真核生物基因组DNA的提取和含量测定--上传用 - 图文

实验报告 真核生物基因组DNA的提取和含量测定 实验一、真核生物基因组DNA和提取和含量测定 姓 名：—— 一、实验原理（Principle） （一）基因组DNA的提取： 本实验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料，采用匀浆法破碎组织获得细胞，用无菌水溶解沉淀，加入蛋白酶消化液，以温和方法的破碎细胞而不产生机械剪切以致破坏DNA的完整性，可以使DNase变性，去除部分的蛋白，还可以使核蛋白体从DNA上解离。然后加入RNase以去除RNA。再用苯酚：氯仿抽提法反复抽提，使DNA进入水相与蛋白质组分分开，收集上清液后用乙醇沉淀DNA，最后用TE缓冲液溶解DNA，并测定DNA的含量及纯度。 苯酚—氯仿抽提法：酚、氯仿是有机溶剂，能有效地使蛋白质变性，使用酚：氯仿混合物抽提，可促进有机相和水相的分离。异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。变性蛋白一般集中在两相之间的界面层，而脂类则有效地分配在有机相中，核酸则被留于上层水相。该法具有①操作条件比较温和；②能迅速使蛋白质变性并同时抑制核酸酶的活性；③可得到具有生物活性的高聚合度的核酸等优点。但其操作步骤较为繁琐，去除蛋白质需要反复多次，费时，且所得到的核酸仍有部分降解。 （二）二苯胺显色法测定DNA含量： DNA在酸性条件下加热，酸解释出脱氧核糖。脱氧核糖在酸性环境中脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，后者与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595nm处有最大吸收。DNA在40~400μg范围内，光吸收值与DNA的含量成正比。除脱氧核糖外，脱氧木糖、阿拉伯糖也有同样反应，其他多数糖类（包括核糖在内）一般无此反应。反应过程可表示如下： （三）紫外分光光度法测定DNA纯度： 由于DNA在260nm处有最大的吸收峰，而蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，DNA纯品的A260/A280为1.8（1.7~1.9），故根据A260/A280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质的存在。 二、操作步骤（Operational procedure） （一）基因组DNA的提取 1．组织细胞的裂解 （1）切取0.2g鼠肝，冰冷生理盐水洗3次。 （2）转入玻璃匀浆器中，加入2mL分离缓冲液，匀浆（冰上操作）。 现象：块状鼠肝消失，溶液变色。 - 1 - 实验报告 真核生物基因组DNA的提取和含量测定 （3）匀浆液转入2mL离心管，离心（4℃,5000r/min，5min）；沉淀加0.4mL无菌水，吹散后再加0.4mL的蛋白酶消化液，慢慢颠倒混匀，50℃保温90分钟。 （4）加10mg/mL的RNase 16μL，37℃保温40min。 2．裂解物中蛋白质的去除 （1）加等体积酚—氯仿—异戊醇(25:24:1)，慢慢颠倒混匀，冰上静置5min。待分层后, 离心（4℃，10000r/min，10min）。 现象：离心后可见分层，最上层为含DNA的液体，几乎澄清透明。 （2）吸出上面的水层并转移到新的离心管中，根据吸出的量再加入等体积的酚—氯仿—异戊醇(25:24:1)，重复上述操作，直至界面不再出现明显的变性蛋白质。 现象：常温下原小离心管出现乳白色液体，摇晃后呈颗粒状。 （3）吸出上面的水层并转移到另一新的离心管中，根据吸出的量再加入等体积氯仿—异戊醇，慢慢颠倒混匀。离心。（4℃，10000r/min，10min）。 3．DNA的沉淀 （1）上清加1/10体积的3mol/L NaAc和2倍体积的无水乙醇，颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10分钟。离心（10000r/min，10min）。弃上清。 现象：形成白色絮状物，离心后在离心管底部可见白色沉淀。 （2）DNA沉淀溶解于3mL TE 中，进行260nm/280nm紫外检测。 （二）二苯胺显色法测定DNA含量 （1）取12支试管，分成6组，五组依次加入0.4、0.8、1.2、1.6和2.0 mL DNA标准溶液；添加蒸馏水，使每管体积均为2mL。另一组加2 mL蒸馏水作为对照。 （2）另取2支试管，加2ml待测DNA溶液。 （3）均各加入4 mL二苯胺试剂，混匀。于100℃恒温水浴中保温20分钟，冷却后于595 nm处进行比色测定。 （4）取两管平均值，以DNA含量为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。从标准曲线上查出相当该光吸收值的样品DNA含量。 （三）用紫外吸收法测定基因组DNA的纯度 1．用TE缓冲液稀释样品（5倍）， 2．用TE缓冲液调零点，样品稀释液转入紫外分光光度计的石英比色杯中，分别测定其在260nm和280nm的吸光度。 3．计算A260/ A280比值，分析纯度。 三、实验结果（Results） （一）DNA标准曲线的测定以及样品DNA含量的测定 - 2 - 实验报告 真核生物基因组DNA的提取和含量测定 表1 DNA标准曲线的测定以及样品DNA含量测定的数据记录表 管号 浓度mg/L A595nm 0.182 A595nm平均值 0.178 0.197 0.194 0.232 0.231 0.259 0.254 0.283 0.282 0.290 0.291 0.212 0.212 0 0 0.173 1 40 0.190 2 80 0.230 3 120 0.248 4 160 0.281 5 200 0.292 样品 0.211 A595nm 浓度mg/L 图1 标准曲线 Ps：由于操作失误，未将浓度为0的液体的光吸收值设置为0，但在绘制标准曲线时将其视为0，其他数值相应变化 根据标准曲线可得：样品浓度：57mg/L （二）紫外吸收法测定样品DNA的纯度 实验测得DNA样品稀释液的A260=0.284，A280=0.202，则A260/A280=1.406。 四、讨论（Discussion） - 3 -

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