酶工程考试重点整理

第一章 绪论：

酶学（Enzymology）是研究酶的性质、酶的作用规律、酶的结构和功能、酶的生物学功能及酶的应用的科学。

酶工程(Enzyme engineering) 又称酶技术,是酶制剂的大批量生产和应用的技术。是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的交叉科学技术。

生物催化剂（改变生化反应的速率，不改变反应的平衡点和性质以及反应方向，本身在反应前后也不发生变化的生物活性分子,外在因素），

酶:酶是一种高效、高度专一、和生命活动密切相关的、蛋白质性质的生物催化剂(更高的催化效率,更高的反应专一性,温和的反应条件,具有调节能力,本质是蛋白质;) 酶的本质（具有生物活性的蛋白质或RNA）， 第二章 酶的分类和命名

酶的分类（根据催化作用分为六大类:氧化还原酶类,转移酶类,水解酶类,裂合酶类,异构酶类,合成酶类） 酶分子结构与功能：

①酶的蛋白质本质为酶的催化活性提供了多种功能性残基。

②酶的一级结构一方面为酶准备了功能片段，另一方面又为酶形成特定的活性构象奠定基础。

③酶通过高级结构将相应的功能基团组织在酶分子的特定区域（如凹穴），形成活性中心；活性中心指直接参与和底物结合并参与催化底物转化的各有关氨基酸按特定构象分布组成的活性结构。

④活性中心的这种活性结构也要求活性中心以外的其他氨基酸残基共同维系；这些残基被修饰、改变，或相互间连接被破坏，活性中心就会瓦解，酶失活。

活性中心（与催化作用直接相关的少数氨基酸残基组成的催化区域，具有严格保守性，构象依赖于酶分子空间结构的完整性，活性中心各基团的相对位置得以维持，就可以

保证全酶的活力）结合部位(binding site)和催化部位(catalytic site)。催化过程：酶和底物的结合；催化底物进行转化。

酶分子是在一级结构基础上，通过二、三级的折叠盘绕，形成了具有催化功能的特定活性构象结构域；酶分子是以这个活性构象结构域参与和底物结合，参与对底物进行催化，这个结构域就是“活性中心” 第三章 酶促反应动力学：

比活力specific activity（每毫克蛋白里面所含有的酶活力单位数U/mg），

活力（又叫酶活力单位，一个标准单位：在特定条件下，如25摄氏度，pH和底物浓度等其他条件都是最适条件时，一分钟能转化一微摩尔底物所需的酶量），

Km，米氏常数，在特定的反应条件下，是个特征常数，描述酶反应性质，反应条件对酶反应速度的影响。1/Kmax表示酶对底物的亲和力，Km越大，亲和力越小。Km数值相当于反应达到最大速度一半时的底物浓度。通过Km判断酶的最适底物，最适底物有最大V/Km。

（1）酶反应的反应速度和底物浓度直接相关； （2）底物浓度决定着酶系统的反应级别； （3）衡量这种关系的尺度是Km；

米氏方程：v=Vmax×[S]/（Km+[S])，Vmax是酶被反应底物饱和时的反应速度，S为底物浓度，Km为米氏常数，当底物浓度非常大时，反应速率接近一个恒定值，这个恒定值即为Vmax。

酶促反应动力学的推导及其原理：

影响酶促反应速度的因素：酶浓度，温度，因为酶是蛋白质，pH，激活剂和抑制剂等等。

可逆抑制（底物浓度对抑制程度的影响）：

① 竞争性抑制作用：抑制剂（I）和底物（S）对酶（E）分子的结合有竞争作用，互相

排斥。E+I→EI，E+S→ES，Km增大，Vm不变。斜率变大。抑制程度随I浓度增大而增大，随底物浓度增大而减小，高底物浓度可以减轻甚至消除I对E的影响。有图。抑制剂结构上与底物相似，能结合到酶活性中心上，从而阻止底物与酶结合，互相排斥。应用：药物设计。

② 反竞争性抑制作用：抑制剂I只能和ES复合物结合成三元复合物，E和S的结合会促进三元复合物的结合形成，但三元复合物ESI不能释放产物。Km，Vm随I增加而减少，斜率Km/Vm不变。抑制程度随S和I增大而增大。

③ 非竞争性抑制：I结合E，也结合ES，但产生的ESI无催化活性，I实际上不改变E对S的亲和力。Vm随I增大而减少，Km不变，斜率和纵轴截距随I增大而增大。抑制程度随I增大而增大，与S无关，增加S的浓度不能消除I对E的抑制。 第四章酶代谢与调控和酶的生产基因调节和酶合成调节

1.酶合成的基因调节控制理论：操纵子学说(调节基因,启动基因,操纵基因,结构基因)。乳糖操纵子，属于诱导合成（无乳糖，调节蛋白与操纵基因结合，启动子无法启动。有乳糖，调节蛋白与乳糖结合，启动子启动转录，合成酶。）

酶生物合成的调节:通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。(意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。) 酶生物合成的反馈阻碍作用，色氨酸操纵子，属于由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。酶合成阻遏的现象

分解代谢物阻碍作用，细胞内同时有两种分解产物（碳源和氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。是由利用快的在分解过程中的中间代谢产物一起阻遏作用。细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上，优先利用葡萄糖，耗尽后开始利用乳糖，产生二次生长现象。因为分解葡萄糖生成的中间产物阻碍降解乳糖酶系的合成。

酶生物合成的模式:

1. 生长偶联型——a.同步合成型(酶的生物合成与细胞生长同步,酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏)

b.中期合成型(酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止.酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。所对应的mRNA是不稳定的)

2.部分生长偶联型——延续合成型(发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间.可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏,所对应的mRNA相当稳定.最理想,) 3.非生长偶联型——滞后合成型(只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型,受分解代谢物的阻遏作用。所对应的mRNA稳定性高)

第五章 酶的分离纯化：

分离纯化的原理及其方法：实质：在抽提（浓缩）溶液中，其成分多而杂的情况下，要去除需要分离的酶以外的组分，从而获得高纯度的酶液。

1、根据溶解度的不同：盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法、选择性沉淀法。 2、根据分子大小的差别：胶过滤（层析）法、超过滤法、超离心法。

3、根据电学、解离性质：吸附（层析）法、离子交换层析法、电泳法、聚焦层析法。 4、基于酶和底物、辅酶因子以及抑制剂间具有专一的亲和作用特点：亲和层析。 5、利用稳定性差异：选择性热变性法，酸碱变性法，表面变性法。

原则：1 切记酶是蛋白质，防止酶变性失活,2 选择有效的纯化方法3 跟踪酶分离每一步的总活力和比活力

酶的抽提：在一定的条件下，用适当的溶剂或者溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到

溶剂或溶液的过程。与盐溶液本身性质，离子浓度，pH，温度和其他因素有关。 亲和层析，利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化

离子交换层析，利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的

酶的制备方案，细胞破碎，酶的抽提，酶的分离，酶的组合分离和纯化，酶的浓缩、干燥与结晶。

第六章 固定化酶和固定化细胞：

固定化酶：通过物理或者化学的手段，将酶束缚与水不溶的载体上，或将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子的自由活动，但能使酶充分发挥催化作用。优点：可多次使用，稳定性更高，单位底物量增加，酶使用量减少，极易与产物和底物分开，是提纯工艺简单化，催化反应条件易控制，实现多酶反应。缺点：成本高，适合于小分子底物，对大分子底物有空间阻碍。适用范围过窄。

固定化酶的制备方法，1.吸附法2.共价偶联法3.交联法4.包埋法。注意比较。选择依据：酶的性质，载体性质，制备方法选择。

影响固定化酶动力学的因素，固定化酶的构象改变，立体屏障，微扰，专一性，最适温度，酶稳定性，，最适pH，，米氏常数 第七章 酶分子改造和化学修饰： 酶的化学修饰及其方法，

1.表面修饰：化学固定化，酶的小分子修饰作用，酶的大分子非共价修饰和共价修饰，分子内交联，分子间交联，脂质体包埋，反相胶团微囊化

2.内部修饰：非催化活性基团的修饰，催化基团的修饰，酶蛋白主链的修饰，肽链伸展后的修饰，氨基酸置换修饰，酶分子的物理修饰

3.与辅因子相关的修饰：对依赖辅因子的酶的修饰，金属酶的金属取代

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