利用酵母菌生产蛋白质

《生命科学文献与论文写作》课程论文

利用酵母菌生产蛋白质

摘要：蛋白质在细胞和生物体的生命活动过程中，起着十分重要的作用，是生命机体几乎所有重要活动的承担者。酵母菌应用于生物领域由来以久。6000年来人们用这种微小的真菌制作面包、啤酒和酒。现今用于直接治疗疾病的人类蛋白质的生产，已经成为一个每年有着190亿美元产值的产业。但是这种生物大分子目前却不能大批量的生产。它们大都是费时费力的从培养皿中培养的动物（如中国仓鼠）细胞分泌提取的。基因工程研究人员发现了一种用低等的酵母菌来生产人类蛋白质的新技术。这种技术开辟了一条大量生产生物药品的新途径。酵母菌能够用来生产复杂的人类糖蛋白，这种技术对于治疗用人类蛋白的生产有着革命性的意义。更好、更便宜、更快、更安全，并提供了一个对产品的最终质量进行控制的手段。作为宿主的酵母最常用的是毕赤氏酵母和酿酒酵母。 关键词：酵母菌;生产;蛋白质

Production of proteins using the yeast

Abstract: Protein in cells and organisms of biological processes, play an important role in almost all major life activities of the body bearers. Yeast used in long-standing biological field. 6000 years, people in this tiny fungus make bread, beer and wine. Direct treatment of disease for the current production of human proteins, has become an annual output of 19 billion U.S. dollars with the industry. But this biological macromolecules present but not mass production. They are mostly time-consuming and labor-intensive culture of animals from the culture dish (such as Chinese hamster) cells extracted.

Genetic engineering, researchers found a low of yeast used to produce human proteins in the new technology. This technology has opened up a lot of new ways to produce bio-pharmaceuticals. Yeast can be used to produce complex human glycoproteins, the technology for the production of therapeutic human proteins have a revolutionary significance. Better, cheaper, faster, more secure, and provides a product's final quality control means. The most commonly used yeast as the host is Pichia pastoris and Saccharomyces cerevisiae. Keywords:yeast;produce;protein

蛋白质是生命机体几乎所有重要活动的承担者。生物的结构和性状都与蛋白质有关。蛋白质还参与基因表达的调节，以及细胞中氧化还原、电子传递、神经传递乃至学习和记忆等多种生命活动过程。在细胞和生物体内各种生物化学反应中起催化作用的酶主要也是蛋白质。许多重要的激素，如胰岛素和胸腺激素等也都是蛋白质。

酵母菌具有丰富的酶系，生命力旺盛，生产能力高。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为最简单的真核生物，结构简单，生活周期短，DNA含量低，并已完成全基因组的测序，建立了基因组文库等各种分子遗传手段，操作简单易行，是研究基因功能理想的模式生物。另一方面，作为典型的真核生物，酵母和人类在某些蛋白质的氨基酸顺序上具有极大的相似性，如泛酸(ubiquitin)有96%相同，肌动蛋白（actin）有89%相同，因此其遗传学研究为人类提供了很好的借鉴作用。

细菌分泌蛋白质几乎不发生糖基化作用。诸如酵母菌的真核微生物则可能是高等生物基因表达的较好受体。糖基化作用通常有利于保证蛋白质进行适当的折叠，从而保护蛋白质免受蛋白酶的降解作用。糖基化作用是将寡糖连接到一个蛋白质分子上，是真核生物的细胞在进行基因产物生产时最重要的一种翻译后修饰。

此外，酵母基本上不含内含子，因此，它不会对哺乳动物内含子序列加以修饰。若要使一种哺乳动物的蛋白得以表达，最保险的办法是采用没有内含子的基因，即以目的基因的成熟mRNA为模板合成cDNA，再利用这个cDNA拷贝作为模板。

酵母可以在简单又廉价的培养基上生长并达到高浓度。更重要的是酵母的细胞组分和代谢物对人体是无毒的。

综上，酵母菌是生产蛋白质比较合适的受体选择。

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图1 基因工程药物生产示意图

1.DNA导入酵母细胞

目前菌种选育常采用自然选育和诱变育种等方法，带有一定的盲目性，尚属于经典育种的范畴。随着微生物学、生化遗传学的发展，出现了转化、转导、接合、原生质体融合、代谢调控和基因工程等较为定向的育种方法。转化是对酵母而言唯一具有使用价值的DNA导入方式。

2.酵母的克隆载体

酵母的克隆载体按照复制形式分为以下五种类型：整合型载体(yeast integration plasmid，YIP)、自主复制型载体(yeast replicating plasmid，YPP)、酵母着丝粒质粒(yeast centromeric plasmid，YCP)、酵母附加体型载体(yeast episomal plasmid，YEP)及酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)等。

图2 质粒载体的定向克隆

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3.酵母中外源基因表达的增效作用

酵母细胞中设计外源基因产物表达体系时应考虑一下几点：

3.1 质粒拷贝数

要使克隆基因最大限度的表达，最好选择高拷贝的Yep族质粒作为载体。 3.2 启动子序列

由于外源基因起始位点的启动子在酵母细胞中不能很有效的表达，所以，外源基因的编码序列通常是插入到一个高活性的酵母启动子后面。 3.3 转录终止和mRNA的聚腺苷酰化作用

高等动物转录终止一般出现在编码下游很远的地方。转录终止后，新生RNA在AAUAAA剪切信号处进行剪切，形成多个从转录的3＇端算起的核苷酸上游片段，在新的3＇端上进行聚腺苷酰化作用，一连串的腺苷连接上去。 3.4 mRNA的稳定性

决定mRNA降解速率的序列位于3＇端非翻译区和mRNA编码区之间。酵母中的不稳定性能大大降低外源蛋白的表达量，所以，在需要表达的外源基因编码序列的下游有必要克隆一个有效的酵母终止序列。

3.5 启始密码AUG的识别

启始密码AUG必须能容易被起始因子和核糖体准确识别才能达到高效翻译。有研究证明，启始密码AUG附近序列决定翻译启动的效率。 3.6 多肽链的延长

外源基因携带有酵母很少使用的密码会减缓翻译过程。采用定点诱变操作，可利用酵母优先使用的密码取代酵母罕见使用的密码来增加外源基因的表达。 3.7 外源蛋白的折叠

许多外源蛋白在酵母细胞中得到高水平表达，并能进行正确折叠。 3.8 蛋白质的降解

真核细胞中多种蛋白质易降解，其原因是N端含易被泛素识别降解，故在翻译时N端都要接上蛋氨酸以防被降解。

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3.9 糖基化作用

糖基化作用有助于蛋白质的正确折叠，增强它们对蛋白酶的抗性。酵母细胞中的糖基化只会添加富含甘露糖的寡糖。使糖化蛋白的糖基处于合适位置的对于蛋白质的活性是至关重要的。糖基有助于处于血液循环中的蛋白折叠和保持稳定。不象哺乳动物的细胞，酵母似乎更能精确的产生单一的糖蛋白。研究人员的这一发现为制药工业大量生产蛋白类药物提供了强有力的工具。它能被广泛用于生产治疗诸如癌症、血友病、肾病和多发性硬化等病的蛋白类药物。这些酵母生产的蛋白的均一性和纯度上达到了空前的程度。

图3 正在ER中合成蛋白质的N-连接糖基化

4.外源基因的表达及产物分泌

与细菌宿主相比，酵母分泌外源基因产物到培养基中具有很多方面的优势，如产物纯化简单、

蛋白质分子可通过二硫键形成稳定的结构、可经过内质网和高尔基体发生糖基化作用、激素前体经过蛋白酶加工可能会转化为成熟产物等。

虽然采用酵母分泌系统存在产量低的特点，但通过从带有分泌质粒并发生突变的酵母细胞中筛选，可得到分泌性能强的突变株。

5.总结

酿酒酵母和其他酵母在利用重组DNA生产外源蛋白，尤其是动物蛋白方面，具有很大的发展潜力。外源基因在酵母中表达的主要优点有：外源蛋白在酵母细胞中出现错误折叠的可能性比细菌小；酵母细胞中的蛋白质能发生糖基化；有些蛋白质在酵母细胞中表达时在氨基末端还会发生酰基化，有助于防止在细胞内合成的蛋白质被蛋白酶水解。

6.讨论

酵母对外源基因的表达水平受很多因素的影响，在基因水平上，提高和控制外源基因的转录水

平是提高表达水平的有效方法之一，所以筛选高效启动子就十分重要；另外，表达载体在细胞中的拷贝数和稳定性对外源基因在酵母中的表达有明显影响。在蛋白水平，要考虑表达产物的可靠性问题，其中包括外源基因在表达系统中的遗传稳定性、不同生物来源的基因在酵母中表达后加工和修饰的情况。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/pziw.html