酯具有低介电损失性，若自己制作电极夹持器，要考虑采用低介电损失的材料，表面要具有疏水性，以防液膜的形成。聚碳酸酯是目前发现的符合上述特点的最佳材料。

使用电极夹持器时，将银丝（长度一般在4.5 cm）焊接在铜针上，后者插入探头BNC插口内。银丝表面需要镀上AgCl，可用含Cl离子的溶液（如100 mM KCl溶液或生理盐溶液）电镀（与铜针焊接处部位的

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银丝不要电镀）。

电极夹持器的噪声测定：将含有银丝电极的夹持器插入探头，探头用锡箔纸包裹，采用放大器的Noise Test功能测量噪声。良好的夹持器应该只增加噪声10%左右，例如从95到105 fA。

四、模型细胞

一般的膜片钳放大器均配备模型细胞，它的用途有如下两个：

（1）用于模拟真实细胞的膜反应，帮助初始者演练放大器各项功能的使用；

（2）用于检测放大器的功能是否正常，如果用模型细胞检测放大器时没有问题，则表明放大器功能是正常的。

与EPC 10放大器配备的是MC 10模型细胞，它通过BNC适配器与探头信号输入接口连接，通过另一根细线与探头GND接地口连接。其上有三个位置，通过扳手来选择：

? 10 M位置：模拟电极入浴液，电极电阻为10 MΩ。可模拟进行施加测试脉冲和补偿失调电位（如液

接电位等）。

? 中间的位置：模拟电极与细胞膜形成高阻封接，电极电容（及其他漂浮电容）为6 pF。可模拟进行

电极电容（C-fast）的补偿功能。

? 0.5G 位置：模拟形成了全细胞记录模式，串联电阻为5.1 MΩ，膜阻抗为500 MΩ（0.5 GΩ），膜电容

为～22 pF。可模拟进行膜电容（C-slow）的补偿功能和电流钳模式，还可用于检测软件Patchmaster编辑输出的刺激脉冲。

五、仪器面板 （一）前面板

1. Power Switch 电源开关。为让放大器能正确地初始化，一般是要先开启放大器电源开关，再打开采样软件（Patchmaster或TIDA）。当然，在忘记先开启放大器时，也可通过采样软件重新对放大器进行初始化。注意，在开始实验前，放大器需要预热至少15分钟。

2. Probe

用于连接探头。

3. Chassis Gnd (CHAS)

EPC 10 放大器的机壳地。与大多数仪器一样，该机壳地与电源地相连通。为避免形成地线环路，在放大器设计上，信号地与机壳地之间不直接连通，而是中间连接了一个10 Ω的电阻。

4. External Stim. Input CC

外部来源的电压刺激信号从这里输入，放大器会根据需要设定的比例转化为刺激电流， 可与放大器内部的电流刺激信号叠加，用于电流钳模式。

5. External Stim. Input VC

外部来源的电压刺激信号从这里输入，它们可与放大器内部的电压刺激信号叠加，用于电压钳模式。叠加的刺激信号通过2极滤波器滤波，以去除电压变化初始与结束时产生的跃迁，这避免了刺激命令处理电路出现非线性特性，同时也降低了电极电容快速充电时产生的电流瞬变值幅度。软件提供两个滤波等级（用10-90%瞬变值幅度上升时间表示）：2 μs（是防止放大器内部电路出现非线性化所需的最小上升时间）和20 μs（最适合于那些除了最快速测量以外的所有测量，用于降低电容瞬变值幅度）。

6. Voltage Monitor

将电极上的电压输出给监视系统（如示波器），该电压是将输出给电极的电压放大了10倍。该输出的阻抗为50 Ω。在Patchmaster的示波窗口中可显示原始的未被放大的信号。

7. Current Monitor

输出电极电流，该信号经过了在放大器软件面板中所设置的滤波器滤波。正电压与从电极输出的电流

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相对应。通常，左手边的输出（Filter 1）是经过放大器软件面板中Filter 1滤波后的输出，可输出给数据记录装置（如磁带记录仪等），用于记录宽频信号，如可记录单通道活动。右手边的输出（Filter 2）是经过放大器软件面板中Filter 2额外滤波后的输出，用于输出给示波器，监视整个实验过程（如封接、破膜等）。上述任何一种输出都可在软件Patchmaster的示波窗口中显示。

8. Signal GND

为香蕉插口，是高质量的信号地，可用做膜片钳系统中其他仪器的公共地。 9. Clipping

这是一个二极管指示灯，当放大器输入电流饱和时该指示灯亮。在电压钳实验中，电容充放电伪迹将被电脑去除，而去除过程只有在不出现饱和的情况下完成，该指示灯起到这样一个监督的作用。特别地，虽然通过滤波后输出的电压没有达到饱和，但如果滤波前输出的电压是饱和的，则该指示灯也会指示饱和！

10. Digital Bus

该指示灯显示计算机正发送数码信息到EPC 10放大器。 11. A/D Inputs

放大器内设的转换器（EPC 10采用LIH 1600，EPC 10 USB采用LIH 8+8）提供8个模拟/数码（A/D）输入通道，其中3个在仪器内部与EPC 10连接（若使用EPC 10 Double或EPC 10 Triple，则分别有5或7个与放大器在内部连接）。剩余的输入通道可提供给其他应用程序软件，如Patchmaster可利用这些通道监测从温度传感器、压力传感器或其他传感器的输出。

12. Trigger In

外部触发信号输入口。当在采样软件Patchmaster中的Pulse Generator选择Trigger Series或Trigger Sweeps时，外部触发信号通过该输入口触发放大器进行数据采集。

13. Trigger Output

TTL触发输出。有3个输出，用于使其他设备与膜片钳实验同步化. 14. D/A Outputs

提供3个数码/模拟（D/A）信号输出通道（0-2），它们携带如下信号： DA-0 - Free (C-slow during Cap. Track)

DA-1 - Free (G-series during Cap. Track) DA-2 – Free

在Patchmaster采样软件的Capacitance-Tracking模式，DA-0和DA-1接口可作为特殊用途的输出口，这可在软件中设定。如果在EPC 10放大器软件面板中执行Cap Track功能，则DA-0将输出C-slow数值，DA-1将输出G-series（=1/R-series）的数值。上述数值是以电压形式输出的，G-series的转换因子为100 nS/V，C-slow的分别是0.5、5或50 pF/V（对应于30、100和1000 pF范围的电容值）。DA-2通常用于触发示波器或隔离器。

注意：（1）当在软件面板中使用Reset时，上述输出的数值将都变为0。（2）当需要使用软件面板Cap Track功能时，不能将DA-0和DA-1用做触发信号的输出。（3）这3个接口是输出口，千万不要将刺激信号从这里输入。

（二）后面板

EPC 10 USB后面板上有2个25针的连接口、1个40针的连接口和4个通信输入器口，用于放大器与其他设备的连接。

1. USB

接计算机USB 2.0口，连接放大器软件与EPC 10 USB主机。在连接有多个EPC 10 USB放大器时，为使采集时钟同步化，需要将一个放大器的MASTER SYNC和另一个放大器的SLAVE SYNC用标准CAT5网线连接，而且该线要求越短越好。

2. DIGTAL IN

从外部设备来的TTL逻辑电路的触发信号输入口，为25针的输入口。

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3. DIGTAL OUT

TTL逻辑电路的数字信号输出口，为25针的输入口。用于输出触发信号给其他设备，如给药灌流系统。第21-23针输出的触发信号也可通过前面板的TRIGGER INPUT/OUTPUT中的OUT 0至OUT 2输出。

4. Digital IN/OUT

只用于和HEKA公司的其他设备连接，如连接EPC 8或TIB 14到EPC 10 USB放大器。为40针的输入/输出口。

5. TELEGRAPH INPUTS

4个通信输入器插口，用于将EPC10 USB放大器的滤波频率（Frequency）、所测膜电容（Cm）、增益（Gain）大小等信息输出给软件。

6. AUX DAC 辅助数模通路。 7. SOUND 声音输出口。 8. Power

电源线插口，输入电压有90-210 V和220-250 V两个交流电范围段，可自动调节。保险丝的规格是1mA。

六、软件面板 （一）主要功能

1. 单机与多机

无论单机还是多机，都共用一个LIH 8+8型AD/DA转换器。该转换器提供4个DA通道（可允许同时输出4个刺激信号）、8个AD通道（可同时摄取不同放大器的8个电压或电流信号）。当前正在激活的放大器可通过仪器前面板上的Digital Bus绿灯在闪亮判断出来。

当使用EPC 10 Double、Triple或Quadro放大器时，软件面板会显示“1. Amplifier、2. Amplifier，…”等。点击其中任何一个放大器，则将激活该放大器，显示为红色。各放大器的设置是互不影响、相互独立的。

2.Gain

电流输出的增益。数值范围为0.005- 2000 mV/pA，分为三档：0.005-0.002、0.5-20和50-2000 mV/pA，分别对应于探头5MΩ、500MΩ和50GΩ的反馈电阻，用于记录不同范围大小的电流（见下表）。当选择不同Gain数值（通过键盘上的上下箭头或拖动鼠标来选择）时，软件会自动选择相对应的探头反馈电阻的大小来通过电流。

低范围的Gain用于双层膜、松散封接膜片和大细胞的实验，在这类实验中，记录的电流比较大（可高达2 μA左右），电容补偿可达1 nF，可补偿小至10 Ω的串联电阻。中范围的Gain主要用于一般大小的细胞的全细胞记录，记录的电流范围可达20 nA，电容补偿可达1000 pF，可进行串联电阻补偿和电流钳记录模式，背景噪声比高范围Gain的噪声大，但提供100 kHz的频带宽。高范围Gain用于单通道记录，其噪声极低，但记录的最大电流大约在200 pA以内，最大频带宽约为60 kHz，但是一些在中范围Gain情况下的功能不能使用（如电容补偿最大为100pF、电流钳模式不能使用等）。

表. EPC 10 增益Gain的三个范围 Gain（mV/pA） 对应的反馈电阻大小 电压钳模式能够测量的最大电流 电流钳模式能够输出的最大电流 低范围 0.005-0.002 5 MΩ ±2 μA ±100 nA 中范围 0.5-20 500 MΩ ±20 nA ±10 nA 高范围 50-2000 50 GΩ ±200 pA --- - 5 -

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3. R-memb->R-pip

点击该钮可将R-memb的数值拷贝过来到R-pip，用于在封接前将电极电阻值储存在所采集的数据文件中。

4. CC-Gain

该功能可选择电流钳的转换系数（0.1 pA/mV、1 pA/mV和10 pA/mV），分别对应于最大命令电流1 nA、10 nA和100 nA。当通过放大器前面板External Stim. Input CC输入外部刺激命令时，需要在此选择转换系数。当CC-Gain选择1 pA/mV，External Stim. Input CC输入1 mV的命令时，将产生1 pA的命令电流。注意：gain的选择受该转换系数的限制，如CC-Gain选择1 pA/mV，电流钳模式下gain的范围只能是0.5-20 mV/pA。

5. Gentle CC-Switch

该功能用在电压钳与电流钳之间进行反复切换时。

Gentle CC-Switch选择On：为维持膜电位稳定，在切换为电流钳时，I-hold不为0 pA，而为某一数值，需要向细胞注入电流。为此，电压钳下V-mon应该与初始的V-membrane一致。同样，在返回到电压钳时，V-membrane将会在电流钳时的膜电位附近。

Gentle CC-Switch选择Off：在切换为电流钳时，I-hold将设为0 pA。 6. V-mon Gain

所测量的V-mon可以在输出到模数转换器前，被放大10或100倍。放大*100倍时，电压范围为±100 mV，分辨率为1.5 μV，特别适用于电压幅度较小的场电位记录。

7. Last V-membrane

电流钳模式下，膜电位非常容易改变，当切换到电压钳时，V-membrane常常不同于切换为电流钳模式之前的数值。Last V-membrane用于储存并恢复初始的V-membrane值。

8. Bell

点击该钮启动系统声音，用于在实施宏命令时提供反馈信息。 9. Relative value 点击该钮，则在记录宏命令时，任何值的变化都以相对变化值被记录下来，例如，如果使钳制电位从-60 mV超极化到-70 mV，则宏命令中将记录-10 mV。

10. Overlay

点击该钮，测试脉冲波形线将以叠加的方式显示在采样软件示波窗口中。 11. List State

点击该钮，将放大器设置状态的一些信息发送到Notebook窗口中，包括放大器类型（Amplifier）、记录模式（Recording Mode）、钳制电位（V-membrane）、增益（Gain）、滤波频率（Filter 2）、快电容补偿（C-fast）和慢电容补偿（C-slow）。

12. One Pulse

点击该钮一次，就输出一个测试脉冲。当Test Pulse选择off时，若仅仅需要一次测试脉冲，可选此功能。 13. I-Scale and V-Scale

用于设定测试脉冲Test Pulse在采样软件示波窗口中的显示比例（左侧框）和偏移（右侧框）。数值1将使Y轴达到AD/DA转换器的最大量程（±10.24 V），此时，如果输入信号饱和了模数转换器，便很容易发现。但是，如果要对信号进行放大，则需要在采样软件Patchmaster的Configuration窗口Misc.中选上Scale Test Pulse。

14. Sound

编码R-membrane的声音灵敏度（Hz/MΩ）和音量（%）在这里设定。点击Sound钮可执行该功能。 15. Wait

用于设定在记录宏命令时暂停的时间。点击该输入框，可将Record变为Stop，此时宏命令的记录暂停，直到经过所设定的时间或点击Stop，才可继续记录宏命令。

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七、功能检测

（一）施加测试脉冲

1. 将模型细胞与探头连接好：将模型细胞与探头的BNC口连接，将探头后端的接地口与模型细胞接地线口连接。

2. 将模型细胞电路设置为10 MΩ位置，此时模拟电极入浴液（电极电阻10MΩ）。

3. 打开Patchmaster，点击放大器软件面板的Reset（图中①所示），设置记录模式为On Cell模式（图中②所示），将Test Pulse的幅度（图中③所示）设为5 mV，时间长度（图中④所示）设为5 ms，此时在波形显示窗口将出现电流方波。如果增益Gain大小合适（即为5 mV/pA）（图中⑤所示），则窗口中将显示一个幅度约为500 pA的电流方波（根据欧姆定律，I = U/R = 5 mV/10 MΩ=500 pA）（图中⑩所示）。

4. PULSE或Patchmaster会自动计算出且随时更新电极电阻的大小，并显示在R-memb上（图中⑥所示，10 MΩ左右）。

5. 可能存在的失调电位可通过点击Vo右边的Auto（图中⑦所示）来自动完成（也可通过双击Vo，然后通过上下拖动鼠标使电流方波的基线为0和使I-mon显示为0），此时，命令电压V-membrane（图中⑧所示）应该显示为0 mV，同时Vo（图中⑨所示）显示出失调电位的大小。此外，电流方波的基线（图中⑩所示）、电压监视器V-mon（图中⑾所示）和电流监视器I-mon（图中⑿所示）都应该为0或接近0。

6. 在Patchmaster中，上述3-5步骤可通过点击面板左上的黄色SETUP钮自动实现，或通过点击键盘数字“1”自动实现，执行下列内设的宏命令： 1．SET-UP E Reset： ； （重设放大器） E Mode： 1 ； （选择On Cell记录模式） E Gain： 10 ； （设定Gain为5.0 mV/pA） E PulseAmp： 5.0 mV ； （设定测试脉冲幅度为5.0 mV） E PulseDur： 5.0 ms ； （设定测试脉冲时间宽度为5.0 ms） E PulseOn： TRUE ； （施加测试脉冲） E AutoZero： ； （补偿失调电压）

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注：PULSE软件有一个内置的宏命令注释文件，一些预设的宏命令以纯文本格式存储在“Epc10.mac”文件中，可用任何文本编辑器编辑。例如：命令“E Gain：10”，是将放大器增益Gain设定为Gain下拉选项中的第10个值（即5 mV/pA)。至于如何对这些宏命令注释进行编辑与修改，可参考PULSE软件使用说明手册。

（二）高阻封接电压钳记录

1. 切换模型细胞到中间位置，此时显示的电容为电极电容（约为6 pF），该位置模拟电极与细胞膜形成高阻封接，可模拟进行C-fast补偿功能。为从模型细胞的高电阻电路中能分辨出比较小的电流，将Gain（图中①所示）设为50 mV/pA。

2. 在图形显示窗口中将看到两个快速的电容瞬变值 (图窗口中蓝线显示) 。调节C-fast补偿功能的数值幅度（图中②所示），此时电容瞬变值变小了；同样对时间常数（τ-fast）（图中③所示）进行调节，使瞬变值变窄。持续调节补偿幅度与时间常数，直到在图形显示窗口中出现直线为止（图窗口中红线显示），此时电容值得在6 pF左右。

3. 当过度补偿时，瞬变值将发生反方向变化，此时应该降低电容补偿的数值。

4. C-fast也可通过点击AUTO（图中④所示）让放大器自动补偿。如果补偿失败，则AUTO按钮中的E区（图中⑤所示）将变为黑色。发生这种情况时，应该反复点击AUTO，直到E区恢复正常为止。

5. 在Patchmaster中，上述步骤可通过点击面板上部SETUP按钮右侧的SEAL钮自动实现，或通过点击键盘数字“2”自动实现，执行下列内设的宏命令： 2：SEAL E Gain： 14 ；（设定Gain为50 mV/pA） E AutoCFast： ；（自动进行C-fast补偿） E AutoCFast： ；（再次进行C-fast补偿） E Bell： ；（出现beep音）

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（三）全细胞电压钳记录

1. C-fast补偿完成后， 切换模型细胞到“0.5Gohm”位置，此时模拟形成了全细胞记录，膜电容约为22 pF，膜电阻为500 MΩ，输入阻抗为5.1 MΩ。可检测C-slow功能、串联电阻补偿功能以及电流钳模式。

2. 降低Gain至20 mV/pA（图中①所示），R-MEMB会显示膜电阻接近500 MΩ?（图中②所示）。在图形显示窗口中可看到两个明显的大的电容瞬变值（蓝线）。慢时间常数τ= Rs × Cm = 5.1 MΩ × 22 pF = 112 μs，电容电流瞬变峰值Imax = Cm × U/τ?= 22 pF × 5 mV / 112 μs = 982 pA。当Gain为20 mV/pA时，将产生19.6 V的电压，这个幅度超出了放大器测量的范围，Clipping指示灯将提示放大器超载，

同时EPC 10软件面板Gain位置上也会出现“Clip”提示（图中③所示）。

3. 将C-Slow的Range（图中④所示）选为100 pF，在C-slow中拖动鼠标增大补偿电容的数值（图中⑤所示）以及R-series数值（图中⑥所示）。因有2个变量需要调节，故慢电容补偿比快电容C-fast补偿要难些，但通过反复练习，可以看到补偿是如何影响记录电流的，可找到合适的补偿数值和R-series值。随着补偿数值的增大，可逐渐达到模型细胞真实的膜电容数值，可看到电容瞬变值逐渐变小并最终消失（红线）。此外，点击Auto按钮（图中⑦所示）可自动进行膜电容补偿和计算R-series数值。如果补偿失败，则Auto按钮右面的E框（图中⑧所示）将变成黑色。重复电点击Auto，可成功补偿，E框就会变回为正常状态。

注意：膜电容补偿的速度和成功与否取决于C-slow和R-series实际数值的大小。在进行自动补偿前，这两个数值应该与实际数值接近，最好比估计的数值高些，以便于补偿。

4. 点击Cap Track按钮（图中⑨所示），自动膜电容补偿功能将以一定间隔重复进行，间隔时间在Delay（图中⑩所示）中设定。若设定Delay=1 ms，计算机CPU频率为1.2 GHz（如奔IV），则补偿的频率为15 Hz。如果激活EPC 10菜单中的Log Tracking功能，Cap Track的数据结果可连续输出到Notebook窗口中。

注意：对于膜片钳技术的初学者，最好先用手动重复补偿C-fast和C-slow，练习一段时间后，再熟悉自动补偿方法，这样可更好地感觉C-fast、C-slow，尤其是R-series是如何影响记录的质量的。

5.上述设定Gain和对C-slow进行补偿的步骤可通过点击面板SEAL钮右侧的WHOLE-CELL钮或通过点击键盘数字“3”自动实现，执行下列内设的宏命令： 3：WHOLE-CELL E Gain： 12 ；（设定Gain为20 mV/pA） E CSlow： 30.00 pF ；（设定C-slow为30 pF） E RSeries： 10.0 MΩ ；（设定R-series为10 MΩ） E AutoCSlow： ；（自动进行补偿C-slow） E AutoCSlow： ；（重复进行补偿C-slow） E Bell： ；（出现beep音）

6. 选择串联电阻补偿Rs Comp的速度（2、10或100 μs）（图中⑾所示），拖动鼠标，逐渐从0%增加补偿的百分数到95%（图中⑿所示）。如果补偿过度，图形显示窗口中的电流记录线将出现震荡。

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（四）全细胞电流钳记录

1. 完成C-Slow补偿后，在Recording Mode中选择电流钳模式C-Clamp。此时： （1）Input ADC中应显示为Vmon，如果不是这样，要手工选择Vmon。 （2）测试脉冲幅度的单位变为pA。

2. 设定测试脉冲幅度为100 pA。此时，模型细胞的膜充电时间常数τ= Rm × Cm = 500 MΩ × 22 pF = 11 ms，充电的最大幅度值Vmax = Rm × I = 500 MΩ × 100 pA = 50 mV。由于电流钳模式下，膜的充电时间常数比电压钳模式下的大，达到Vmax所需要的时间长，所以测试脉冲宽度就要大些，如100 ms。注意：从公式中可以看出，在电压钳模式下，膜充电时间常数τ与串联电阻Rs相关（τ= Rs × Cm），而在电流钳模式下，膜充电时间常数τ与膜阻抗Rm相关（τ= Rm × Cm）。

3. 图形显示窗口中的常规尺标设定为250 mV/格。增加其增益Gain为16，则显示的尺标为16 mV/格。需要注意的是：（1）图形显示窗口中的Gain与放大器Gain不同，它只是影响显示比例，并不影响所采集数据的大小尺标。通过采用高增益显示和低增益放大，可知晓A/D转换器的分辨率。（2）模型细胞模拟500 MΩ的膜电阻，膜时间常数太大（11 ms），放大器很容易跟随，体现不出放大器快速钳制的能力。采用模型细胞的10 MΩ位置时，时间常数τ仅为60 μs，可以用来检测电流钳模式下放大器的快速钳制能力。

（五）放大器的噪声测试

EPC 10放大器的背景噪声是很低的，在绝大多数实验中，同其他来源的噪声相比可以忽略不计。 放大器内部固有噪声的检测方法如下： 1. 去除探头上连接的任何设备（如电极夹持器、模型细胞等），将探头输入端用放大器自带的金属BNC帽屏蔽。

2. 点击放大器软件面板底部的Reset按钮（图中①所示），使放大器恢复到初始的默认设置。

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EPC 10膜片钳放大器的使用

3. 选择放大器软件面板上Test Pulse左侧的noise（图中②所示），开始噪声检测。此时，没有任何测试脉冲输出，Patchmaster会持续计算出Imon2中的噪声大小（rms噪声），并显示在原R-memb的位置（图中③所示）。

4. 选择高增益（探头的高反馈电阻）到50 mV/pA 或更高（图中④所示），可看到噪声降低。 注意：

（1）因模型细胞内部电路开关的介电性质所限，模型细胞引入了一定的额外随机噪声，所以在模拟高阻封接时会比实际情况的噪声高。

（2）放大器内部的滤波器对背景噪声的作用可通过调节Filter 1和Filter 2体现出来。增加Gain到50 mV/pA 或更高时（反馈电阻为50 GΩ），可明显看到信噪比的改善。此时，若放大器探头不连接任何设备，将Filter 2的滤波频率设为2.9 kHz（图中⑤所示）时，噪声值应该低于110 fA，通常为80-100 fA。如果噪声高于110 fA，尝试改变C-fast控制钮；如果放大器从Stim in连接了具有噪声的刺激器，电流噪声将随C-fast而变化，当C-fast补偿数值为1-2 pF时，噪声最小。

（3）探头上连接电极夹持器，插入玻璃电极，将电极尖移近记录槽。打开所有可能带来噪声的设备（如显微镜灯、示波器、照相机等）的电源。设定放大器测试脉冲时间宽度为100 ms（图中⑥所示）、调高Patchmaster图形显示窗口的增益Gain（图中⑦所示）。此时，噪声和50 Hz干扰将非常明显！如果有良好的接地，这些设备将引入不超过100 fA的额外噪声，一般情况下，连接上电极夹持器与插入玻璃电极后，噪声可增加为130 fA左右，电极入浴液并与细胞形成封接后，噪声增加为160 fA左右。

④

②

③

⑦

⑥

① ⑤

（六）放大器的完整测试

如果出现通过重新校正放大器不能解决的硬件问题，可执行Patchmaster的完整测试（Full Test）功能。该功能实际上是一个诊断工具，其诊断结果可让HEKA公司的专家来分析诊断放大器可能存在的故障问题，

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EPC 10膜片钳放大器的使用

对使用者而言没有多少意义。需要指出的是，有时，虽然放大器没有任何硬件问题，但Full Test诊断结果却报告有错误，原因是：（1）Full Test是一个非常严格的检测程序，它会把一切可能的错误都报告出来供分析，以防止漏掉任何可能存在的问题；（2）报告中显示的错误信息可能是由程序出错引起，甚至是由有缺陷的BNC线引起。如果报告提示硬件有问题，要先将报告寄给HEKA公司，而不要急于将放大器寄给HEKA 公司。

放大器完整测试的方法如下：

1. 测试前，需要先准备好放大器探头的BNC屏蔽帽、模型细胞、5根短BNC线。如果使用的是EPC 10 Double或Triple，在放大器软件面板中要选择要测试的放大器。

2. 选择EPC 10菜单中的Full Test，将放大器探头的BNC屏蔽帽接在探头输入端，确保没有其他设备与探头连接，无BNC线与放大器连接，保持探头中部的黑插口（GND）空置。

3. 程序会提示连接3-5根BNC线到放大器上，如果连接测试失败，会出现出错信息，并提示重新进行一次测试。

4. 连接测试结束后，去除所有BNC线，将模型细胞接到探头，并选择10 MΩ位置。若测试的阻抗超出10 MΩ（如模型细胞切换为其他位置时），可看到出错信息，并提示重新进行一次测试。 去除BNC线，继续进行测试，可获得整个关于放大器、探头和连接状态的测试报告。如果报告中有错误信息，软件将会出现警示信息并可打印出错误备忘录。注意，如果报告错误信息，请及时与HEKA公司联系：

八、全细胞记录操作步骤

（一）电极入液

在玻璃微电极内维持一定的正压，用微操纵器使玻璃微电极进入浴液，点击SETUP ，将测试脉冲方波设为单向脉冲。此时应能观察到：（1）电极电阻的大小。如果电极电阻过小，会发现方波幅度过大，同时在Gain附近会出现红色的Clipping标记。此时应该检查电极电阻过小的原因（拉制的原因或电极尖端发生了折断）。（2）方波基线在0电流处。 （二）进行封接

使玻璃微电极逐渐接触细胞，此时测试脉冲幅度下降，有时甚至下降很大。去除正压并轻轻给予负压吸吮以形成稳定封接。封接形成后，封接测试脉冲消失，仅出现电极电容瞬变值。注意： （1） 有时测试脉冲下降的幅度不是很大（使用脑片标本时常出现这种情况），一般下降到原幅度的1/3

左右时即可给予负压吸吮。 （2） 有时封接可自动形成而不需要负压吸吮，这多发生于细胞表面非常干净或采用脂质体标本的情况。 （3） 观察封接电阻的大小，一般全细胞记录要求封接电阻在1 GΩ以上，但具体要根据细胞标本以及所

记录电流的幅度来定。 （4） 点击SEAL，将对电极电容C-fast进行补偿。 （三）打破细胞膜 （1） 继续给予负压吸吮或用Zap功能电击打破细胞膜，出现膜电容的充放电反应。破膜的力度与制备

的细胞标本有关。 （2） 破膜后，缓慢撤除电极内的负压。点击WHOLE-CELL，对细胞膜电容C-slow进行补偿。 （3） 进行串联电阻补偿和漏电流补偿。 （四）实施记录

（1） 在V-membrane中输入钳制电位的数值。 （2） 选择已经编辑好的Control Window中的PGF文件名称，或在Pulse Generator编辑框中点击

EXECUTE，或在Protocol Editor中点击按钮TO END，对细胞进行刺激。 （3） 若要保存记录，则需要在施加刺激前点击Control Window中的Store按钮，对记录文件进行路径

设置及命名。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/qcxh.html