固体检样破碎方法对菌落总数测定的影响

2007年食品机械第4期

固体检样破碎方法对菌落总数测定的影响

Theeffectuponthedeterminationofbacteriumcolonytotalinsolidfood

bydifferentprocessing

周宇清ZHOUYu-qing1

1

林继元

2

饶力群

3

李翠莲

3

LINJi-yuan2RAOLi-qun3LICui-lian3

(1.湖南省标准化研究院，湖南长沙410007；2.湖南生物机电职业技术学院,

湖南长沙410127；3.湖南农业大学，湖南长沙410128)

(1.HuanInstituteofStandardization,Changsha,Hunan410007；2.HunanBiologicalandElectromechanicalPolytechnic,Changsha,Hunan410127，China；3.HunanAgricultureUniversity,Changsha,Hunan410128China)摘要：研究固体食品破碎方法对菌落总数测定的影响，结果表明：在固体食品菌落总数测定时，先用生理盐水洗涤被检样品，再进行研磨或均质，测得的菌落总数比直接研磨或均质所测得的结果更加准确。关键词：固体食品；研磨；培养基；菌落总数

Abstract:Theinfluenceofdifferentprocessbydeterminationofbacteriumcolonytotalofsolidfoodwasstudied.Theexperimentprovedthattheresultofbacteriumcolonytotalofsolidfoodismoreaccurateifthesampleofsolidfoodisgroundorhomogenizedafterwashwithphysiologicalsaline.

Keywords:Solidfood;Grind;Culturemedium;Bacteriumcolonytotal

菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后(如培养基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等)，所得1mL(g)检样中所含菌落的总数。它是食品污染程度的标志，反映了蛋白质和碳水化合物等有机物腐败变质的程度，是食品卫生学评价的依据[1～3]。在对固体食品检样进行处理时，需要对固体食品进

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作者简介：周宇清（1969－），男，湖南省标准化研究院工程师。Email:my8611@收稿日期：2007-04-11

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行破碎，以使其中的微生物游离和分散开来。GB/T4789.2——2003中规定的对固体检样的处理方法为：以无菌操作将检样25g剪碎放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液灭菌乳钵内经充分研磨，或者置于均质器中以8000～10000r/min的速度处理1min，做成1:10的均匀稀释液。本试验研究了不同破碎处理方法对固体食品检样中菌落总数测定的影响，结果表明：对固体食品检样直接研磨破碎或均质处理，所测得的菌落总数比食品检样中实际的含菌量要低得多；若先用生理盐水对检样进行洗涤，然后再研磨或均质，再检测菌落总数，所得的结果与食品检样中实际的含菌量更为接近。

1材料与方法

1.1

材料与设备

0.85%灭菌生理盐水、灭菌锅、超净工作台、恒温箱、磁力搅拌器、均质器、显微镜、天平、研钵等；

营养琼脂培养基：按GB4789.28——2003中4.7规定；磷酸盐缓冲液：按GB/T4789.28——2003中3.22规定；

肉汤培养基[5]：牛肉膏0.5%,蛋白胨1%,NaCl0.5%,pH7.0～7.2；检样1：卤牛肉，市场购得；

检样2：将市场上购得的新鲜牛肉剪成碎块，称重后分别装于三角瓶中，每份重24g，9.8×10Pa灭菌30min；

检样3：新鲜小白菜，市场购得；

检样4：取组培方式得到的无菌新鲜小白菜24g，剪成碎块后装入无菌三角瓶中，整个操作过程都是无菌操作；

供试菌液：取检样1的肉汤斜面培养物于营养琼脂培养基斜面上36℃恒温培养24h即为供试菌样。无菌操作挑取1～2环供试菌样，用生理盐水进行梯度稀释，取菌体浓度为10个/mL的梯度为供试菌液。1.2试验方法1.2.1检样的处理方法

方法1：以无菌操作将25g检样剪碎放于含有225mL灭菌生理盐水的灭菌乳钵内充分研磨做成1:10的均匀稀释液，按GB4789.2——2003进行稀释、培养和菌落计数，测得菌落总数。整个操作过程严格按照无菌操作要求进行，并以检

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样2或检样4加1mL灭菌生理盐水作空白对照。

方法2：以无菌操作将25g检样剪碎，放于含有150mL灭菌生理盐水的灭菌三角瓶中，在磁力搅拌器上以600r/min的速度搅拌洗涤5min，洗涤完毕，静置片刻，上清液倾于另一已灭菌的三角瓶中，将洗涤残渣放于灭菌乳钵内充分研磨后，将上清液倒入乳钵内，用生理盐水洗涤三角瓶，洗涤液并入乳钵，做成1:10的均匀稀释液，然后按GB4789.2——2003进行稀释、培养和菌落计数，测得菌落总数。整个操作过程严格按照无菌操作要求进行，并以检样2或检样4加1mL灭菌生理盐水作空白对照。

方法3：以无菌操作将25g检样剪碎，加225mL灭菌生理盐水中，置均质器中以9000r/min的速度处理1min，制成1:10的均匀稀释液。然后按GB4789.2——2003进行稀释、培养和菌落计数，测得菌落总数。整个操作过程严格按照无菌操作要求进行，并以检样2或检样4加1mL灭菌生理盐水作空白对照。

方法4：以无菌操作将25g检样剪碎，加100mL灭菌生理盐水，在磁力搅拌器上以600r/min的速度搅拌洗涤5min，洗涤完毕，静置片刻，上清液倾于另一已灭菌的三角瓶中，所余残渣加75mL生理盐水置均质器中以9000r/min的速度处理1min，将三角瓶内洗涤液倒入均质器，用剩余生理盐水清洗三角瓶，并入均质器制成1:10稀释液。然后按GB4789.2——2003进行稀释、培养和菌落计数，测得菌落总数。整个操作过程严格按照无菌操作要求进行，并以检样2或检样4加1mL灭菌生理盐水作空白对照。1.2.2菌体检出率计算

菌体检出率%=

检样中实际检出的菌落数

100%

对照组菌落数

对照组菌落数系指将1mL供试菌液按照GB4789.2——2003在营养琼脂上培养相应时间后所测得的菌落总数.

2结果与分析

2.1

不同处理方法处理检样后所测得的菌落总数

检样1和检样3分别以方法1、方法2、方法3和方法4进行破碎处理，按GB4789.2——2003进行稀释、培养和菌落计数，测得的菌落总数见表1。

表1

不同方法对检样1和检样3处理后所得菌落总数

/（CFU.g-1）

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处理方法

检样1

方法1方法2方法3方法4

6.4×1048.3×10

4

检样34.7×1066.4×10

6

5.8×1048.1×10

4

4.4×1066.1×10

6

从表1可看出，用4种不同方法破碎处理检样后所测得的菌落总数结果相差较大。洗涤后再研磨或均质所测得的菌落总数结果比直接研磨或均质所测得的菌落总数结果要大，而且对同一检样来说，研磨处理比均质处理测出的菌落总数要大。导致这种差异的原因可能是研磨或均质过程造成了菌体细胞的破坏，均质对菌体细胞的破坏程度要比研磨大；通过洗涤，相当一部分菌体被洗涤下来进入稀释液中，这部分菌体细胞避免了被破坏。为了进一步弄清固体检样破碎方法对菌落总数测定结果的影响程度，分别向检样2和检样4中加入1mL已知菌体含量的供试菌液，混合均匀，放置5min后再用方法1、方法2、方法3和方法4分别对检样2和检样4进行破碎处理，再按GB4789.2——2003进行稀释、培养和菌落计数，测得菌落总数，同时以供试菌液1mL用生理盐水直接稀释成1:10稀释液作为对照，计算出菌体检出率，其结果见表2、表3

表2不同方法对检样2破碎处理所得结果

此表竖排

方法1

菌落总数/（CFU.g-1）对照组菌落数/（CFU.g-1）菌体检出率/%

68

87

61

82

1.03×106

7.0×105

方法29.0×105

方法36.3×105

方法48.5×105

表3不同方法对检样4破碎处理所得结果

此表竖排

方法1方法2方法3方法4

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菌落总数/（CFU.g-1）对照组菌落数/（CFU.g-1）菌体检出率/%

7.3×1059.2×1057.1×1058.5×105

1.03×106

71896983

表2和表3的结果进一步证实，洗涤后再研磨或均质比直接研磨或均质，菌体检出率要高，研磨比均质处理测得的菌落数多。结果还显示，菌体检出率的高低还与检样破碎的难易程度有关。在4种不同破碎处理方法中以方法2最为理想，其菌体检出率最高。文中以加1mL供试菌样的检样2为检测对象，应用方法2对检样进行破碎处理，考察各种因素对菌落总数测定结果以及菌体检出率的影响，找出在固体食品菌落总数测定时最佳研磨条件。2.2研磨速度对菌落总数测定结果的影响

在检样2中加入1mL供试菌液，混合均匀后静置5min，按照方法2进行处理，在处理时，以不同的速度研磨，同时以供试菌液1mL用生理盐水直接稀释成1:10稀释液作为对照组，其结果见表4。

表4研磨速度对菌落总数测定结果的影响

此表竖排

研磨速度/（r.min）菌落总数/（CFU.g）对照组菌落数/（CFU.mL）菌体检出率/%

89

89

88

85

-1-1-1

306090120

9.8×1059.8×1059.7×1059.4×105

1.1×106

从表4可看出，研磨速度对测定结果有一定的影响，研磨速度越快，菌体检出率越小。

2.3稀释剂种类对菌落总数测定结果的影响

在检样2中加入1mL供试菌液，混合均匀后静置5min，按照方法2进行处理，在处理时，以不同种类的稀释液进行洗涤，以60r/min速度研磨，同时

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将供试菌液1mL用生理盐水直接稀释成1:10稀释液作为对照组，其结果见表5。

表5

稀释剂种类对菌落总数测定结果的影响

此表竖排

无菌水生理盐水磷酸盐缓冲溶

液

肉汤培养基

菌落总数/（CFU.g）对照组菌落数/（CFU.mL）菌体检出率/%

-1-1

8.2×1059.2×1059.1×1058.7×105

1.02×106

80908985

表5结果显示：稀释剂种类不同，菌体检出率也不一样，稀释剂能改变微生物的带电性，从而影响微生物细胞与检样吸附的紧密程度。从表5可看出，用生理盐水作为稀释剂，试验结果与检样中实际含菌量最为接近。2.4洗涤时间对菌落总数测定结果的影响

在检样2中加入1mL供试菌液，混合均匀后静置5min，按照方法2用100mL生理盐水以60r/min的洗涤，洗涤时，改变洗涤时间，同时以供试菌液1mL用生理盐水直接稀释成1:10稀释液作为对照组，所得结见表6。

表6

洗涤时间对菌落总数测定结果的影响

此表竖排

洗涤时间/min菌落总数/（CFU.g-1）对照组菌落数/（CFU.mL-1）菌体检出率/%

70

85

89

88

87

1.06×106

27.4×105

49.0×105

69.4×105

89.3×105

109.2×105

从表6可看出，随着洗涤时间的延长，菌体的检出率随之提高；在6min时，菌体的检出率达到最高。这时洗涤液与检样中菌体数量达到平衡，洗涤液中菌体数量不再增加。当洗涤时间继续延长，被检菌体的活性受到影响，检测率反

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而变小。2.5

洗涤剂用量对菌落总数测定结果的影响

在检样2中加入1mL供试菌液，混合均匀后静置5min，按照方法2进行处理，在用生理盐水洗涤时，改变洗涤剂用量，同时以供试菌液1mL用生理盐水直接稀释成1:10稀释液作为对照，按GB4789.2——2003进行稀释、培养和菌落计数，测得菌落总数，再计算出菌体检出率，其结果见表7。

表7洗涤剂用量对菌落总数测定结果的影响

此表竖排

洗涤剂用量/mL菌落总数/（CFU.g-1）对照组菌落数/（CFU.mL-1）菌体检出率/%

75

80

83

87

90

758.1×105

1.08×10

6

1008.6×10

5

1259.0×10

5

1509.4×10

5

1759.7×10

5

从表7可看出，随着洗涤剂用量的增加，测得的菌落总数在不断增加。这是由于随着洗涤剂用量的增加，从检样中洗涤下来的菌体增多，被研磨检样残渣中菌体数量减少，菌体在研磨过程中被破坏的可能性减小，被检出的可能性增大。2.6最佳研磨条件的确定

从上述试验结果可知，在固体食品菌落总数的测定时，菌落总数测定结果受处理方法的影响很大，在诸多处理方法中，以先洗涤后研磨处理，测得的细菌菌落总数最接近于检样的实际含菌量，而该方法又受洗涤剂用量、洗涤时间、稀释剂种类以及研磨速度等因素的共同影响。为确定先洗涤后研磨方法的最佳条件，以检样2为对象，以稀释剂种类、洗涤时间、洗涤剂用量以及研磨速度为考察因素，每个因素取三个水平，所得因素水平表见表8。

表8

正交试验因素水平表

水平

A稀释剂种类

1

肉汤培养基

B洗涤时间/min4

C洗涤剂用量

/mL100

D研磨速度/（r.min-1）

30

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23

生理盐水磷酸盐缓冲溶液

68

125150

6090

根据考察因素和水平，选用L9（34）正交表安排试验，以细菌检出率为标准进行分析比较，所得结果见表9。

表9

试验号123456789K1K2K3R

A稀释剂种类11122233367.686.080.618.4

L9（34）正交试验结果与分析

C洗涤剂用量12323131272.279.882.310.1

D研磨速度12331223175.480.478.45.0

菌落总数/（CFU.g-1）5.69×1057.49×1057.29×1058.61×1059.11×1058.31×1058.52×1057.84×1058.05×105

菌体检出率/%56.374.272.285.390.282.584.477.779.8

B洗涤时间12312312375.380.778.25.4

由直观分析法得知，所考察的4个因素对检样中菌体检出率的影响依次为：稀释剂种类＞洗涤剂用量＞洗涤时间＞研磨速度，其中稀释剂种类与洗涤剂用量对检样中菌体检出率的影响最为显著。试验结果显示：以检样2为对象采用先洗涤再研磨的处理方法对检样进行处理，其最佳条件为：A2B2C3D2，即以生理盐水为洗涤剂，洗涤用生理盐水150mL，洗涤时间为6min，研磨速度为60r/min。2.7最佳条件验证试验

在检样2和检样4中分别加入供试菌液1mL，以最佳条件分别对检样1、检样2、检样3和检样4进行洗涤和研磨处理，操作过程中严格按照无菌操作要求进行。所得菌落总数见表8。

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表10

样号

检样1

最佳条件验证结果检样29.1×105

检样37.8×106

检样49.4×105

菌落总数/1.02×105（CFU.g）

-1

从表10可看出，以最佳条件洗涤和研磨处理检样，测得的菌落总数均高于用方法2处理后所得的菌落总数，说明在该条件下研磨处理检样有更高的菌体检出率。

3结论

GB/T4789.2——2003中规定，对固体检样进行破碎处理的方法是在加入稀

释液后直接研磨或均质。但这种方法会造成大量菌体细胞的破坏，导致检出的菌落数远低于检样中实际含菌量。若在研磨或均质之前，将剪碎后的检样先用生理盐水洗涤，再进行研磨或均质处理而测得的菌落总数与检样中实际含菌量更为接近。均质和研磨两种方法比较，研磨破碎法测得的菌落总数更接近检样的实际含菌量。而在研磨破碎法中，以150mL生理盐水为洗涤剂，把剪碎的检样放在磁力搅拌器上以600r/min的速度搅拌洗涤6min，再以60r/min的速度进行研磨，所测得的菌落总数与检样实际含菌数最为接近。

参考文献

1GB/T4789.2——2003,食品卫生微生物学检验-菌落总数测定[S].北京:中国标准出版社,2003.

2GB/T4789.17——2003,食品卫生微生物学检验-肉与肉制品检验[S].北京:中国标准出版社,2003.

3GB2726——2005,熟肉制品卫生标准[S].北京:中国标准出版社,2003.4GB4789.28——2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂[S].北京:中国标准出版社,2003.

5无锡轻工业学院等.微生物学[M].北京:轻工出版社,1985,538.

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/qc1m.html