方法总结

陈珏老师的课件中提到的技术比较少，我就自己觉得比较难理解的技术做了一下解释

膜蛋白结晶方法学原理 膜蛋白结构的特殊性，使其一旦脱离天然磷脂双分子结构就会发生聚集变性，导致其三维结构改变和功能的丧失．因此，要保证膜蛋白的结晶，首先必须找到一种能够高效地从天然环境中提取膜蛋白并能稳定其结构功能的方法．使用两亲性分子诸如去垢剂、脂类分子是目前最主要的手段，下面介绍脂立方相结晶。 一．脂立方相结晶(lipid cubic phase，LCP)．

基于脂类的脂立方相结晶方法早在1996 年就被Landau 和Rasenbusch 提出，但直到近年来才开始逐渐成为一种广泛接受的膜蛋白结晶方法．脂立方相由一定比例的脂、缓冲液和蛋白质组成，形成一个结构化、周期性的三维脂立方排列，其中充满相互沟通的水通道(图5)．在这一体系中膜蛋白镶嵌在双连续膜脂层中形成三维立方格结构，这与它在生物膜中的构象十分相似，也称in cubo 结晶法．

膜蛋白在脂双分子层上的锚定并不影响其宏观性质，很多膜蛋白镶嵌在脂立方相后仍保持天然构象和酶活性，比在去垢剂中更为稳定，而且较多的脂- 水界面有利于晶体形核，脂双层的网状分布则有利于膜蛋白的侧向移动从而促进晶体生长[23]．因此，该体系为具有疏水特征的膜蛋白结晶提供了一个有利的生长环境．膜蛋白在脂立方相中的结晶分为4 个基本过程：a．选择合适的去垢剂提取并纯化目标膜蛋白，形成可溶的PDC．b．膜蛋白嵌入脂立方相，PDC 溶液与脂类分子按照4∶6 的比例混合后通过离心作用形成立方相(也可以使用预先自组装的立方相与PDC 溶液混合)．c．盐诱导结晶的起始，在20℃下，添加沉淀剂盐溶液来诱导晶体的形核和生长过程．d．数小时或者数周得到晶体后，用溶解液(去垢剂或者酯酶)将立方相中的晶体分离并保存在合适条件下以备后续的X 射线晶体衍射研究．然而整个过程并不是这样简单，LCP结晶溶液体系涉及到许多组分和参数的选择，是该技术的主要瓶颈问题．目前关于此结晶方法还没有一个很全面的基本原理和操作方法，探索其结晶过程的机理成为国内外众多研究团队的一个重要方向．尽管如此，由于脂立方相具有高度的结构性 及易于紧密堆叠的性质，该结晶方法是一种有利于膜蛋白形核及三维晶体生长的新方法体系．近年来，基于此方法(包括后续的LSP 及bicelles 结晶法)已得到了众多膜蛋白晶体结构。

脂质立方相结晶膜蛋白：操作步骤（crystallizing membrane proteins in mesophases：protocol） 1.脂质的制备

LCP结晶实验的经验告诉我们，我们所用的脂一般为monolein（1-oleoyl-rac-glycerol油酸单甘油酯），这个称之为主要脂质，在必要的时候我们也要筛选一些添加脂质。胆固醇被证明是最好且最有效的脂质添加剂，可以增加晶体的大小或者分辨率。 下面是混合脂质制备方法： 材料：油酸单甘油酯，additive lipid（sigma or Avanti Polar lipids），氯仿 (HPLC grade, Sigma). 混合过程：

1. 称几毫克additive lipid到(1-2 mL)琥珀玻璃瓶中

2. 添加适当的油酸单甘油酯以获得适当浓度的additive lipid 3. 用氯仿将以上additive lipid溶解到200-400微升 4. 使用温和的干燥蒸汽，过滤氮来增发溶液的体积，保持玻璃瓶恒温在37℃以免脂质凝固 5. 在真空中至少4小时以上（最好过夜）以去除最后的氯仿

6. 用氩气来冲洗玻璃瓶，氩气必须靠近瓶口，贮存在-20℃直至使用。 注意事项（Tips）

1.首先，知道自己到底要的是什么。充分利用脂质结构随温度和脂质浓度变化的相图，在室温下，初始得脂质立方相会在水的比重为40%（w/w）左右产生。

2.在学习改技术初期，建议用水或者调节缓冲液替代你的蛋白样品，以此来熟悉该技术和相关仪器。

3.初期的脂质立方相的形成是必然的，但是它很容易被去垢剂，盐，沉淀剂等混合相中的溶剂破坏。所以，要经常检查你用的条件后相的状态。可以用小角度X射线散射（SARX）或者偏振光显微镜（PLM)。

4.大多数使用的脂都很容易被氧化，因此要尽量减少操作时间。另外，像monoolein是很容易吸湿的，所以在用之前一定要先等其温度到室温。

5.优化晶体结晶条件是，可以尝试改变缓冲液，温度，盐浓度，加入添加剂等等。在in meso这个方法里面，我们可以改变脂质的组成成分或者添加脂质，但不要破坏脂质立方相。 6.各种商业筛选条件也可以尝试。 LCP蛋白重构

参见http://cherezov.scripps.edu/reconstitution.htm 手动结晶实验

参见http://cherezov.scripps.edu/crystallization.htm 收获晶体

参见http://cherezov.scripps.edu/harvesting.htm

二 MBP（Maltose Binding Protein）大肠杆菌麦芽糖结合蛋白

大肠杆菌malE基因编码的蛋白，是细菌麦芽糖转运系统的成员之一，主要负责麦芽糖的摄取及分解代谢。malE基因产物能与多种蛋白融合，是进行表达研究的有效媒介，由于MBP融合蛋白原核表达载体具有表达效率高，易于纯化等优点。在现代分子克隆中MBP常作为融合蛋白被广泛应用。

三． 用去垢剂分子来提取膜蛋白原理

去垢剂分子的结构特征是具有一个亲水的头部和一个疏水的尾巴．当把去垢剂加入到含有脂双层的溶液中后，去垢剂分子首先进入膜表面和水相之间，导致局部膜组分变形．当

越来越多的去垢剂进入后，膜组分被去垢剂饱和最终崩塌与去垢剂分子一起形成蛋白质- 去垢剂混合微团复合物(protein detergent complex, PDC)，膜蛋白包裹于PDC 之中后被提取出来．

基于两亲性分子自组装以及能与膜蛋白分子装配成复合物结晶的原理，膜蛋白结晶研究目前主要有两种方法———基于去垢剂的in surfo 结晶法和基于脂类的in cubo结晶法．

基于去垢剂的结晶研究(in surfo methods)

去垢剂也称表面活性剂(surfactant)，一般情况 下其亲水性质要比脂类分子强，因此形成的微团类型属于Type 1，其结构特征为微团的烷基尾巴聚集在一起，被亲水的头部所包裹．在膜蛋白结晶方法学中，以去垢剂结晶为代表的In surfo 结晶法是最为经典也最为传统的方法。

去垢剂微团结晶法(detergent micellesmethod)．

In surfo 结晶法中去垢剂微团结晶法是最常用的方法，Michel 等应用此方法获得了世界上第一个膜蛋白结构———紫细菌光反应中心结构[3]．该方法的原理简单来说是利用去垢剂提取膜蛋白，使膜蛋白与其形成的复合物PDC 可以像可溶性蛋白那样直接用气相扩散(悬滴法和坐滴法)和透析等方法来结晶．PDC 是一个很复杂的网络结构，包括膜蛋白分子、去垢剂和水缓冲液，其中去垢剂分子会贯穿在晶格中形成网络结构，而膜蛋白分子间的相互作用是形成晶格的最重要因素．晶格对于PDC 的大小和形状有严格的要求，小的PDC 一般 可以形成有序的膜蛋白晶格堆积，因此去垢剂在结晶过程中的选择至关重要．非离子型去垢剂和两性去垢剂已成功应用于膜蛋白结晶中，其中前者的应用更为广泛．装配PDC 过程中也可添加一种或几种去垢剂，有时根据靶蛋白的性质也可以添加一些脂类分子或者其他化学分子．

去垢剂微团结晶法最主要的优点是PDC 在溶液条件下的结晶实验相对容易处理，但在此复合物中，膜蛋白分子的柔性和构象不均一性会产生一些固有的问题，而且由于去垢剂等分子的存在，晶体内膜蛋白分子之间的相互作用也可能受到影响．尽管如此，这种方法操作简单、性价比高、实用性好，至少可以在初期的结晶筛选中得到应用．

四．Transmission Electron Microscope，简称TEM（透射电镜，即透射电子显微镜）

通常称作电子显微镜或电镜（EM），是使用最为广泛的一类电镜。 透射电镜 - 成像原理

透射电镜的成象原理是由照明部分提供的有一定孔径角和强度的电子束平行地投影到处于物镜物平面处的样品上，通过样品和物镜的电子束在物镜后焦面上形成衍射振幅极大值，即第一幅衍射谱。这些衍射束在物镜的象平面上相互干涉形成第一幅反映试样为微区特征的电子图象。通过聚焦（调节物镜激磁电流），使物镜的象平面与中间镜的物平面相一致，中间镜的象平面与投影镜的物平面相一致，投影镜的象平面与荧光屏相一致，这样在荧光屏上就察观到一幅经物镜、中间镜和投影镜放大后有一定衬度和放大倍数的电子图象。由于试样各微区的厚度、原子序数、晶体结构或晶体取向不同，通过试样和物镜的电子束强度产生差异，因而在荧光屏上显现出由暗亮差别所反映出的试样微区特征的显微电子图象。电子图象的放大倍数为物镜、中间镜和投影镜的放大倍数之乘积，即M＝M。?Mr?Mp.

透射电镜 - 功能

早期的透射电子显微镜功能主要是观察样品形貌，后来发展到可以通过电子衍射原位分析样品的晶体结构。具有能将形貌和晶体结构原位观察的两个功能是其它结构分析仪器（如光镜和X射线衍射仪）所不具备的。

透射电子显微镜增加附件后，其功能可以从原来的样品内部组织形貌观察（TEM）、原位的电子衍射分析（Diff），发展到还可以进行原位的成分分析（能谱仪EDS、特征能量损失谱

EELS）、表面形貌观察（二次电子像SED、背散射电子像BED）和透射扫描像（STEM）。 结合样品台设计成高温台、低温台和拉伸台，透射电子显微镜还可以在加热状态、低温冷却状态和拉伸状态下观察样品动态的组织结构、成分的变化，使得透射电子显微镜的功能进一步的拓宽。

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