基于红外热成像的PCR温控系统_张蓬勃

第26卷 第6期 2012年6月

电子测量与仪器学报 Vol. 26 No. 6 541

JOURNAL OF ELECTRONIC MEASUREMENT AND INSTRUMENT

DOI: 10.3724/SP.J.1187.2012.00541

基于红外热成像的PCR温控系统*

张蓬勃1,2 陈旭海1,2 李玉榕2 刘绍丽2,3 杜 民2

(1. 福州大学电气工程与自动化学院, 福州 350000; 2. 福建省医疗器械和医药技术重点实验室, 福州 350000;

3. 福州大学物理与信息工程学院, 福州 350000)

摘 要: 电化学实时定量PCR仪中, 对热循环3个温度区试剂温度的精度控制至关重要, 因为其决定了PCR反应效率。根据非稳态传热原理, 热量从基座传递到试剂存在延迟, 因此基座上的接触式温度传感器无法直接测得试剂的温度。设计基于红外热成像仪温度检测的温控系统, 可以同时对多通道试剂表面的温度进行直接测量, 从而准确控制DNA解链-结合-延伸时间, 提高DNA扩增效率。为了实现红外热像仪对温度的精确测量, 对获取的红外温度进行中值滤波, 根据热辐射理论与红外热像仪的测温原理以及公式推导, 在线得到被测试剂表面发射率, 通过换算从而获得试剂真实温度。实验表明, 校准后热像仪测温精度由2.0℃提高到0.3℃; 对试剂表面温度的监控使得PCR温控更加准确高效, 具有重要意义。

关键词: 聚合酶链式反应; 红外热成像仪; 温度测量; 发射率

中图分类号: TP301.6; TH776 文献标识码: A 国家标准学科分类代码: 510.4030

PCR temperature control system based on thermal infrared imager

Zhang Pengbo1,2 Chen Xuhai1,2 Li Yurong2 Liu Shaoli2,3 Du Min2

(1. College of Electrical Engineering and Automation, Fuzhou University, Fuzhou 350000, China; 2. Fujian Key

Laboratory of Medical Instrumentation & Pharmaceutical Technology, Fuzhou 350000, China; 3. College

of Physics and Information Engineering, Fuzhou university, Fuzhou 350000, China)

Abstract: It is very important for ERT-PCR to accurately control the precision of reagent’s temperature in thermal cycle, because it will determine the efficiency of PCR. According to the theory of unsteady state heat transfer, heat takes time to transfer from block to regent. The temperature control system based on thermal infrared imager can measure a number of target almost simultaneously and accurately control the time of melting, annealing and extension, improve the efficiency of DNA amplification. In order to measure the temperature accurately, the formuals calculating the apparent emissivity of regent are presented based on the theory of infrared radiation and the priciples of temperature measurement by using infrared thermography. After conversion, the accuracy of temperature is enhanced to 0.3℃ from 2.0℃. And it is more reasonable for PCR instrument to set time of constant temperature.

Keywords: polymerase chain reaction; thermal infrared imager; temperature measurement; emissivity

1 引 言

微型聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)芯片是生物芯片的一个重要发展方向, 是实现快速分子生物学检测的一个新兴技术。在PCR工作过程中, 特异性DNA片段扩增反应在三段温度下(高温变性、低温退火、适温延伸)周期性地进行, 使DNA量获得指数型倍增[1]。电化学实时定量PCR

(electrochemical real-time PCR, ERT-PCR)是一种采用电化学分析法对PCR反应中特定DNA序列实现间接检测的一种非光学实时PCR技术。该技术不仅克服了目前应用广泛的实时荧光定量PCR技术的缺点, 如光学仪器复杂、体积大不利于小型化, 而且操作简单, 是一种成本更低、更可靠、更易于小型化的非光学实时定量检测技术[2-3]。本文主要研究电化学实时定量多通道PCR芯片的温度控制系统。

本文于2012年3月收到。

*基金项目: 国家高技术研究发展规划项目(863)(2008AA02Z433); 福建省科技计划项目(2010I0017), 国家大学生创新性实验计划(101038605)。

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在PCR反应过程中, 温度控制精度和控制时间决定了PCR反应效率, 从而直接影响实时PCR仪定量测试的准确度。而传统实时定量PCR仪的温度控制系统只能对铝块基座的温度进行采样和控制, 根据非稳态传热原理, 热量从基座传导到试剂需要一定的时间, 试剂的升降温相对基座的升降温有时间延迟, 因此不能直接检测试管中试剂的实际温度[4]。如何对试剂温度进行实时准确的监控, 对于电化学实时定量PCR仪这种小型化、隔热效果相对较差的仪器而言, 至关重要[5-8]。文献[4]通过非稳态导热理论和实验相结合, 虽可以准确测量试剂升降温过程的延迟时间, 但对于不同的PCR温控系统, 加热模型不同, 需要重新进行理论推算和设计实验, 不具有普遍的适用性。为此, 设计了基于红外热像仪的实时温控系统, 通过对多通道试剂表面温度直接测量与控制, 可以准确控制DNA解链、结合、延伸的时间, 提高DNA扩增效率和ERT-PCR仪定量的准 确度。

红外热成像仪具有不污染试剂、测温响应速度快与可大规模对多通道试剂同时测量的优点, 且不干扰现有温度场的状况, 可在一定距离内实时定量、在线检测发热点的温度, 克服了多通道需要布放多点传感器不足[9]。在实际测量时, 红外热像仪的测温准确性主要受到被测物体表面发射率和环境温度的影响[10]。本系统对热像仪采集的红外热辐射温度进行中值滤波消除干扰噪声后, 根据红外热辐射原理, 结合系统热源温度传感器和环境温度传感器测得的温度数据, 通过推导的试剂表面发射率公式计算, 在线得到试剂表面的发射率, 经过换算准确测得多通道试剂的表面温度, 进而控制多通道试剂真实温度的恒温时间, 提高DNA扩增的成功率。

图1 ERT-PCR温控系统

Fig. 1 Temperature control system of ERT-PCR

试剂表面热辐射温度数据的采集。环境温度传感器采集传感器附近的环境温度数据; 热源温度传感器为两个接触式温度传感器PT100, 用于分别直接测量两个加热模块上参考点的温度。传感器采集到的温度信号由MCU的片上ADC转换为数字信号, 结合热像仪测得的试剂表面辐射温度, 通过换算在线获取试剂表面的发射率, 经过MCU处理后准确得到试剂表面的真实温度。2个热源温度、试剂表面真实温度与系统设定的温度参数相减得到温度偏差后, 通过PID控制算法转换为控制量, 然后用PWM模块输出占空比随控制量变化而变化的方波, 下一级驱动电路的功率器件以PWM方波作为开关信号驱动加热制冷器的工作, 进而实现对多通道试剂温度的准确控制。

3 用于PCR温控的红外热成像校准

方法

3.1 信号预处理

在进行温度计算之前, 为了消除红外温度的噪声, 本系统采用中值滤波对采集到的红外热辐射温度数据进行预处理。中值滤波是对某一被测参数连续采样N次(一般N取奇数), 然后把N次采样值从小到大, 或从大到小排队, 再取其中间值作为本次采样值, 即：

g median f1,f2, ,fN (1)

2 系统的设计与实现

ERT-PCR温控系统框图如图1所示。 温度控制闭环系统以TMS320F2806微处理器为加热制冷驱动模核心, 主要包括温度采集反馈模块、

块两部分。温度采集的反馈通路由红外热像仪、环境温度传感器和热源温度传感构成。红外热像仪通过非接触测量, 将多通道试剂表面红外热量转换为热图像, 并读取热图上选定区域的温度通过热像仪的数据接口传送到MCU的AD模块, 实现对多通道

式中：median[]表示在第1到N个数中取得的中间值。中值滤波对于去掉偶然因素引起的波动或采样器不稳定而造成的误差所引起的脉冲干扰比较有效, 对温度、液位等变化缓慢的被测参数采用此法能收到良好的滤波效果[11]。

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3.2 热像仪辐射测温原理和试剂表面发射率获取

红外热像仪测温原理是利用被测物体表面发出的热辐射来确定物体表面的实际温度。在实际测量时, 红外热像仪接收到的有效辐射包括3个部分：目标自身辐射、环境发射辐射和大气辐射。作用于热像仪的辐射照度为：

E A0d 2 a Lb T0

距离测量, τa=1, 且εa=0, 则式(7)与式(8)分别化简得红外辐射温度公式与物体表面发射率公式：

Trn T0n 1 Tun (9)

T n T n T n

r u 1 u (10)

TTT 0 0 0

根据式(9), 只需要确定环境温度、被测试剂表面的发射率和辐射温度, 就可以精确得到试剂表面的真实温度。在实际测量过程, 环境温度和试剂表面辐射温度可以由环境温度传感器和热像仪直接测得, 试剂表面发射率却无法事先确定(不同试剂的表面发射率可能不同)。本系统采用红外测温和接触测温相结合, 根据热像仪测温原理与推导的公式, 能够在线测出试剂表面的发射率, 以下是推导过程。

多通道试剂加热模块如图2所示, 在加热模块选取一个参考点c, 其辐射温度Trc由热像仪直接测得, 而实际温度Toc通过PT100接触式温度传感器测得, 环境温度传感器采集环境温度Tu, 加热模块参根据红外热像仪工作所在波段, 考点表面发射率为εc。选取n=4。

a 1 Lb Tu a Lb Ta

(2)

式中：A0为热像仪最小空间张角所对应目标的可视面积; d为被测物体与热像仪间距。通常在一定的条件下, A0d 2为一个常数; T0为被测物体的表面温度; Tu为环境温度; Ta为大气温度; τaλ为大气的光谱透射率; ελ为被测物体表面发射率; αλ为物体表面吸收率; εaλ为大气发射率; Lbλ(T)为温度T物体的辐射亮度。

由于热像仪通常工作在2~5 m或者8~13 m 2个很窄的波段范围内, 可以认为τaλ、ελ、αλ、εaλ与λ无关。根据文献[12-19]红外热像仪的响应电压为：

Vs K a f T0 a 1 f Tu af Ta (3) 式中：K ARA0d 2, f(T) R Lb T d , AR为热

像仪透镜面积, Rλ为热像仪探测器光谱响应度。令

VS/K f(Tr), 则式(3)变为：

f Tr a f T0 a 1 f Tu af Ta (4)

式中：Tr表示热像仪指示的辐射温度。

根据普朗克辐射定律可得到：

f T R Lb T d

c1 5 c2

Rexp T π

(5)

1 d

1

图2 多通道试剂加热模块示意 Fig. 2 Schematic diagram of multichannel

reagent heating module

式中, c1=3.7418×10 4 W·cm2, c2=1.4388 cm·K分别为第一和第二辐射常数。根据f(T)随温度的变化关系,式(5)近似满足如下关系式(6)：

f(T) CTn (6)

由式(10)可知, 参考点的发射率为：

式中：在2~5 m, C=7.2768×10 23, n=9.2554; 在8~13 m时, C=1.9675×10 8, n=3.9889。

将式(6)代入式(4)可以得到：

Tr a T (1 )T aT (7)

由式(7)可得：

n

n0

nu

na

T 4 T 4 T 4

c rc u 1 u (11)

TTT oc oc oc

由于在同一块加热模块上, 不同位置的发射率相同, 可得池壁b点的发射率为：

b c (12)

已知池壁b点发射率, 且辐射温度Trb可以由热像仪直接测得, 因此由式(9)可得池壁b点的实际温度Tob为：

T T / a 1 T /T (8)

当被测物体表面满足灰体近似时, ε=α, 对于近

nr

naa

nu

n0

544

1/4

电子测量与仪器学报 第26卷

144 1Tob T T rbbu b

144 1TT cu rb c

由于加热模块存在热传导现象, 故表面的真实温度是连续的, 池壁b与试剂边缘h处在临界位置, 可以认为两者的真实温度相同, 有：

1/4

(13)

Toh Tob (14)

由式(10), 可以求得试剂边缘的发射率为： T 4 T 4 T h rh u 1 u

TTT oh oh oh T 4 T 4 T rh u 1 u

TTT ob ob ob

将式(13)代入式(15), 可得：

(15) 4

4

图3 加热模块在93℃的热图像 Fig. 3 Thermal image of heating module at 93℃

Sp1为热源参考点; Sp2为试剂边缘; Sp3为加热池壁

44Trh Tu4Trc Tu4

h 4 (16) 4

Trb Tu4Toc Tu4

综上, 可以得到试剂的发射率εx为εx=εh, 处理器只要得到c点实际温度和环境温度就可以通过式(16)算出试剂的发射率, 进而根据式(9)计算试剂表面真实温度。

图4 系统测试结果温度曲线

Fig. 4 Temperature curves of testing results

A: 清水表面真实温度; B: 热源温度; C: 滤波前的清水表面红外辐射 温度; D: 滤波后的清水表面红外辐射温度; E: 换算后的清水表面温度

4 实验结果与讨论

4.1 试剂表面温度理论推导验证

为了验证理论推导的正确性, 在环境温度为21.5℃, 空气湿度为50%的条件下, 实验以清水代替试剂作为温控对象, 在单个通道内对其加热到93℃, 通过红外热像仪对被测清水进行实时在线检测, 同时在清水液面下设置一个PT100接触式温度传感器测量清水液面附近较准确的温度用作参照, 最后将对比温度传感器以及系统温度传感器数据通过串口上传到上位机进行比较分析, 当加热池壁加热到 93℃的热图像如图3所示。

通过实时在线获得清水表面的发射率、红外辐射温度和环境温度, 经过MCU处理换算, 得到清水由温度跟随阶表面的真实温度, 其结果如图4所示。

段的局部放大图可以清楚看到, 在对获取的清水表面辐射温度滤波前, 红外热像仪受到自身精度等因素的影响, 测得的清水表面红外辐射温度波动性较大, 滤波后的红外辐射温度变得较为平滑, 经过换

算后的温度数据更加接近清水表面真实的温度, 利用如下均方根误差公式评价滤波换算后的精度：

e

(17)

(i)为红外热像仪测量值或滤波换算后的清水X

表面温度值, X(i)为液体表面的参比传感器测量数据。用温度达到稳态阶段时的数据进行对比计算发现, 热像仪校正前对清水表面温度测量精度约为2.0, 滤波换算后的精度变为0.3左右, 从而验证理论推导的正确性。

4.2 系统的温控性能与DNA扩增效果

在室温21.5℃下, 分别对2个加热片进行三温循环控制。其中, 加热片A的目标温度设定为：93℃、54℃、72℃; 加热片B的目标温度设定为：92℃、

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55℃、74℃。图5为两个加热片在不同温控阶段的热图像, 其中一块加热片可以同时对12通道进行热传递。

热阻力), 通道内试剂降温速率比升降温模块的降温速率要慢的多, 因此当热源温度达到退火阶段时, 通道内的试剂温度依然较高, 因此为了保证PCR扩增快速顺利进行, 系统以试剂表面温度为温控对象。由图6可看到热源温度降低的速率较快并产生过冲现象, 试剂温度到达54℃时, 热源开始升温, 并与试剂共同维持在相同的温度, 恒温30 s时间。延伸时,

图5 24通道热图像

Fig. 5 Thermal image of 24 channels

仍以试剂表面温度作为温控对象, 通过热源温度的微小的超调来实现迅速升温的目的, 热源温度和试剂温度共同恒温30 s后进入下一个温控循环。经过30次温控循环以后, 对单通道得到模板DNA的PCR产物进行凝胶电泳测试。实验结果如图7所示, 与市面上96孔PCR仪扩增结果进行比较, 效果略优。

为测试控制器的控制性能以及PCR扩增效果, 选取加热片上的一个通道, 对DNA模板试剂进行单重PCR扩增实验, 试剂目标温度设定为：93℃、 54℃、72℃, 对应的系统时间设置为：20 s、30 s、30 s, 单通道试剂的三温循环的热源温度和红外温度曲线如图6所示。

图7 PCR产物凝胶电泳图

Fig. 7 Gel electrophoresis of PCR product A: 本系统扩增结果; B: 96孔PCR仪扩增结果

图6 试剂表面温度曲线、热源温度曲线 Fig. 6 Temperature control curves of the reagent

surface and the heater

5 结 论

电化学实时定量PCR温控系统采用红外热像仪对试剂进行温度采集, 对获取的辐射温度进行预处理, 结合热源温度传感器和环境温度传感器, 在线获得试剂表面发射率, 通过换算得到试剂表面真实温度。这种方法不仅可以提高热像仪的测温精度, 而且能够实现在线检测、控制多通道试剂的温度, 从而提高了DNA扩增效率, 且具有不污染试剂、测温的响应速度快于接触式温度传感器的优点。温度控制实验表明, 对试剂表面温度的监测, 使得操作人员能够直接设置试剂真实的恒温时间, 进而减少实验盲目性、提高实验的成功率, 具有重要意义。 参考文献:

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在试剂温度上升到解链温度的过程中, 根据PCR反应机理, 如果温度变化快, 反应速度提高, 大大缩短了反应进行得时间, 但是当冲幅过高时可能导致聚合酶很快失活, 而且还会造成少量的试剂瞬间沸腾, 严重影响反应的进行。因此在解链阶段, 以热源温度为温控对象, 严格控制热源温度平缓上升, 当达到94℃时产生微小的超调。待试剂温度跟随热源达到稳态温度后, 延长恒温时间以保证DNA双链在系统规定的时间内彻底变性。在试剂温度下降到退火温度的过程中, 由于热量传递的迟滞性(加热块与反应池壁之间以及反应池壁与试剂之间存在传递

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E-mail: liyurong@

Li Yurong: born in 1973, received Ph.D. in control theory and control engineering from Zhejiang University in 2001. Now she is an associate professor at Fuzhou University. Her research interests include biomedical instrument and intelligent informa-tion processing.

刘绍丽：1986年出生, 现为福州大学物理信息与工程学院通信与信息工程专业在读硕士。目前主要研究方向是图像处理与通信。

E-mail: n100120059@

Liu Shaoli: born in 1986, M.Sc. candidate in Fuzhou University. Her present research interest includes image processing and transmission.

杜 民： 福州大学电气工程与自动化学院博士毕业, 现为福州大学教授与博士生导师, 福建省医疗器械和医药技术重点实验室主任, 福建省科技厅副厅长。目前研究方向为智能仪器与光电系统。

E-mail: fjkeylab@

Du Min: received Ph.D. from Fuzhou University. Now she is a professor and Ph.D. supervisor in Fuzhou University,

director of Fujian Key Lab of Medical Instrumentation & Pharmaceutical Technology, deputy commissioner of Fujian Provincial Department of Science & Technology. Her main re-search directions are smart instrument and photoelectrical sys-tem.

作者简介:

张蓬勃：1986年出生, 现为福州大学电气工程与自动化学院电工理论与新技术专业在读硕士。目前主要研究方向是生物医学仪器及智能检测。

E-mail: n100120059@

Zhang Pengbo: born in 1986, M.Sc. candidate in Fuzhou University. His present research interest includes biomedical instrument and intelligent detection.

陈旭海：1983年出生, 现为福州大学电气工程与自动化学院电机与电器专业在读博士。目前主要研究方向为生物医学仪器与智能信息处理。

E-mail: xuhaimail@

Chen Xuhai: born in 1983, Ph.D. candidate in Fuzhou University. His present research interests include biomedical instrument, intelligent information processing and so on.

李玉榕：1973年出生, 2001年毕业于浙江大学, 获工学博士学位。现为福州大学电气工程与自动化学院副教授, 研究方向为生物医学仪器和智能信息处理。

LitePoint推出创新测试技术 解决智能手机/平板电脑生产瓶颈

智能手机和平板电脑如今炙手可热, 但生产 制造商的能力却不足以有效应对日益增长的批量生产需求, 无线通讯行业测试设备领先供应商LitePoint®（莱特波特）指出。LitePoint 中国区总经理王钢称, 据分析家预测, 今年智能手机销量将达到6亿部, 而平板电脑销售将达到1.26亿台。智能手机和平板电脑功能与复杂度不断增加, 用传统方法进行通讯产品测试将耗时更长, 由此导致消费需求的供应无法满足……最终造成客户失望与公司盈利下降。

王钢表示“如今测试一部智能手机约需10分钟。按此速度对6亿部智能手机进行测试根本无法达到或添预期需求, 无线产品制造厂商或选择减少测试、置设备。但减少测试并不现实, 因为这将导致产品质量降低的风险加大。购买新设备又会增加成本压缩利润。两种方式皆不可取。为此莱特波特提供了第三项选择, 即通过LitePoint IQxstream®平台的IQvector 软件实现多产品测试”。

通过使用LitePoint IQxstream测试平台并配备

专利软件和测试技术后, 制造商可在两分钟内同时测试四部终端产品。“这样, 客户采用LitePoint方案后每台仪器1小时即可测试约120部智能手机, 而使用传统方法下的竞争者仅能测试6部。”

王钢指出, 莱特波特革命性的测试提速不仅可提速生产制造流程与吞吐量, 且为制造商有效地节约了成本, 因为如果采用传统测试产品和方式, 要想提高产出率, 制造商只能去添置新测试设备或增加生产配套。“LitePoint解决方案的妙处在于, 在降低成本的同时且能提高产量, 帮助客户满足不断增长的终端生产需求, 且无需压缩利润空间。”

四部终端并行测试的创新设计以及非信令测试技术的采用使得厂商可在不缩减测试要求情况下极大地增加产出。LitePoint测试仪器配有针对目前最常用的芯片组进行优化的测试软件, 意味着测试设备可迅速完成安装调试并投入使用, 同等重要的是, 操作员对新测试系统的上手相当简便。即便没有任何测试经验的操作员也能在一小时培训之内掌握新设备并合格上岗。

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