植物生理指标--最新实验原理与方法

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1、氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD） 2、POD（过氧化物酶）活性的测定——愈创木酚法 3、CAT(过氧化氢酶)测定

4、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定 5、谷胧甘肽还原酶(GR)的活力测定: 6、O2-产生速率的测定

7、过氧化氢(H2O2)含量的测定——碘化钾分光光度法 8、丙二醛（MDA）含量的测定

9、还原型抗坏血酸（ASA）和脱氢抗坏血酸（DHA）的测定 10、谷胱甘肽还原酶测定

11、MDAR(单脱氢抗坏血酸还原酶)活性的测定 12、可溶性总糖的测定

13、考马斯亮蓝G-250染色法测定可溶性蛋白含量 14、叶绿素含量的测定 15、石蜡制片的制作

16、激素Indole-3-Acetic Acid（IAA）、Abscisic Acid（ABA）、GA3和ZA的测定

17、cDNA扩增片段长度多态性技术（cDNA-AFLP）

18、3′/5′RACE 扩增基因全长 19、根系活力的测定（TTC法）

一氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD）

【实验原理】

SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：Mn－SOD和Cu.Zn－SOD，它们都催化下列反应：

由于超氧自由基（O2.－）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2.－，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替（黄色），继而还原生成二甲月替，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比。反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低。

【仪器、材料与试剂】（一）仪器

1. 分光光度计 2. 台式离心机

（二）材料

1. 磷酸氢二钠 2. 磷酸二氢钠 3. 甲硫氨酸 4. EDTA-Na2 5. 核黄素 6. 氮蓝四唑(NBT) 7. 陶瓷小研钵 8. 4-5ml 离心管 9. 10ml 玻璃试管

（三）试剂

1. 0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：

A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

2. 14.5mM甲硫氨酸溶液：称取1.0818g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至500ml。 3. 3mM EDTA-Na2溶液：称取0.1117g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。 4. 60μM核黄素溶液：称取0.0023g 核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。 5. 2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：称取0.092g NBT用PBS定容至50ml，避光保存。

【实验步骤】

1. 酶液提取

称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清夜即为SOD粗提液。

2. 酶活性测定

（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取配好的Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液6ml， NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后充分摇匀；

（2）分别取3ml反应混合液和40μl（可视情况调整）酶液于指形管中此即反应管；同时做两支对照管，其中1支试管加3ml反应混合液和40μl PBS（不加酶液）作为最大光还原管，另1支加3ml反应混合液和40μl PBS同时用锡箔纸包好遮光用于测定时调零。

（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照25℃下反应20min；

（4）反应结束后以不照光的对照管调零，分别测定各管在560nm下的吸光度（OD560） 3. 计算结果

已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活单位（U），按下式计算活性

n=[(ODmax-OD560)/ODmax]/2

SOD总活性＝ [( Ack-AE )×V]/（1/2Ack×W×Vt） SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量

SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时的酶液用量（ml）；W为样品鲜重（g）；蛋白质含量单位为mg/g。

【注意事项】

1. 酶液提取须在4℃下进行，提取后立即进行测定，冰箱中放几小时活性也会下降； 2. 植物中的酚类物质对测定有干扰，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或

pvpp等，尽可能除去植物组织中的酚类等次生物质。

3. NBT反应液配好后过滤除去不溶物立即使用，若置于冰箱中要避光保存，充分摇匀然后使用。

4. 加反应液时最好在暗光下进行；

5. 核黄素产生O2.，NBT还原为篮甲潛都与光照密切相关，照光强度和时间要严格控制。光照培养箱内壁裱糊锡箔纸，使箱内均匀光照约达40μmolm-2s-1，同时使照光时间一样，选择试管尽量一致，照光结束后测一个拿一个（最好晚上做）（温度高时照光时间缩短，温度低时延长）；

6. 测定活性时加入的酶量，以能抑制反应的50％为佳。（一个酶单位相当于引起反应液达到半抑制时酶的用量，即以能抑制反应50％的酶量为一个SOD酶活性单位。）

（反应液中加酶液与PBS调零差异不大，反应液调零与其它两个则有一定差异。李合生方法：2支CK管均以缓冲液代替酶液。）

【参考文献】

Beauchamp C, Fridovich I. Superoxide dismutase. Improved assays and an assay applicable to

acrylamide gel. Anal Biochem, 1971, 44: 276-287.

Zhou W, Zhao D, Lin X. Effects of water logging on nitrogen accumulation and alleviation of

waterlogging damage by application of nitrogen fertilizer and mixtalol in winter rape (Brassica napes L.). J. Plant Growth Regul, 1997,16, 47-53.

二愈创木酚过氧化物酶（POD）活性的测定----愈创木酚法

【实验原理】

在过氧化物酶催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm处有最大光吸收，故可通过测470nm下吸光值变化测定过氧化物酶活性。

【仪器、材料与试剂】（一）仪器

1. 分光光度计 2. 台式离心机

（二）材料

1. 磷酸氢二钠 2. 磷酸二氢钠 3. 2-甲氧基酚 4. 30％H2O2

5. 陶瓷小研钵 6. 2ml 离心管

（三）试剂

1. 0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)：

0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)的配制：分别取A母液(Na2HPO4 )12.3ml和B母液(NaH2PO4 ) 87.7ml混匀即为100ml PBS(0.2M，pH6.0)；

【实验步骤】

1. 酶液提取

称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清夜即为酶粗提液。

2. 酶活性测定

（1）反应混合液的配制：取50mlPBS（pH6.0，0.2M）缓冲液于烧杯中，加入28μl愈创木酚（2-甲氧基酚）于磁力搅拌器上加热搅拌，直至溶解愈创木酚溶解，待溶液冷却后加入19μl30％的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。

（2）酶活性测定：取3ml反应液并加入40μl酶液后测定OD470值在40秒的变化。以PBS代替酶液为对照调零，

3. 计算结果

以每min OD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。，按下式计算活性 POD活性=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t） (u/g FW)

ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml）。

【注意事项】

1. 反应液配制时由于愈创木酚难溶，应加热一段时间。加入H2O2前注意溶液冷却，防止H2O2的挥发。

2. 由于该反应迅速，加入酶液要立即进行吸光值的测定。参考文献

J.L. Mu?oz-Mu?oz, F. García-Molina, P.A. García-Ruiz, E. Arribas, J. Tudela, F. García-Cánovas, J.N.

Rodríguez-López, Enzymatic and chemical oxidation of trihydroxylated phenols, Food Chemistry, Volume 113, Issue 2, 15 March 2009, Pages 435-444 F. Quintanilla-Guerrero, M.A. Duarte-Vázquez, B.E. García-Almendarez, R. Tinoco, R. Vazquez-Duhalt, C.

Regalado, Polyethylene glycol improves phenol removal by immobilized turnip peroxidase,Bioresource Technology, Volume 99, Issue 18, December 2008, Pages 8605-8611

三 CAT(过氧化氢酶)的测定

【实验原理】

过氧化氢酶(Catalase,CAT),是一种广泛存在于生物组织中的氧化还原酶，它能催化H2O2分解为水和氧气,清除组织中的过氧化氢。H2O2在240nm处有一个吸收高峰,其吸光度与H2O2的含量成正比,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。单位时间内吸收的差值就是过氧化氢酶的活性。

【仪器、材料与试剂】（一）仪器

1. 分光光度计 2. 台式离心机

（二）材料

植物叶片等植物材料

（三）试剂

1 0.15mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4) 228.75 ml 和B母液(NaH2PO4) 146.25 ml混合后用蒸馏水定容至500ml。

2 0.3％H2O2: 吸取0.5ml 30％的H2O2，用PBS (pH7.0)定容至50ml。

【实验步骤】

1. 酶液提取

称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清夜即为CAT粗提液。

2 酶活性测定

（1）反应混合液的配制：取100ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.1546ml 30%的H2O2摇匀即可。

（2）取2.9 ml反应液加入0.1ml酶液，以PBS为对照调零，测定OD240值在40s内的变化。

3 结果计算：酶活性计算：以每min OD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。 CAT=[ΔA240×Vt ]/（W×Vs×0.01×t） (u/g FW)

ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml）。

【注意事项】

H2O2易分解，应现用现配。

【参考文献】

Aebi H (1984) Catalase in vitro. In: Packer L (ed) Methods in enzymology. Orlando, FL:

Academic Press, pp 121–126

四抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定

【实验原理】

AsA-POD是叶绿体内专一的清除H2O2的酶，催化抗坏血酸(AsA)与H2O2反应，使AsA氧化成单脱氢抗坏血酸（MDAsA）。随着AsA被氧化，溶液的OD290值下降，根据单位时间内OD290的减少值，计算AsA-POD活性。AsA氧化量按消光系数2.8/(mmol/L)·cm（ε＝2.8mM-1.cm-1）计算，酶活性用μmol AsA·g/FW·h 表示。

【仪器、材料与试剂】（一）仪器

1. 分光光度计 2. 台式离心机

（二）材料

1. 磷酸氢二钠 2. 磷酸二氢钠 3. EDTA-Na2 4. 抗坏血酸 5. 30% H2O2 6. 陶瓷小研钵 7. 2ml 离心管

（三）试剂

（按50个样计算）：

1. 0.05 mol/L 磷酸缓冲液（pH7.0）的配制：母液的配制方法同前取A母液Na2HPO4 61.0ml，加入B母液NaH2PO4 39.0ml，用去离子水定容到400ml。

2. 0.1 mM EDTA-Na2：取0.0093g EDTA-Na2用PBS（pH7.0）缓冲液定容到250ml（372.24 g/M×0.1mM×500ml=0.01861 g）；

3. 5 mM AsA：取0.044g抗坏血酸用PBS（pH7.0）缓冲液缓冲液定容到50ml（现用现配）；

4. 20 mM H2O2：取0.2ml30% H2O2用去离子水稀释到100ml。

【实验步骤】

1. 酶液提取方法同SOD.

2. 酶活性的测定（以2 ml体系测定）

（1）（以2 ml体系测定）取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na2的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 20mM H2O2，立即在20℃下测定OD290值在40s内的变化，计算单位时间内AsA减少量和酶活性（室温下测定，以不加H2O2为空白对照调零）。

（2）若以3 ml体系测定，则取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入2.60 ml 含0.1mM EDTA-Na2的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.15ml 5 mM的AsA，最后加入0.15 ml 20mM H2O2，立即在20℃下测定OD290值在40s内的变化

3. 酶活性计算

以1min内A290变0.01定义为一个酶活性单位u，酶活性以u/g(FW)表示 APX活性（u/g）= △A290.VT/0.01VS.t.W △A290表示在290nm处吸光值的变化

VT 提取液总体积；VS 酶液的体积；W 叶片的鲜重；t 反应时间

【注意事项】

加入H2O2后应混匀反应液然后快速进行比色测定。

【参考文献】

Nakano Y, Asada K. 1981.Hydrogen peroxide scavenged by ascorbate-specific peroxidase in

spinach chloroplasts. Plant Cell Physiol. 22, 867-880

五 GR（谷胱甘肽还原酶）的测定

【实验原理】

【仪器、材料与试剂】（一）仪器 1. 分光光度计

2. 台式离心机

（二）材料

1. 叶片或根系 2. GSSG 3. NADPH 4. Hepes

（三）试剂

1. Hepes缓冲液 (PH7.8)：称取Hepes 1.9155g,用蒸馏水定容至200ml 2. 10mM GSSG：称取18.3mgGSSG溶于3ml蒸馏水中 3. 2.4mM NADPH：称取4mgNADPH溶于2ml蒸馏水中

【实验步骤】

1. 酶液提取

称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为GR粗提液。

2. GR测定

取样品上清液0.1ml（3次重复），放入试管中，加入Hepes1700ul，NADPH 100ul及其GSSG100ul在OD340下测定。

【注意事项】

1. 酶液提取须在4℃下进行，提取后立即进行测定，冰箱中放几小时活性也会下降； 2. 植物中的酚类物质对测定有干扰，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或pvpp等，尽可能除去植物组织中的酚类等次生物质。

【参考文献】

Hong Zhu, Zhuoxiao Cao, Li Zhang, Michael A. Trush, Yunbo Li(2007) Glutathione and

glutathione-linked enzymes in normal human aortic smooth muscle cells: chemical inducibility and protection against reactive oxygen and nitrogen species-induced injury. Mol Cell Biochem 301:47–59.

Wheeler CR, Salzman JA, Elsayed NM, Omaye ST, Korte DW (1990) Automated assays for

superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase, and glutathione reductase activity. Anal Biochem 184:193–199.

六 O2-产生速率的测定

【实验原理】

O2-与羟胺反应产生NO2－，NO2－在对氨基苯磺酸和α-萘胺作用下，生成粉红色的偶氮染料，该染料在530nm处有最大光吸收，根据OD530可计算出样品中的O2-的含量。

【仪器、材料与试剂】

（一）仪器 1. 分光光度计

2. 台式离心机

（二）材料

1. 叶片或根系 2. 磷酸氢二钠 3. 磷酸二氢钠 4. 盐酸羟胺 5. 对氨基苯磺酸 6. α-萘胺 7. 冰醋酸

（三）试剂

1. 0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

2. 10mM盐酸羟胺：称取0.05g盐酸羟胺用蒸馏水定容至100ml。

3. 17mM对氨基苯磺酸：称取0.2944g对氨基苯磺酸用冰醋酸溶液（冰醋酸：水=1：3）定容至100ml

4. 7mM a-萘胺：称取0.1002g萘胺用冰醋酸溶液（冰醋酸：水=3：1）定容至100ml。

【实验步骤】

1. 酶液提取

称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶-粗提液。

2. O2-产生速率测定

（1）取0.5ml提取液中加入0.5ml PBS(0.05M，pH7.8)，1ml 10mM盐酸羟胺溶液后摇匀，同时做一对照管以PBS代替样品提取液；

（2）在25℃下保温1小时，若测定叶片保温后需加入2ml乙醚萃取Chl；

（3）依次先加入1ml 17mM对氨基苯磺酸，再加入1ml 7mMα-萘胺，混合后涡旋；

苯甲酸(DTNB)反应生成黄色的5-硫-2-2硝基苯甲酸阴离子,在412 nm处有最大光吸收,测定该离子的浓度,即可计算出GSH减少的量。

由于上述反应在非酶条件下仍能进行,故计算酶活力时,必须扣除非酶反应所引起的GSH减少量。

【仪器、材料与试剂】（一）仪器

1. 分光光度计 2. 台式离心机 3．电子天平 4. 水浴锅

（二）材料

1．谷胱甘肽（GSH） 2．磷酸氢二钠 3．磷酸二氢钠 4. 三氯乙酸

5．5，5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB） 6．过氧化氢（H2O2） 7．柠檬酸 8．移液枪 9．陶瓷小研钵 10．离心管

11．5ml、100ml、1000ml容量瓶

（三）试剂

1．pH7.8磷酸缓冲液

A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。 0.05M pH7.8

A母液 228.75ml+ B母液21.25ml→定容至1000ml

2．1.0mmol/LGSH（当日配制） 3.07mgGSH用PBS溶解至10ml. 3．1.5 mmol/L H2O2（当日配制）取30% H2O215ul,以双蒸水定容至100ml 4．0.61 mmol/L的三氯乙酸（TCA） 5．0.32mol/L Na2HPO4

6．5，5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）显色液：DTNB20mg加1%柠檬酸三钠50mL溶解

【实验步骤】

加入酶提取液1.6mL，冰浴研磨匀浆，4000rpm,离心10min,取上清液再12000rpm，离心5min，上清液供酶活性测定用。取上述酶液0.4ml，分别注入酶管与非酶管，并将非酶管加热失活，分别加入1.0 mmol/LGSH 0.4mL和经37℃预热的H2O20.2mL，立即记时3min,再在2支试管中加入0.61 mmol/L的三氯乙酸（TCA）4mL，3000rpm,离心10min,保留上清液，另取2支试管分别加入上述上清液2.0mL；再取1支试管加入蒸馏水1mL和TCA1.6mL作空白管，并在以上3支试管中分别加入0.32mol/L的Na2HPO4 2.5 mL和5，5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）显色液0.5 mL（显色液内含有0.04%DTNB和1%柠檬酸三钠），反应5min,在412nm处比色读取光密度值。活性单位为umol-1g-1FW。标准曲线制作:

取1mrnol/LGSH溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00ml，以双蒸水稀释至10ml，即得到浓度为0、20、40、60、80、100umol/L的GSH标准液，取标准液各2.00ml，移入试管中，加0.32mol/LNa2HPO4溶液2.5ml和DTNB显色液0.5ml，反应5min于412nnl波长读取光密度(双蒸水调零)。以扣除非酶促反应后，在37℃反应每分钟每克蛋白使GSH降低1umol为一个酶活力单位，单位为umol/mg蛋白质·min。。 5.计算方法：

A=标准GSH（um）/标准GSH（OD412）即标准曲线的斜率

【参考文献】

Leopold F lohe，Wolfang AG.Assay of glutathione peroxidase in methods of Enzymology.1984,105:104-121.

十一MDAR(单脱氢抗坏血酸还原酶)活性的测定（Mustafa Erkan and Wen-Chi

Hou ,2008,1999 ）

MDAR提取：一般取0.2g材料于预冷的研钵中，分三次加入0.05mol/L（PH7.3）的磷酸钾缓冲液（预冷）1.8ml（难磨的材料可以加入适量的石英砂），在冰浴上研磨至匀浆，然后移到2.0ml的离心管（冲洗），于4℃12000r/min下离心20min，上清液即为MDAR粗提液，将其放入冰箱中备用（-20℃或-80℃，在液氮中迅速冷却）。 2.

MDAR的测定：酶活性的测定的反应体系包括： 2.7ml的预冷磷酸钾缓冲液（0.05mol/L，pH7.3）+0.1ml的NADH（0.2mmol/L）+0.1ml的ASA（1.0mmol/L）+0.001ml的AAO（1.0U）+0.1ml的酶提取液，以不加酶液的体系为对照，在340nm下测OD值的变化。

参考文献： Wen-Chi Hou, Hsien-Jung Chen, Yaw-Huei Lin，Dioscorins, the major tuber storage proteins of yam (Dioscorea batatas Decne), with dehydroascorbate reductase and monodehydroascorbate reductase activities，Plant Science, Volume 149, Issue 2, 3 December 1999, Pages 151-156

Mustafa Erkan, Shiow Y. Wang, Chien Y. Wang ，Effect of UV treatment on antioxidant capacity, antioxidant enzyme activity and decay in strawberry fruit，Postharvest Biology and Technology, Volume 48, Issue 2, May 2008, Pages 163-171

十二.可溶性总糖的测定

【实验原理】

实验采用蒽酮比色法测定可溶性总糖的含量。糖在硫酸作用下生成糖醛，糖醛与蒽酮作用形成绿色络合物，在一定范围内，颜色深浅与糖含量有关。在625nm波长下的OD值与糖含量成正比。方法简单，但没有专一性。

【仪器、材料与试剂】

（一）仪器 1. 分光光度计 2. 恒温水浴锅 3. 分析天平 4. 烘箱 5. 刻度试管（二）材料 1. 活性炭 2. 刻度试管、 3. 漏斗

4. 酒精（20%） 5. 植物叶片或种子

6. 滤纸

（三）试剂

1. 葡萄糖标准液：80℃烘箱烘至恒重的葡萄糖100mg，配成500ml溶液，即为200μg/ml的标准液，

2. 蒽酮试剂：100mg蒽酮溶于100ml稀硫酸（76ml浓硫酸加30ml水中）。 3. 酒精（20%）：20ml酒精溶解至100ml。

【实验步骤】

1. 可溶性糖的提取

各种植物叶片或种子在110℃烘箱中烘15min，然后调至70℃过夜。干叶片磨碎后称取50mg样品倒入10ml刻度试管内，加入4ml80%酒精，置于80℃水浴中不断搅拌40min，离心，收集上清液，残渣加2mll80%酒精重复提取2次，合并上清液。在上清液中加10mg活性炭，80℃脱色30min，定容至10ml，过滤后取滤液测定。 2. 显色及比色

吸取上述酒精提取液1ml，加5ml蒽酮试剂混合，沸水浴煮10min，取出冷却。在625nm处测OD值。从标准曲线上得到提取液中糖的含量。 3. 绘制标准曲线

取标准糖溶液将其稀释成一系列0-100μg/ml的不同浓度的溶液。按上述方法分别测定OD值，然后绘制标准曲线。

【参考文献】

1. Fairbairn N J. A modified anthrone reagent [J].Chem.and Ind., 1953(4):86

2. 中国科学院上海植物生理研究所，上海市植物生理学会. 现代植物生理学实验指南[M]. 北京：科学出版社， 1999. 127

十三. 葡萄糖、果糖、蔗糖和乳糖的测定

【实验原理】

糖类的测定方法种类甚多，常规的化学反应法只能测定总糖和还原糖，运用乙腈作为流动相，当其中所含的混合物（包含糖类）经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于混合物中各糖类组分在性质和结构上的差异，在流动相的作用下，不同糖类组分在固定相中的保留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出，实现分离。

【仪器、材料与试剂】

（一）仪器

1. 高效液相色谱仪 2. 高压泵

3. 示差折光检测器 4. 电子分析天平

5. 离心机（二）材料 1. 研钵 2. 10ml离心管 3. 100ml容量瓶 4. 0.45μm微孔滤膜（三）试剂 1. 果糖 2. 葡萄糖 3. 蔗糖

4. 乳糖以上均为分析纯 5. 乙睛为进口色谱纯 6. 超纯水

【实验步骤】

1. 将样品洗净、擦干、切碎、混匀。

2. 称取5.00g 于研钵中,加入5ml 的蒸馏水研磨匀浆，用10ml蒸馏水将匀浆全部移入离心管中,3000r/ min 离心5 min。

3. 离心液倒入干净试管中,再向盛有沉淀的离心管加入10ml蒸馏水并搅拌沉淀物,离心,合并离心液于100ml 容量瓶中,加蒸馏水稀释至刻度。 4. 稀释液再用微孔滤膜(0.45μm)过滤,备 HPLC 分析用。

5. 标准曲线的制定：精密配制4种糖组分的混合标准溶液,按上述操

作条件分离检测,以质量浓度(X ,g/L)为横坐标,色谱峰峰面积(Y)为纵坐标,绘制标准曲线,得4种糖组分标准曲线的回归方程及相关系数。

【注意事项】

1. 色谱分析时，折光示差检测器对环境的温度比较敏感 ,温度变化明显 ,基线会出现漂移或波浪起伏。故实验室的温度控制在 25±1℃,尽量避免大的变化。 2. 色谱条件根据具体实验情况设定。

【参考文献】

1. AOAC (Association of Official Analytical Chemists). Official methods of analysis of the AOAC (14th edition)[R]，AOAC，Arlington VA，1984

2. W.Schwald，R.Concin, G.Bonn，O.Bobleter. Analysis of oligomeric and monomeric carbohyd-rates from hydrothermal degradation of coton- wastematerials using HPLC and GPC [J]. Chromatographia, 1985,20(1): 35-40.

十四考马斯亮蓝G-250染色法测定可溶性蛋白含量

【实验原理】

考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465 nm，后者在595 nm。在一定蛋白质浓度范围内（1~1000 ?g），蛋白质与色素结合物在595 nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。

【仪器、材料与试剂】（一）仪器 1. 分光光度计

2. 台式离心机

（二）材料

1. 叶片或根系 2. 磷酸氢二钠 3. 磷酸二氢钠 4. 考马斯亮蓝G-250 5. 95％乙醇 6. 85%磷酸

（三）试剂

1. 0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

2. 考马斯亮蓝溶液：称取100 mg 考马斯亮蓝，溶于50 ml 95％乙醇中，加入100 ml 85％（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1L。在黑暗中静置2小时后用漏斗过滤并贮于棕色瓶中，常温下可在暗中保存一个月。

【实验步骤】

1. 酶液提取

称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为蛋白粗提液。

2. 酶活性测定

取100?l酶液，加入2.9ml考马斯亮蓝溶液，反应2min后测OD595。 3. 计算结果

蛋白质含量（mg/g）=（查得的蛋白质含量/ug×提取液总体积/ml）/（样品鲜重/g×测定时所用提取液体积/ml）

Protein content(mg/g)=(C/ug×VT/ml)/(W/g×Vs/ml×1000)

C为可溶性蛋白质含量（mg/g ），VT为提取液总体积（ml）；Vs为测定时所用提取液体积（ml）；W为样品鲜重（g）。

【注意事项】

还原物质，其他酚类物质及柠檬酸对此反应有影响。

【参考文献】

Arora R.,Wisniewski M.E.1994.Cold acclimation in genetically related(sibling)deciduous and evergreen peach:A 60-kDa bark protein in cold-acclimated tissue of peach is heat-stable and related to the dehydrin family of proteins.Plant Physiol.,105:95-101.

Brady,C.J.,Tung,H.F.:Rate of protein synthesis in senescing,detached wheat leaves.Aust.J. Plant Physiol.2,163-176(1975).

十五叶绿素含量的测定

【实验原理】

根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。叶绿素a、b在95％乙醇中最大吸收峰的波长分别为665nm和649nm，类胡萝卜素为470nm，可据此列出以下关系式：

Ca=13.95 A665－6.88 A649 Cb=24.96 A649－7.32 A665

Cx.c=（1000 A470－2.05 Ca－114.8 Cb）/245

式中：Ca、Cb分别为叶绿素a和b的浓度；Cx.c为类胡萝卜素的总浓度。试剂及配制： 95％乙醇

【仪器、材料与试剂】（一）仪器 1. 分光光度计

2. 电子天平

（三）试剂

95％乙醇

【实验步骤】

1. 取新鲜植物叶片（或其他绿色组织），擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。 2. 称取待测剪碎的新鲜样品0.1g（可调整），共3份，分别置于试管中。每个试管加入5ml 95％乙醇，使样品完全浸泡在乙醇溶液中。置于暗处浸泡24h后，进行比色测定。 3. 将叶绿素色素提取液倒入比色杯内，以95％为对照调零，在波长665nm、649nm和470nm下测定吸光度。

4. 按上面的公式分别计算叶绿素a、b和类胡萝卜素的浓度（mg/L），a+b即得叶绿素总浓度。求得色素的浓度后，再按下式计算组织中单位鲜重的各色素的含量：叶绿体色素的含量=（色素浓度×提取液体积）/样品鲜重单位mg/g

【参考文献】

Arnon D L. Copper enzymes in isolated chloroplasts, polyphenol oxidase in Brta vulgaris, Plant Phsiol., 1949,24:1-15.

十六.激素Indole-3-acetic Acid（IAA）、Abscisic Acid（ABA）、GA3和ZA的

测定

【实验原理】

植物激素可以被80%的甲醇浸提，通过减压蒸馏去除甲醇，水相中的部分杂质在石油醚萃取和PVPP吸附等环节中去除而植物激素得到保留。在酸性条件下水相中的IAA、ABA和GAs被乙酸乙酯萃取而CTKs不受影响，在微碱性条件下水相中的CTKs可被水饱和正丁醇萃取而得到分离。

【仪器、材料与试剂】

（一）仪器： 1. 液相色谱仪 2. 紫外检测器 3. 旋转蒸发仪 4. 真空泵 5. pH计 6. 离心机

（二）材料：

1. 生长素、赤霉素、脱落酸、细胞分裂素标准样品 2. 色谱甲醇

3. 石油醚（沸程30~60℃） 4. 乙酸乙酯 5. 水饱和正丁醇 6. 乙酸 7. 超纯水 8. PVPP 9. 液氮 10. 研钵 11. 15ml试管 12. 注射器 13. 超微滤膜 14. 分液漏斗（三）试剂：

1. 80%甲醇：80ml甲醇超纯水稀释至100ml 2. 1mol/L柠檬酸：21.014g超纯水定容至100ml 3. 0.5mol/L氢氧化钠：2.00g超纯水定容至100ml

4. 水饱和正丁醇: 将正丁醇和蒸馏水混合，振摇，混匀，放置过夜（可利用超声，这样不必过夜）。得到的混合液分层，上层为水饱和的正丁醇溶液，下层为正丁醇的饱和水溶液。

【实验步骤】

1、取样品1-2g弱光下用液氮研磨匀浆后，加入80%甲醇(体积ml是样品质量g的10倍)10ml，于4℃下浸提24h，4000rpm离心15min。

2、残渣再用10ml 80%甲醇浸提12h后，4000rpm离心15min。合并两次上清液，35-38℃下减压浓缩至原体积的1/3，用等体积石油醚萃取脱色三次，分液，醚相弃去。

3. 水相用磷酸缓冲液（NaH2PO3）调pH到8.0，加入0.4g PVPP，低温震荡30min，过滤。滤液用1M 柠檬酸调pH到2.8–3.0，加入等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相加压浓缩至干，用5ml甲醇溶出。经0.45μm有机系滤膜过滤，作为待测液HPLC检测。 4. 水相用0.5mol/L的NaOH调pH到8.0，等体积水饱和正丁醇萃取3次，合并3次正丁醇相，55—60℃加压浓缩至干，5ml甲醇洗出。经0.45μm有机系滤膜过滤，作为待测液HPLC检测。

5. 标准曲线的制作：称取IAA、GA3、ABA和ZA标准品各10 mg分别用甲醇定容于10 ml容量瓶中，作为母液（含量为1000 mg·L-1）。将此母液稀释成不同浓度梯度的溶液，将各

溶液在确定的色谱条件下进样，外标法计算峰面积，制作标准曲线。

【注意事项】

1、第一次减压浓缩时要控制提取液中甲醇的量，过多时萃取效果不理想，完全蒸掉只剩水相时又不易分层。

2、萃取过程中要振荡充分，分相清晰以及防止因渗漏造成的损失。

3、调节溶液pH值一般用弱酸、弱碱，注意滴加速度不能过快且须不断摇动，以免局部酸化引起某些激素破坏。

4、在用乙酸乙酷萃取时，注意提取液中的甲醉要彻底去除，否则影响分层。

【参考文献】

1. B. Fernández, M.L. Centeno, I. Feito, R. Sánchez-Tamés and A. Rodríguez, Simultaneous analysis of cytokinins, auxins and abscisic acid by combined inmunoaffinity chromatography, high performance liquid chromatography and inmunoassay, Phytochem. Anal. 1995 (6)：49–54. 2.陈昆松,徐昌杰,李方,等.HPLC法检测果实组织中内源IAA、ABA方法的改进[J].果树学报,2003,20(1):4-7

3.丁静,沈镇德,方亦雄,等.植物内源激素的提取分离和生物鉴定[J].植物生理学通讯,1979（2）:27-39

十七. 石蜡切片的制作

【实验原理】

石蜡切片法也是在研究植物细胞的形态结构等方面常用的制片方法。它可以使植物材料切成薄的薄片，又可以切成连续薄片，切片经染色，观察效果甚好。番红-固绿对染法，为植物制片上最普遍的一种二重染色法，其染色程序简单并能清晰地显示出细胞的结构。番红为碱性染料，能使细胞核及木质化的细胞壁染成红色；固绿为酸性染料，能使细胞质及纤维素的细胞壁染成绿色。活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其形态结构。

【仪器、材料与试剂】

（一）仪器 1. 石蜡切片机

2. 烘箱 3. 显微镜 4. 电热展片台（二）材料 1. 染色缸 2. 小培养皿 3. 镊子 4. 毛笔 5. 吸水纸 6. 纱布 7. 载玻片 8. 盖玻片 9. 纸盒 10. 酒精灯 11. 指形管 12. 圆刃解剖刀 13. 记号笔 14. 试管架（三）试剂

1. 10%番红溶液（85%酒精配制）：10g番红溶于100ml85%酒精； 2. 0.5%固绿（用95%的酒精配制）：0.5g固绿溶于100ml95%酒精； 3. 酒精（100%、95%、85%、75%、50%） 4. 二甲苯 5. 甘油 6. 中性树胶 7. 甲醛 8. 乙酸

9. 不同熔点的石蜡、

10. 蛋清甘油：鸡蛋清 50ml，甘油 50ml，水杨酸纳 1g，用蛋白与甘油搅拌，同时加入水杨酸纳，调匀过滤应用。

【实验步骤】

1. 取材

选取经过自己设计实验的对照和处理的材料的根、茎、叶的相同部位。 2. 固定和抽气

固定液为FAA（70℅酒精90ml+冰醋酸5ml+甲醛5ml），重复3次，材料的长和宽最

大不超过1cm，固定液为材料的20倍左右。将选取的材料分装两试管，加入固定液。固定时间24小时，其间要放入抽真空机中抽气15-30分钟至材料完全沉浸在固定液下面，并用铅笔写好标签。 3. 脱水、透明及渗蜡

将材料从固定液中取出后，其具体流程如下： A：酒精 X：二甲苯

75%A（1/2-3h）→85%A（1/2-3h）→95%A（1/2-3h）→100%A（1h）→100%A（1h）→2/3A+1/3X（2h）→1/2A+1/2X（1-3h）→1/3A+2/3X（2h）→X（2h）→1/2X+1/2蜡（过夜）→渗蜡1（2h）→渗蜡2（2h）→渗蜡3（2h）

设置浓度梯度是为了防止材料皱缩，但具体浓度梯度和浸泡时间要视材料情况而定，对于幼嫩的材料，梯度要大些，各步浸泡时间可短些，老的硬的梯度则要小些，各步浸泡时间则相应要长些。第二次100％A脱水很关键，一定要确保水脱尽。 4. 包埋

将渗蜡后的材料和石蜡一起倒入小纸盒（小纸盒折叠方法如下），用加热的镊子迅速把材料按需要的切面和一定的间隔排列整齐并使其竖直，倒入纯蜡进行包埋。稍微凝固后倒置于清水盆中彻底冷却凝固。

折纸盒按下列顺序折叠： (1) 折AA'及BB'； (2) 折CC'及DD'；

(3) 折CE'与AE'、向外夹出EE'。同样折出FF'，GG'及HH'；

(4) 使CE'E与E'IE两三角形相叠，并沿E'C和EI重叠的折痕向后转折。同样折其余三只角；

(5)折RIJF向外，同样折出GKLH，即折成所需的纸盒。

5. 修块

将包埋好的材料切割成小块，每个小块包含一个材料，并修成梯形，切面在梯形的上部。注意上部矩形对边平行，梯形底部用烧热的蜡将其固定在木块上。 6. 切片

将粘有蜡块的小木块至于切片机上，调整切距到适当大小，转动调节器条切片厚度12μm进行切片。注意切片时要一手转动切片机，另一手执毛笔将切下来的片子摊开以形成一长条蜡带。切片过程中，如果蜡带偏向一边，也要及时修正。 7. 烫片

滴一滴蛋白胶于干净载玻片中央，用干净的手指涂抹均匀后，滴上清水，将取下

的蜡带切成小段置于载玻片上（放上两至三段），然后将载玻片放到展片台上(保持40℃)烫片。

待充分烫平后用吸水纸吸去多余的水。烫片时要注意把握时间，不能烫片过度，但要保证充分烫平。 8. 烘片

将烫好的片子自然烘干，或45℃烤片箱干燥1~2天。 9. 脱蜡、染色、脱水、透明

将玻片标本放于100%X（15-30min)→100%X(1-2min)→50%X+50%A(1-2min)→100%A(1-2min)→95%A(1-2min)→85%A(1-2min)→番红（85%A配制）(2-4h)→85%A(3-5s）→95%A(3-5s）→固绿（100%A配制）(30s)→95%A(1-2min)→100%A(1-2min)→100%A(1-2min）→50%X+50%A(1-2min)→100%X(1-2min)→100%X(1-2min)

注意番红染色时间要长些（至少3h以上），随后的两次经过酒精的时间都应很短，以免洗掉染上的番红，固绿的染色时间大约在20-30s,其他各步的时间大约1至2分钟，均要视具体情况而定。 10. 封片

从二甲苯中取出然好色的片子，用中性树胶进行封片。注意封片用的该玻片要清洁，封片时要注意不要产生气泡。二．显微测量与分析方法

在显微镜下分别进行4×10倍和10×10倍观察各切片，并进行显微数码摄影。

【注意事项】

1.脱水应彻底，否则材料不能透明，影响石蜡的浸入，致使难以切片。

2.在低浓度或纯酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。 3.在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。 4.如需过夜，应停留在70%酒精中。

5.使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。

6.室温过高时，可将修好的蜡块放到冰箱中冷却一定时间。在夏季时可用冰块冷却刀和组织块，减少刀与组织块在过程中产生的热时，使石蜡保持合适的硬度以利于切片。 7. 切片时要及时清洁刀口、除去蜡屑，否则易引起破碎。

【参考文献】

1. 2.

李扬汉.蔬菜解剖及解剖技术(第一版)[M].北京:农业出版社,1991 王心钗.植物显微技术(第一版)[M].厦门:福建教育出版社,1986

十八 cDNA扩增片段长度多态性技术（cDNA-AFLP）

【实验原理】

AFLP技术是1993年由荷兰的Keygene公司科学家Zabean和Vos等创建的一种DNA指纹技术。Bachem等于1996年将AFLP技术应用于mRNA差异分析，发展成为一种mRNA指纹图谱技术，即cDNA-AFLP技术。cDNA-AFLP技术的基本原理：提取植物总RNA后，将模板mRNA逆转录成cDNA，两边同时利用2个分别识别6-bp和4-bp的限制性内切酶进行酶切，酶切片段同适宜接头连接，然后利用同接头互补的引物进行预扩增，再在引物3’末端加2～3个选择性碱基进行选择性扩增，即：引物=接头序列+酶切位点序列+2～3个随机核苷酸，以预扩增产物为模板，进行选择性扩增，最后在测序胶上展示可获得大小在100～1000bp之间的重复性好、清晰的条带以便直观地进行指纹图谱分析。

【仪器、材料与试剂】（一）仪器

1. 分光光度计 2. 台式离心机 3．电子天平 4．漩涡混合器 5．电泳仪 6．PCR仪

【实验步骤】

1．提取RNA

采用TaKaRa公司的RNAiso Reagent试剂盒提取。方法如下： ① 称取植物样品30mg。

② 液氮研磨，直至成粉末状。

③ 向研钵中加入1mL RNAiso Reagent，完全覆盖粉末，继续研磨裂解液成透明状。

④ 透明状液体转移至离心管中，室温静置5min，4℃，12000rpm离心5min.。吸上清液，移入新的离心管中，加入200μl氯仿，充分乳化溶液呈乳白状（无分相现象）后，再室温5 min。静置后离心，4℃，12000rpm离心15min。

⑤ 吸上清液，加入500μl异丙醇，室温下放置2min。接着4℃，12000rpm离心10min.，

离心后管底部有沉淀。

⑥ 小心弃去上清液，缓慢加入1mL75﹪乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管壁，4℃，12000rpm离心5min后小心弃去乙醇。

⑦ 室温干燥2-5 min后，加入40μl的RNase-free H2O溶解沉淀后-20℃保存。 2．RNA纯化

参照TakaRa公司的DnaseⅠ说明书去除RNA中的DNA，具体操作均在冰上完成。 ① 在1.5ml离心管中，加入下列试剂：DNase I Buffer 5μL；RNase Inhibitor 1μL；Rnase-Free DNaseI 3μL；DEPC水1μL；RNA溶液40μL；反应体系50μL。 ② 以上混合溶液在37℃温浴30 min。 ③ 水浴结束后，加入50μLDEPC水。

④ 加入等体积（100μL）水饱和酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），充分混匀，静置2min，4℃，12000rpm离心20min；

⑤ 将上清转移入干净的离心管中，加入1/10体积（10μL）的3 mol/L NaAc（PH5.2）和2.5倍体积（250μL）的预冷无水乙醇，混匀后，-70℃放置1~2 h（-20℃放置12 h），沉淀RNA。

⑥ 4℃,12 000 r/min离心20min。

⑦ 弃去上清，沉淀经75%乙醇洗涤沉淀2~3次，干燥后溶解于20μL DEPC水中。

3．双链cDNA的合成

合成方法具体操作如下：

① cDNA第一链的合成：取总RNA 10μl、2μl oligo-dT18V（1?g/μl）和10μl DEPC-ddH2O加入PCR管中混匀，65~70℃水浴5~10min，以促进mRNA和引物之间的退火。 ② 将以下体系试剂混匀后加入以上PCR管中混匀，加入2μl M-MLV（RNase H-）

200U/μl），稍微离心，在PCR仪上42℃温育1h进行逆转录，然后70℃温育10min，灭活逆转录酶，转移至冰上。

5×RT buffer 10μl DTT（0.1mol/L） 5μl dNTP（10 mmol/L） 5μl RNase Inhibitor（40 U/μl） 1.5μl DEPC-ddH2O 6.5μl ③ cDNA第二链的合成：以下试剂混匀后加入合成第一链的PCR管中

MgCl2（10mmol/L） 70μl Tris-HCl（1mol/L,pH7.4，37℃） 10μl （NH4）2SO4（1mol/L） 1.5μl RNaseH(10 U/μl) 1μl E.coli DNA PolymeraseⅠ(10 U/μl) 4.5μl DEPC-H2O 10μl

温和振荡混合反应液，在PCR仪上16℃温育3 h。温育结束后，将1μl β-NAD(50 mmol/L)和1μl大肠杆菌DNA连接酶(1～4U/μl)加到反应混合液中,室温放置15 min。反应液转入

1.5mL离心管中，用等体积酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)、氯仿/异戊醇(24/1)各抽提1次。加入10μl 3 mol/L NaAc(pH5.2)和250μl无水乙醇, -20℃下静置30～60 min。在4℃，12000 r/min下离心10 min，回收沉淀，用250μl 75%的乙醇洗2次。加入30μl TE(pH 7. 6)溶解cDNA在 -20℃保存。

4．接头和引物的合成

各引物序列详见下表。

名称序列接头： AseI 5’-GCGTAGACTGCGTACC-3’ AseI 5’-TAGGTACGCAGTC-3’ TaqI 5’-GACGATGAGTCCTGAC-3’ TaqI 5’-CGGTCAGGACTCAT-3’

预扩增引物：

A3 5’-CTCGTAGACTGCGTACCTAAT-3’ T3 5’-GACGATGAGTCCTGACCGA-3’

选择性扩增引物：

A8 5’-GACTGCGTACCTAATAG-3’ A9 5’-GACTGCGTACCTAATAA-3’ A10 5’-GACTGCGTACCTAATAT-3’

A11 5’-GACTGCGTACCTAATAC-3’ A12 5’-GACTGCGTACCTAATTG-3’ A13 5’-GACTGCGTACCTAATTA-3’ A14 5’-GACTGCGTACCTAATTT-3’ A15 5’-GACTGCGTACCTAATTC-3’ T4 5’-GATGAGTCCAGACCGAGG-3’ T5 5’-GATGAGTCCAGACCGAGA-3’ T6 5’-GATGAGTCCAGACCGAGT-3’ T7 5’-GATGAGTCCAGACCGAGC-3’ T8 5’-GATGAGTCCAGACCGAAG-3’ T9 5’-GATGAGTCCAGACCGAAA-3’ T10 5’-GATGAGTCCAGACCGAAT-3’ T11 5’-GATGAGTCCAGACCGAAC-3’

5． cDNA双酶切

使用限制性内切酶TaqⅠ和VspⅠ对cDNA进行双酶切，以便加上接头。

TaqⅠ酶切：cDNA20μl，TaqⅠ10U，Bueffr（10×）4μl，BSA（10ug/μl）0.4μl，加水至40μl，

混匀后65℃温浴1.5小时。

VspⅠ酶切：TaqⅠ酶切物40μl， VspⅠ10U，Buffer（10×）1μl，BSA（10ug/μl）0.1μl，

加水至50μl，混匀后37℃温浴1.5小时。

6．接头连接

按下面体系加入各反应成分：

cDNA酶切物 50μl TaqⅠ接头 1μl VspⅠ接头 1μl ATP（10mM） 0.5μl T4DNA Ligase（3U/μl） 0.8μl Ligase Buffer（10×） 5.9μl 总体积59μl，各反应成分混匀后，37℃反应2h。

7．预扩增

cDNA酶切片断加上接头后，使用预扩增引物进行一次PCR扩增。扩增体系与反应条件如下：

初级模板(加接头的cDNA片段) 10μl 预扩增引物1 1μl 预扩增引物2 1μl dNTPs（四种成分各10mM） 1.5μl PCR Buffer（10×） 5μl MgCl2（25mM）4ul 4μl Taq DNA Polymerase（5u/μl ） 0.5μl 超纯水 27μl 总体积50μl，各反应成分混匀后进行PCR扩增，扩增参数为：94℃，30s；（94℃，30s，55℃，30sec，72℃，1min）×25；72℃，5min。

8．预扩产物的选择性扩增

TaqⅠ选择性扩增引物：5’-GATGAGTC-CAGACCGANN-3’ VspⅠ选择性扩增引物：5’-GACTGCGTACCTA-ATNN-3’ N代表ATCG中任意一种。选择性扩增体系如下：

预扩增后模板（1ng/μl) 5μl PCR Buffer(10×) 2μl Taq DNA Polymerase(5U/ul) 0.2μl MgCl2(25mM) 1.6μl

dNTPs 0.5μl 引物1（A7-A14） 1μl 引物2（T4-T11） 1μl 超纯水 8.7μl 具体热循环参数如下：94℃，30 s；(94℃，30s；65℃，30s（-0.7℃/cycle) ，72℃，1min ) ×11；( 94℃，30s ，56℃，30s ， 72℃，1min ) ×24；72℃，5min。

9．聚丙烯酰胺凝胶电泳

① 洗板：用清洗液将电泳槽两块玻璃板彻底洗净；依次用自来水和蒸馏水冲洗干净晾干；用吸水纸沾取75%酒精擦洗后晾干； ② 涂板：

Repel配制（涂短板）：3ml氯仿+300μLrepel（汽车防雾剂） Binding配制（涂长板）：3ml无水乙醇+10μLBinding+10μL冰醋酸

分别用少许反硅化剂（3ml无水乙醇+10μLBinding+10μL冰醋酸）和硅化油（3ml氯仿+300μLRepel）均匀迅速地涂抹长短板；室温晾干至少30分钟；

③ 装板：将边条和梳子洗净擦干后，长板在下，短板在上，边条对齐置于接触的两边；两边用长尾夹对称夹紧，用梳子试好松紧后并调整板面水平。 ④ 制胶：

Arc:Bis12ml＋ddH2O10ml＋10×TBE 6ml＋尿素25.9g，ddH2O定容至60ml后，置于4℃冰箱预冷，用时加入312?l 10% AP＋84 μl TEMED

称取25.9g尿素，加入6ml 10×TBE缓冲液，12ml Arc：Bis(19:1)，搅拌水浴溶解，用蒸馏水定容至60ml后，置于4℃冰箱预冷；

⑤ 灌胶：加入84μl TEMED和312μl 10% APS，迅速摇匀后置于冰板上防止凝固；连续迅速地倾倒凝胶溶液到达玻璃板底部；

⑥ 插梳子：立即将梳子插在玻璃板中间，注意不要产生气泡；凝固3~4小时（或过夜）。 ⑦ 样品变性：测序胶电泳之前，在PCR产物中加5μL 6×Loading Buffer于PCR仪95℃持续变性5min，立即冰浴5min。

⑧ 预电泳：上下槽缓冲液1×TBE，恒定功率65W，待板温上升至50~55℃，约需0.5h。 ⑨ 电泳：点完样后继续电泳直至二甲苯青距板底10cm，1.5~2h。 ⑩ 染色：

卸下电泳装置后按以下流程立即将凝胶板染色：固定：200ml冰醋酸用蒸馏水定容至2L

将胶板浸入10%醋酸的固定液中，并于脱色摇床上缓慢振荡20~30min至二甲苯青指示带颜色褪尽，亦可静置于固定液中保存过夜

洗胶：凝胶从固定液中取出后，放入超纯水中振荡洗涤约3min，重复一次染色：2L蒸馏水＋2.4g AgNO3＋3.6ml甲醛

将洗涤后的凝胶板转入染色液（黑暗中放置）中，振荡染色30min 显影：72g Na2CO3＋2 L蒸馏水＋3.6ml甲醛＋480ul Na2S2O3溶液

染色后的凝胶板于超纯水中快速浸洗5~10s，沥干后放入预冰的显影液中，缓慢振荡

停显：200ml冰醋酸用蒸馏水定容至2L

待DNA条带清晰可见后，直接加入停影液（固定液）使之停止显色反应，振荡2~3min后取出凝胶板

洗胶：用超纯水振荡清洗胶板干胶：将凝胶板自然风干，摄像保存

10×TBE配制：108gTris碱 + 54g硼酸 + 40ml 0.5mol/L EDTA(PH8.0)

用蒸馏水定容至1L.

Arc：Bis(19：1)配制：57g Arc + 3g Bis(加热溶解) ，用蒸馏水定容至200ml,过滤。

10 AFLP多态性片段的回收，纯化 10.1差异片段的回收

在观片灯下观察聚丙烯酰胺凝胶电泳胶板并找到目的条带，用锋利的刀片将条带割下，放入已灭菌的EP管中，用封口膜封口，置于沸水中煮15min后,拿出冷却3-5min后，12000rpm离心10min，取上清液，-20℃保存备用。 10.2异条带的二次扩增

以差异条带回收液为模板，以相应的选扩引物组合重新扩增，其他试剂与扩增程序与选扩所用完全相同。选扩结果在1.2%琼脂糖电泳检测。如是一条带并且和在变性聚丙烯酰胺凝胶上的分子量一样，则可直接用于连接，否则使用试剂盒在琼脂糖凝胶回收目的条带。 10.3回收条带的纯化及再次扩增

将琼脂糖胶上的目的条带割下，使用琼脂糖胶回收试剂盒按照其使用说明书回收DNA。取5μl用于检测。如仍是相同位置的条带，-20℃保存用于连接。 10.4与载体的连接和转化及测序

将回收的DNA取2μl与载体PMD-T18连接。连接体系如下：

模板 2μl PMD-T18 0.5μl

Solution I 0.5μl

将连接产物加入感受态，置于冰上，冰浴半小时。接着放入42℃水中热激90s，再放置于冰上2-5min，于EP管中加入1ml LB液体培养基，100rpm，37℃的条件下摇床上摇1h。到时取出8000rpm离心1min，去上清1ml后，余下的液体用移液枪吹打浑浊。吸取后涂板，晾制2-3min，封口，倒置，37℃过夜培养。挑取单一菌溶入已加入氨卞的LB中，在摇床上过夜。第二天从菌液中吸取1μl做模板检测，送剩余菌液测序。

【参考文献】

Bachem C W B,Van derHoeven R S,De Bruijn S M,et al．Visualization of differential gene

expression using a novel method of RNA fingerprinting based on AFLP:analysis of gene expression during potato tuber development．Plant J,1996,9(5):745-753.

十九 3′/5′RACE 扩增基因全长

SMARTTM 3‘-RACE的原理是:利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连

【实验原理】

有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。然后用一个基因特异引物GSP1(gene specific primer,GSP)作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3‘末端的DNA片段扩增出来。

SMART TM 5‘-RACE的原理是先是利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以

Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA。利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5‘末端时自动加上3一5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头(figure 2 )。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作为上游引物，用一个基因特异引物2(GSP 2 genespecific primer,GSP)作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5‘末端的cDNA片段扩增出来。最终，从2个有相互重叠序列的3' / 5‘-RACE产物中获得全长cDNA，或者通过分析RACE产物的3‘和5‘端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA

我们在实验中发现，要做好RACE反应实验不容易，实际操作中仍存在不少困难。因此，对RACE反应条件进行反复摸索是实验必须要做地。这是因为:第一，在5‘-RACE包含了有3个连续的酶反应步骤(反转录、同聚物加尾和PC R扩增)，每一步都可能导致失败;第二，扩增。DNA末端的特异性完全依赖锚定引物及扩增DNA模板样品不均一性，因而特异性一般很低，常呈现不清晰的成片条带或截短的产物背景。因此，使用RACE技术扩增得到的特异末端片段，所获得的重组克隆最好能够全部测序，以排除RACE实验结果中扩增产物假阳性和假阴性，最终有可能获得新基因的全序列。随着RACE技术日益完善，目前己有商业化RACE

技术产品推出，如CLONTECH的MarathoTM技术和SMART TM RACE技术术。本章介绍的为Investigation 的RACE技术。

RT-PCR及RACE技术

RT-PCR获得基因片段 ←

GSP4

←

GSP3

→ GSP1

→ GSP2

5′RACE 3 ′ RACE

full length cDNA

3′RACE原理图

5′RACE原理图

【仪器、材料与试剂】 3.1.材料与方法

3.1.1 材料

3.1.1.1 植物材料

供试材料为不结球白菜（Brassica campestris ssp.chinensis）抗寒品种043，由南京农业大学白菜课题组提供。 3.1.1.2 菌株与质粒

大肠杆菌菌株JM109由本实验室保存，质粒载体pMD18-T购自TaKaRa公司。 3.1.1.3 各种酶类

Taq DNA聚合酶购自上海申能博采公司，RNase Free DNaseⅠ、T4 DNA连接酶、RNA酶抑制剂等均购自TaKaRa公司。 3.1.1.4 试剂盒

Agarose Gel DNA Purification kit、AMV反转录试剂盒购自TaKaRa公司。5＇/3＇RACE试剂盒购自Invitrogen公司。 3.1.1.5 常用储液

X-gal(20mg/ml)储液的配制：0.2克X-gal溶于10ml的二甲基甲酰胺，分装于1.5ml的eppendorf管中，外包铝箔，储存于-20℃。

IPTG储液（24mg/ml）的配制：10ml蒸馏水中溶解240mg IPTG后，用0.22 μm滤膜过滤除菌，分装于1.5ml的eppendorf管中，储存于-20℃。

LB培养基：1% Tryptone，0.5% Yeast extract，1% NaCl，pH7.0（固体培养基另加1.5%的琼脂粉）。

DNA提取缓冲液：83.5mmol/L Tris-HCl（PH8.0），1.17mol/L NaCl，16.7mmol/L EDTA（PH8.0），2%（W/V）CTAB，15μl/mL β-巯基乙醇（临用前加入）。

TE缓冲液（PH 8.0）：10mmol /L Tris-HCl，1mmol/L EDTA。

3.1.2 方法

3.1.2.1 材料的准备

将不结球白菜播种于装有灭菌基质的穴盘中，置于人工气候箱内培养，每日25℃光照培养14hr，20℃下暗培养10hr。幼苗两片真叶时，4℃冷诱导8hr，提取叶片总RNA。 3.1.2.2 总RNA的提取

采用Bioflux公司Simply P Total RNA Extraction Kit提取试剂盒提取总RNA。 ①取0.05g的新鲜叶片，在液氮中研磨，加入600μL R2溶液，移入1.5ml的离心管中。 ②涡旋仪上涡旋1min，静置2 min。 ③4℃ 12000rpm离心1min。

④将试剂盒中的Spin Column管安置于Collection Tube上。

⑤上清液转移到试剂盒中的Spin Column管中，12000rpm离心1min，弃滤液。 ⑥4℃ 12000rpm离心1min。

⑦将600μL Wash Buffer 加入Spin Column中，4℃ 12000rpm离心1min，弃滤液。 ⑧将600μL Wash Buffer 加入Spin Column中，4℃ 12000rpm离心2min，弃滤液。 ⑨将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入20μL的DEPC水，室温静置1min。 ⑩4℃ 12000rpm离心1min洗脱RNA。 3.1.2.3 sscDNA的合成

2.1.2.3 去除总RNA中痕量DNA污染

参照RNase Free DNaseⅠ（TaKaRa）说明书。 ① 在微量Tube中配制下列反应液，全量50μL。

全RNA 20-50μg 10×DNase Ⅰ Buffer 5μL DNase Ⅰ (RNase-free,5U/μL) 2μL RNase Inhibitor (40 U/μL) 0.5μL DEPC处理水 up to 50μL ② 37℃反应20-30min。

③ 加入50μL的DEPC处理水。

④ 加入100μL(等量)的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，充分混匀。 ⑤ 离心，取上层(水层)移至另一微量离心管中。

⑥ 加入100μL(等量) 的氯仿/异戊醇(24:1) ，充分混匀。 ⑦ 离心，取上层(水层)移至另一微量离心管中。 ⑧ 加入10μL(1/10量)的3M NaAC(pH5.2)。

⑨ 加入250μL(2.5倍量)预冷的无水乙醇，-20℃放置30~60min。

⑩ 离心回收沉淀，用70%的冷无水乙醇洗沉淀，真空干燥。用适量的DEPC水处理水溶解后，进行琼脂糖电泳确认是否除去基因组DNA。

2.1.2.4 sscDNA的合成

RT反应参照大连TaKaRa生物公司的TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver. 2.1 试剂盒说明书进行。反应体系如下：

10×RT Buffer 1 μL MgCL2 (25mM) 2μL dNTPs (10 mM each) 1 μL RNase Inhibitor 0.25μL AMV Reverse Transcriptase XL (5U/μL) 0.5μL Oligo dT-Adaptor Primer (2.5pmol/μL) 0.5μL 实验样品RNA 1 μL RNase Free dH2O up to 10μL 反应程序为： 30℃ 10min 42℃ 30min

99℃ 5min 1Cycle 5℃ 5 min

3.1.2.4 引物的设计

特异引物参照拟南芥CBF3（AF074602）保守区设计引物FCBF和RCBF 。根据扩增得到的中间片段设计5'/3' 引物，由上海英杰及上海Sangon生物工程公司合成（表3-1）。 3.1.2.5 PCR扩增

以不结球白菜冷诱导8h的叶片cDNA为模板，利用特异引物FCBF和RCBF进行PCR扩增，以反转录的cDNA为模板进行扩增，反应体系参见第二章，引物为FCBF和RCBF，退火温度为55℃。扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像分析系统进行拍照及分析。

表3-1 BrCBF基因特异引物

Table 3-1 Primer for the cloning of BrCBF

实验编号 FCBF RCBF CBF3'GSP1 CBF3'GSP2 CBF5'GSP1 CBF5'GSP2 3′ AP 3′ AUAP 5′AAP 5′AUAP 引物序列 5'- CAAACCGCTGAGATGGCAGCTCG-3' 5'- TGTACGGACGGAAGCGGCAAAAG-3' 5' -TTATGCGGACTCGGCTTGGCG-3' 5' -CTGAGAAAAGTGATGTGACGATGC-3' 5' -AAAGCATT CCTTCCGCCATAC-3' 5'-TCAGCAGCA GCCTTCTGGATA-3' 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3' 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3' 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3' 3.1.2.6 3＇RACE

sscDNA的合成参见第二章，引物为3′ AP，其它条件相同。

根据已获得的不结球白菜CBF基因中间片段测序结果，设计两条正向嵌套引物CBF3′GSP1和CBF3′GSP2，分别与通用引物3′ AUAP进行巢式PCR扩增。第一轮PCR产物稀释10倍作为模扳进行第二轮巢式扩增。

①第一轮PCR反应体系及扩增程序如下：

10×Tag Buffer 4μL MgCl2 (25mM) 3μL Tag(5U/μL) 0.25μL CBF3′GSP1 10 pmol 3′ AUAP 10 pmol cDNA模板 5μL ddH2O up to 50μL PCR反应程序如下：

94℃ 5min 94℃ 30sec 78℃(每循环降0.5℃) 30sec 10Cycle 72℃ 1min 30sec

94℃ 30sec

61.5℃ 30sec 30Cycle 72℃ 1min 30sec 39

72℃ 10min ②第二轮PCR反应体系及扩增程序如下：

10×Tag Buffer 5μL MgCl2 (25mM) 3μL dNTPs (2.5mM) 3μL Tag(5U/μL) 0.5μL CBF3′GSP2 20 pmol 3′ AUAP 20 pmol 模板 2μL ddH2O up to 50μL PCR反应程序如下：

94℃ 5min 94℃ 30sec

63℃ 30sec 38Cycle 72℃ 1min 30sec 72℃ 10min

扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像分析系统进行拍照及分析。 3.1.2.7 5＇RACE

3.1.2.7.1 1st Strand cDNA的合成

①按下列组成配制反转录反应液。 RNA 2μl 3′AP 10pml ddH2O up to 15μl ②70℃ 5min，冰上放置5min。 ③在①中加入以下反应液。

M-MLV 5×Reaction Buffer 5 μL dNTPs (10 mM each) 1.25 μL RNase Inhibitor 0.625μL M-MLV RT 1 μL RNase Free dH2O up to 25μL ④42℃ 60min。 3.1.2.7.2 cDNA的纯化

①先将Wizard DNA Clean-Up Resin 37℃ 温育10min，冷却至25-30℃待用。

②在3.1.2.7.1中加入75μL水，再加入1ml Wizard DNA Clean-Up Resin，充分混匀。 ③将Syringe Barrel与Luer-Lok连接，将②中混合液加入到Syringe Barrel中，真空抽

滤。

④在Syringe Barrel中加入2ml 80%的异丙醇，真空抽滤。

⑤丢弃Syringe Barrel，将Luer-Lok与1.5ml管连接，在Luer-Lok中央加入50μL DEPC水，静置1min。 ⑥1000rpm离心30sec。 3.1.2.7.3 cDNA的末端加尾

①按下列组成配制反转录反应液。纯化cDNA 25μL 5×TDT反应缓冲液 10μL 0.1%BSA 5μL 100mMdCTP 0.25μL ddH20 up to 50μL ②94℃ 3min，冰上放置5min。 ③在②反应液中加入1μL TdT酶。 ④37℃反应30min，65℃ 10min灭活TdT。 3.1.2.7.4 1st PCR反应

① 按下列组成配制1st PCR反应液(模扳为3.1.2.7.3中的cDNA末端加尾产物)。 10×Tag Buffer 2.5μL MgCl2 (25mM) 1.5μL dNTPs(2.5mM) 1.5μL Tag(5U/μL) 0.25μL CBF5′GSP1 10 pmol 5′ AAP 10 pmol cDNA模板 1μL ddH2O up to 25μL ②PCR反应程序如下：

94℃ 5min 94℃ 30sec

63℃ 30sec 35Cycle 72℃ 1min 30sec 72℃ 10min

3.1.2.7.5 第二轮PCR反应体系及扩增程序如下：

① 按下列组成配制2nd PCR反应液(模扳为3.1.2.7.4中的1st PCR产物稀释10倍)。

Tag Buffer (Mg2+ Plus) 5μL

MgCl2 (25mM) 3μL dNTPs (2.5mM) 3μL Tag(5U/μL) 0.5μL CBF5′GSP2 20 pmol 5′ AUAP 20 pmol 模板 2μL ddH2O up to 50μL ②PCR反应程序如下：

94℃ 5min 94℃ 30sec

58℃ 30sec 38Cycle 72℃ 1min 30sec 72℃ 10min 3.1.2.8 目的片段的回收及克隆 2.1.2.9.1 目的片段的回收

目的片段的回收按照TaKaRa生物公司的Agarose Gel DNA Purification kit Ver2.0试剂盒的使用说明进行。

2.1.2.9.2 感受态大肠杆菌JM109的制备

①取-20℃甘油冻存的大肠杆菌JM109 100uL，于5ml LB 液体培养基中培养（37℃，250rpm）过夜；

②取过夜培养的大肠杆菌 2ml于50ml LB的液体培养基中，37℃，250rpm培养2小时左右；

③4℃，4000rpm，离心10min，弃上清，沉淀重悬于10ml 0.1mol/L CaCl2(4℃)，冰浴30min； ④4℃，4000rpm，离心10min，弃上清，沉淀重悬于2ml的0.1mol/L CaCl2； ⑤分装于1.5 ml 离心管（200uL/管），4℃过夜备用。 2.1.2.9.3 重组质粒的构建

参照TaKaRa生物公司的pMD18-T kit提供的方法，向10μL的反应总体积中加入1μL pMD18-T vector，4μL 回收并纯化的DNA片段以及5μL Ligation solution Ⅰ，于16℃连接过夜。

2.1.2.9.4 重组质粒的转化

①将10μL上述连接液加入到感受态JM109中，轻轻混匀，冰浴30min； ②42℃热激 90s，迅速冰上冷却3min；

③加入37℃预热的LB液体培养基400μL，置37℃摇床，100rpm复苏45-60min；

④涂抹于含100μg/ml 氨苄青霉素的LB固体培养基(临用时表面涂抹X-gal 20mg/ml 40ul+IPTG 24mg/ml 30μL)上；

⑤37℃倒置培养12~14 hr，长出的白色菌落可能为含有重组质粒的转化子。 2.1.2.10 重组质粒的鉴定

以菌液为模板，利用特异引物FBrCOR和RBrCOR进行PCR扩增，反应体系为25μL，其中加入10 ×Taq plus buffer 2.5μL, 25mmol/LMgCL21.5μL ,10 mmol/L dNTP 1μL, 10μmol/L正向引物1μL, 10μmol/L反向引物1μL, 菌液1μL, 灭菌H2O 16.75μL, Taq plus DNA polymerase 0.25μL (5 U /μL) 。PCR反应参数为94℃预变性5min, 随后94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 1 min, 38个循环后, 72℃再延伸10 min。扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像分析系统进行拍照及分析。 2.1.2.11 序列测定及分析

序列测定由上海英杰生物科技公司在ABI 377测序仪上进行；相似性比较在NCBI站点上用BLAST完成；多序列比较利用BioEdit及DNAman软件完成；利用SMART进行蛋白的结构域分析。

超氧阴离子(O2-·)产生速率、过氧化氢(H2O2)、丙二醛(MDA)含量的上升，增加了超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)以及AsA-GSH循环中抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽还原酶(GR)的活性，提高了抗氧化物质抗坏血酸(AsA)、还原型谷胱甘肽(GSH)的含量，对单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)活性没有影响

二十根系活力的测定（TTC法）

一、原理

氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲腙，生成的三苯甲腙比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。二、材料、设备仪器及试剂

（一）材料：水培或砂培小麦、玉米等植物根系。

（二）仪器设备：1）分光光度计；2）分析天平（感量0.1mg）；3）电子顶载天平（感量0.1g）；4）温箱；5）研钵；6）三角瓶50ml；7）漏斗；8）量筒100ml；9）吸量管

10ml；10）刻度试管10ml；11）试管架；12）容量瓶10ml；13）药勺；14）石英砂适量；15）烧杯10ml、1000ml。

（三）试剂：1）乙酸乙酯（分析纯）；2）次硫酸钠（Na2S2O4），分析纯，粉末；3）1%TTC溶液：准确称取TTC1.0g，溶于少量水中，定容到100ml，用时稀释至各需要的浓度；4）磷酸缓冲液（1/15mol·L-1，pH7）。5）1mol·L-1硫酸：用量筒取比重1.84的浓硫酸55ml，边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000ml；6）0.4mol·L-1琥珀酸：称取琥珀酸4.72g，溶于水中，定容至100ml即成。

三、实验步骤

1）TTC标准曲线的制作：取0.4%TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中，加少许Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的甲月替。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲月替25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。

2）称取根尖样品0.5g，放入10ml烧杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1～3h，此后加入1mol·L-1硫酸2ml，以停止反应。（与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，其他操作同上）。 3）把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3～4ml和少量石英砂一起在研钵内磨碎，以提出甲月替。红色提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二、三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量

四、结果计算

四氮唑还原强度（mg·g-1根鲜重h-1）＝四氮唑还原量（mg）根重（g）×时间（h）

植物根系活力的测定---甲烯蓝法

2009年06月14日星期日 9:33 植物根系活力的测定

植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和活力水平直接影响地上部的营养状况及产量水平。本实验学习测定根系活力的甲烯蓝法。【原理】

根据沙比宁等的理论，植物对溶质的吸收具有表面吸附的特性，并假定被吸附物质在根系表面形成一层均匀的单分子层；当根系对溶质的吸附达到饱和后，根系的活跃部分能将吸附着的物质进一步转移到细胞中去，并继续产生吸附作用。在测定根系活力时常用甲烯蓝

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